本發(fā)明涉及檢驗檢疫領(lǐng)域，更特別地，生物標志物在鑒定檢疫性實蠅有效冷處理中的應用及鑒定方法。

背景技術(shù)：

隨著全球經(jīng)濟一體化進程的深入，國際貿(mào)易日趨頻繁和多樣化，導致外來有害生物入侵頻率加大，對生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成巨大的潛在威脅。中國是水果進出口大國，如何有效防范有害生物的跨境傳播，確保我國農(nóng)業(yè)、林業(yè)及生態(tài)安全，提高我國出口水果產(chǎn)品質(zhì)量，已經(jīng)成為我國出入境檢疫部門關(guān)注的重點之一。

水果能夠傳帶多種危險性外來有害生物，特別是地中海實蠅、番石榴實蠅、木瓜實蠅等水果產(chǎn)業(yè)的毀滅性檢疫有害生物，寄主范圍極廣，幾乎包含所有經(jīng)濟類水果，繁殖力和適應性強，其卵、幼蟲、蛹都可隨寄主類果實、包裝物及運輸工具進行遠距離傳播。一旦傳入就有暴發(fā)成災的可能，其結(jié)果不僅釀成重大經(jīng)濟損失，而且對新侵入地區(qū)的果蔬種植業(yè)構(gòu)成嚴重威脅。為了防止外來生物入侵并滿足口岸快速通關(guān)的需要，一般的做法只能在入境口岸實施溴甲烷熏蒸處理。但溴甲烷作為臭氧層消耗物質(zhì)，雖然檢疫用途的溴甲烷消費屬于《蒙特利爾議定書》的豁免范圍，但是近年來，國際社會要求包括檢疫中使用的溴甲烷都應加速淘汰的呼聲越來越高，歐盟已于2010年全面禁止了所有用途的溴甲烷使用。目前較為廣泛的檢疫處理方法為冷處理。

然而，有些攜帶有害生物的水果不經(jīng)冷處理，就試圖進入我國市場。還有些進行過冷處理后，幼蟲不會立刻死亡，甚至有些幼蟲會通過滯育度過脅迫階段。目前對于昆蟲是否進行檢疫處理鑒定的技術(shù)還處于空白階段，主要還局限在實驗室飼養(yǎng)觀察的方法，須經(jīng)實驗室培養(yǎng)后才能判讀是否進行過冷處理，或者判斷處理是否有效，但這么做耗時較長(一般需一周以上)，影響入境貨物的通關(guān)速度。所以，快速判別幼蟲是否進行冷處理，較好地防范了外來有害生物的入侵，對保障我國生物安全有重要的理論意義和實用價值。因此，需要一種快速可靠的方法來鑒定待檢疫的貨物是否進行過有效的冷處理。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于代謝組學技術(shù)，依靠現(xiàn)代化學計量學和計算機模型系統(tǒng)，處理分析不同處理的昆蟲體內(nèi)的代謝物質(zhì)，提取出有用的特征，從而達到靈敏、準確、高效識別昆蟲幼蟲處理有效性的目的，為檢驗檢疫決策做出有力的技術(shù)支持。

基于此，本發(fā)明提供了生物標志物在鑒定檢疫性實蠅有效冷處理中的應用。

優(yōu)選地，所述生物標志物為α-羥基戊二酸或焦棓酸。

本發(fā)明還提供了一種鑒定檢疫性實蠅有效冷處理的方法，其包括以下步驟：

S1：從待檢疫的檢疫性實蠅樣品提取總代謝物，檢測所述總代謝物中生物標志物的含量；

S2：將所述待檢疫的檢疫性實蠅樣品的總代謝物中的生物標志物的含量與對照數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學比較，如果比較結(jié)果為差異顯著，并且所述生物標志物含量滿足閾值時，則判定所述待檢疫的檢疫性實蠅進行了有效冷處理。

進一步地，所述生物標志物的含量通過GC/MS檢測得到。

進一步地，S1包括以下步驟：

S1.1：提取總代謝物，得到總代謝物提取液；

S1.2：向所述總代謝物提取液中添加內(nèi)標；

S1.3：吹干，加入甲基化試劑進行甲基化；

S1.4：加入烷基化試劑進行烷基化；

S1.5：進行GC/MS檢測

S1.6：通過數(shù)據(jù)分析得到所述生物標志的含量。

優(yōu)選地，所述內(nèi)標為半乳糖醇。

進一步地，所述對照數(shù)據(jù)為未經(jīng)冷處理的檢疫性實蠅的總代謝物中的生物標志物含量。

進一步地，S3中所述統(tǒng)計學比較為t檢驗，當t檢驗結(jié)果為P值小于0.05(即，差異顯著)，并且待待檢疫的檢疫性實蠅的總代謝物中的生物標志物含量與未經(jīng)冷處理的檢疫性實蠅的總代謝物中的生物標志物含量的比值的Log₂對數(shù)大于1或小于-1(即，含量達到閾值)時，判定所述待檢疫的檢疫性實蠅進行了有效冷處理。

優(yōu)選地，在進行t檢驗后，還進行受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC曲線)繪制，當ROC曲線的曲線下面積大于0.9時，表示所述判定的準確性高。

優(yōu)選地，所述生物標志物為α-羥基戊二酸或焦棓酸。

本發(fā)明通過代謝組學分析技術(shù)篩選出用于檢疫處理(特別是檢疫冷處理有效性的判別中)的生物標志物，通過本發(fā)明對檢疫性實蠅幼蟲進行快速、高通量篩查，靈敏度和準確度高，縮短了檢疫處理觀察期判別的時間，大大降低了檢疫處理實驗驗證的成本，為保障我國水果進出口貿(mào)易順利進行，提升我國生物安全，具有重要的經(jīng)濟和社會效益。

附圖說明

圖1為對照組和冷處理組的總離子流(TIC)色譜圖；

圖2為對照組與冷處理組PLS-DA得分圖；

圖3為冷處理組與對照組OPLS-DA得分圖。

具體實施方式

1.檢疫性實蠅幼蟲冷處理

將實蠅幼蟲裸蟲放入含有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于0℃的控溫箱中，保持6h。對照組幼蟲為裸蟲，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，通過溫度記錄儀監(jiān)測對照組和處理組的環(huán)境溫度。然后用液氮將經(jīng)冷處理的實蠅幼蟲和對照組幼蟲用液氮速凍，并儲存于-80℃。

2.樣本的代謝組前處理

取-80℃儲存的實蠅幼蟲(3齡，10頭，總重約160mg)，加入200μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，置入組織破碎儀(TissueLyser II)破碎(30Hz，2min)；取出，加入800μL提取液(氯仿:甲醇:水＝2:5:2)，渦漩震蕩30s，4℃放置20min，冷凍離心(4℃，16000g，15min)，取800μL上清液轉(zhuǎn)入一新的EP管中；向殘渣加入1mL色譜級甲醇，渦漩震蕩30s，4℃放置20min，冷凍離心(4℃，16000g，15min)，取上清液1mL，與第1次的上清液混合；

取100μL提取液加入玻璃衍生小瓶，加入20μl內(nèi)標水溶液(dulicitol,100ng/μL)，混合，氮氣吹干，加入40μL的20mg/mL鹽酸甲氧胺吡啶溶液，37℃震蕩反應90min；加入40μL的BSTFA(含1％TMCS)的衍生試劑，70℃反應60min；取出衍生后的樣本，室溫放置30min，進行GC/MS代謝組學分析。

3.檢疫性實蠅幼蟲代謝組GC/MS分析

采用Agilent 7890A GC/5975C MS系統(tǒng)，毛細管色譜柱為Agilent J&W Scientific公司的HP-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)。

儀器參數(shù)設定為：進樣口溫度280℃，EI離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，高純氦氣(純度大于99.999％)作為載氣，不分流進樣，進樣量1.0μL。升溫程序為：初始溫度60℃，維持2min，10℃/min的速度升至140℃，然后以4℃/min的速度升至240℃，最后以15℃/min的速度升至300℃，并維持8min。采用全掃描模式進行質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜檢測范圍為50-600(m/z)。采用隨機順序進行連續(xù)樣本分析，避免因儀器信號波動而造成的影響，得到的質(zhì)譜圖如圖1所示。

4.數(shù)據(jù)處理

應用R軟件進行數(shù)據(jù)預處理，包括基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和質(zhì)譜碎片歸屬分析，最后在EXCEL2007軟件中進行后期編輯，包括來自于柱流失和樣本制備造成的雜質(zhì)峰的剔除和定量離子選擇等，將最終結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量(rt_mz，即保留時間_質(zhì)荷比)、觀察量(樣本)和積分面積。然后將所有數(shù)據(jù)歸一化到內(nèi)標峰(即峰面積除以內(nèi)標峰面積)。將編輯后的數(shù)據(jù)矩陣導入Simca-P軟件(版本11.0)分別進行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)。

5.偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)

采用PLS-DA這種監(jiān)督的多維統(tǒng)計分析方法對對照和冷處理兩組樣本進行模型分析。共獲得2個主成分，累積R²Y＝0.991，Q²＝0.906，得分圖如圖2所示(橫坐標為第1主成分得分，用t[1]表示，R²Y＝0.935；縱坐標為第2主成分得分，用t[2]表示，R²Y＝0.0561))。模型解釋率(R²Y)和模型預測率均接近于1(最高值為1)，說明PLS-DA模型可以非常好地解釋兩組樣本之間的差異，而且當前模型的預測率也非常高，是對未知樣本進行預測的理想數(shù)學模型。圖2表明對照組和冷處理組之間在得分圖上具有顯著的代謝譜分離，兩組樣本分別處于第1主成分(即t[1])的正負兩側(cè)，因此兩組樣本之間具有顯著的代謝差異。

6.正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)

采用正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)過濾與模型分類不相關(guān)信號即正交信號，建立可靠的OPLS-DA模型。模型質(zhì)量參數(shù)為：1個主成分(R²Y＝0.935)和1個正交成分(R²Y＝0.0561)，累積R²Y＝0.991，Q²＝0.867，說明模型質(zhì)量非常好。OPLS-DA得分圖如圖3所示。過濾掉與分類不相關(guān)的噪音信號后，兩組樣本在PC1(即t[1]P)上具有很好的代謝譜分離，即兩組樣本分別處于主成分(PC1，即t[1]P)的正負兩側(cè)。對照組內(nèi)的變異性顯著大于冷處理組，表現(xiàn)為對照組內(nèi)具有各樣本之間具有更大的離散性。

7.差異性代謝物及其結(jié)構(gòu)鑒定

由于過濾掉了不相關(guān)的正交信號，因而獲得的差異性代謝物更加可靠。采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP(Variable Importance in the Projection)值(閾值>1)，并結(jié)合t檢驗(t-test)的p值(閾值0.05)來尋找差異性表達代謝物。差異性代謝物的定性方法為：搜索NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫(比較質(zhì)譜和色譜保留時間RT或保留指數(shù)RI)，以及采用標準物質(zhì)數(shù)據(jù)比對確定。

因此，該發(fā)明方法可以將冷處理組與對照組之間的差異性分開，靈敏度和特異性高，代謝物達到41個，其中23個代謝物下降，18個代謝物上升(表2)，確認了冷處理組和對照組的代謝差異，可用于檢疫性實蠅幼蟲冷處理有效性檢測。在以后的檢測中，只需要針對表2中的這41個代謝物進行以上代謝組學檢測以及PLS-DA和OPLS-DA分析即可。

表2.冷處理組與對照組之間的差異性代謝物

*冷處理組與對照組均值之比的對數(shù)值(以2為底)，正號表示冷處理組相對于對照組上升，負號表示下降。

在以上方案的基礎上，發(fā)明人從這41種差異性代謝物之中進一步篩選出能夠代表有效冷處理的生物標志物，以在保證檢測準確性的基礎上，更進一步地簡化檢測程序。

8.代謝組學GC-MS分析后物質(zhì)峰值鑒別冷處理的ROC曲線分析及生物標志物質(zhì)鑒定

根據(jù)代謝組學檢測結(jié)果，冷處理的診斷采用t-test檢測，篩選對照與冷處理組間有顯著差異(P＜0.05)，以Log₂為底，折疊倍數(shù)(Fold change)大于1的代謝物。同時，以(1-特異性)為橫坐標，敏感度為縱坐標繪制ROC曲線。ROC曲線分析將某試驗的靈敏度及特異性聯(lián)系起來，是一種全面的、科學的評價檢測項目的方法。曲線下面積(AUC)越大，診斷的價值越大，AUC接近0.5時，無診斷意義；AUC＜0.7，表示診斷準確率較低；AUC在0.7-0.9，表示診斷準確性中等；AUC＞0.9時，表示診斷有較高的準確性。

如表3所示，冷處理組中，代謝物質(zhì)α-羥基戊二酸(alpha-hydroxyglutaric acid)和焦棓酸(pyrogallol)經(jīng)過ROC分析后AUC分別為1.00和0.97，且t-test檢驗P值＜0.5，Log₂的折疊倍數(shù)分別為-1.15和1.13。該兩種物質(zhì)冷處理的生物標志物。因此，判別是否進行冷處理，且冷處理是否有效，需要對比待檢測組與對照組α-羥基戊二酸和焦棓酸是否有顯著差異，且該兩種物質(zhì)的峰面積或物質(zhì)濃度的Log₂的折疊倍數(shù)是否＞1。

表3 ROC曲線分析鑒別的冷處理生物標志物質(zhì)

因此，以后可僅檢測羥基戊二酸和焦棓酸的含量，并通過t檢驗、ROC曲線峰面積，以及Log₂折疊倍數(shù)來判斷。當t檢驗結(jié)果P＜0.05，為差異顯著，ROC曲線的AUC>0.7，Log₂折疊倍數(shù)大于1或小于-1時，判定樣品經(jīng)歷了有效冷處理。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。