本發(fā)明涉及用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底及其制備方法。

背景技術(shù)：

表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)是一種能夠使分析物分子的拉曼信號得到有力增強(qiáng)的技術(shù)。SERS具有高靈敏性，高選擇性，高準(zhǔn)確性，快速、無損檢測的優(yōu)點(diǎn)。目前，SERS技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境催化、化學(xué)和生物傳感器、表面科學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域。

恩諾沙星作為喹諾酮類藥物的成員，因?yàn)樗哂心苡行Э刂坪蜌⑺绖?dòng)物細(xì)菌的能力而受到人們的廣泛關(guān)注。但這也導(dǎo)致了恩諾沙星這種抗生素的濫用現(xiàn)象變得越來越嚴(yán)重。為了保障人們的健康，許多國家都已經(jīng)設(shè)置了一系列的標(biāo)準(zhǔn)來控制恩諾沙星殘留量。歐盟也制定了恩諾沙星在食品中的最大殘留量是100μgkg^-1(在甲醇溶液中相當(dāng)于2.20×10^-7M)。現(xiàn)有技術(shù)中常采用銀金屬納米粒子、有機(jī)物作為表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底。如《拉曼光譜雜志》(Journal of Raman Spectroscopy)的第41卷第7期739–744頁的文章《表面增強(qiáng)拉曼光譜法結(jié)合樹枝狀銀納米粒子檢測抗生素》(Surface-enhanced Raman spectroscopy coupled with dendritic silver nanosubstrate for detection of restricted antibiotics)公開了一種樹枝狀銀納米粒子作為SERS基底對三種抗生素(恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素)進(jìn)行快速檢測，檢測限達(dá)到ppb級。該方法雖然很好地檢測了藥物分子，但是采用原料成本較高，操作較復(fù)雜?！妒称贩治龇椒ā?Food Analytical Methods)在2014年第7卷第6期的1219-1228頁公開的文章《使用氨基修飾的甲基丙烯酸縮水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯多孔粉末材料利用表面增強(qiáng)拉曼光譜對雞肉中的恩諾沙星進(jìn)行超靈敏檢測》(Ultrasensitive Detection of Enrofloxacin in Chicken Muscles by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Using Amino-Modified Glycidyl Methacrylate-Ethylene Dimethacrylate(GMA-EDMA)Powdered Porous Material)，該文中以氨基修飾的GMA-EDMA作為SERS基底，對雞肉中恩諾沙星殘留量進(jìn)行微量快速檢測，最低的檢測濃度可以達(dá)到0.01mgkg^-1。該方法采用原料成本較高，并且有毒有害易燃，有著較大的危險(xiǎn)性。半導(dǎo)體TiO₂作為一種新型的SERS基底具有良好的生物相容性和耐酸耐堿性好等特點(diǎn)，但是它的SERS活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于金屬材料，特別是貴金屬材料，這也極大的限制了TiO₂的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的貴金屬活性基底成本高及操作復(fù)雜、有機(jī)物基底危險(xiǎn)性大的技術(shù)問題，而提供用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的一種新型TiO₂活性基底及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底為摻雜鎳和鋅的二氧化鈦，其中鎳與鈦的摩爾比為(0.5～1.5):100，鋅與鈦的摩爾比為(0.5～1.5):100。

本發(fā)明的用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、將鈦酸四丁酯加入到無水乙醇中攪拌均勻，得到溶液A；

二、將硝酸鋅、硝酸鎳、無水乙醇、水和濃硝酸混合，攪拌均勻，得到溶液B；

三、在攪拌條件下，將溶液A滴加到溶液B中水解，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌2～5h，得到透明溶膠；

四、將步驟三制得的溶膠轉(zhuǎn)移至水熱釜中，放入烘箱中，在溫度為160～180℃的條件下水熱反應(yīng)6～8h，自然冷卻至室溫，倒掉廢液后，將產(chǎn)物干燥，得到前驅(qū)物；

五、將前驅(qū)物放入研缽中研磨成粉末，然后在450～470℃的條件下焙燒2～3h，得到用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底。

用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底的應(yīng)用是將該活性基底用于檢測恩諾沙星，具體的應(yīng)用方法如下：

將本發(fā)明的活性基底分散到含恩諾沙星待測樣品的甲醇溶液中，再調(diào)節(jié)溶液的pH為6～7.2，攪拌5～11h；然后離心分離出固相物，再用甲醇洗滌，干燥后，得到恩諾沙星分子表面修飾的活性基底，再進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜法測試。

利用本發(fā)明的活性基底，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，通過表面增強(qiáng)拉曼光譜法可對恩諾沙星進(jìn)行定量測定。

本發(fā)明采用雙金屬鎳和鋅摻雜二氧化鈦，調(diào)控TiO₂的表面態(tài)(缺陷)能級和金屬摻雜能級，制備出一種能級可調(diào)控的高性能TiO₂SERS活性基底，該活性基底的活性比TiO₂基底大大提高，可對恩諾沙星(ENR)藥物分子進(jìn)行SERS檢測，實(shí)現(xiàn)了采用半導(dǎo)體TiO₂作為SERS基底對恩諾沙星藥物檢測的實(shí)際應(yīng)用。

本發(fā)明采用的SERS基底制備方法簡單，原料成本低，無毒無害，環(huán)境友好，而且具有良好的SERS增強(qiáng)能力，并且能有效的對恩諾沙星藥物分子進(jìn)行檢測，檢測限低至1×10-⁹M，能夠達(dá)到歐盟標(biāo)準(zhǔn)，推進(jìn)了SERS技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展。

附圖說明

圖1是試驗(yàn)1中純的銳鈦礦相TiO₂納米粒子和雙金屬摻雜的TiO₂納米粒子的XRD譜圖；

圖2是試驗(yàn)1中吸附在未摻雜和不同金屬摻雜TiO₂(Zn-TiO₂、Ni-TiO₂和Ni-Zn-TiO₂)納米粒子上ENR藥物分子的SERS光譜圖；

圖3是不同攪拌時(shí)間條件下吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子上ENR藥物分子的SERS光譜圖；

圖4是不同的pH值條件下吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子上ENR藥物分子的SERS光譜圖

圖5是不同的ENR濃度條件下吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子上ENR藥物分子的SERS光譜圖

圖6是ENR濃度及SERS信號強(qiáng)度之間的定量關(guān)系曲線圖。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底為摻雜鎳和鋅的二氧化鈦，其中鎳與鈦的摩爾比為(0.5～1.5):100，鋅與鈦的摩爾比為(0.5～1.5):100。

具體實(shí)施方式二：具體實(shí)施方式一所述的用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、將鈦酸四丁酯加入到無水乙醇中攪拌均勻，得到溶液A；

二、將硝酸鋅、硝酸鎳、無水乙醇、水和濃硝酸混合，攪拌均勻，得到溶液B；

三、在攪拌條件下，將溶液A滴加到溶液B中水解，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌2～5h，得到透明溶膠；

四、將步驟三制得的溶膠轉(zhuǎn)移至水熱釜中，放入烘箱中，在溫度為160～180℃的條件下水熱反應(yīng)6～8h，自然冷卻至室溫，倒掉廢液后，將產(chǎn)物干燥，得到前驅(qū)物；

五、將前驅(qū)物放入研缽中研磨成粉末，然后在450～470℃的條件下焙燒2～3h，得到用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底；

其中步驟二中硝酸鋅與步驟一中鈦酸四丁酯的摩爾比為(0.5～1.5):100；步驟二中硝酸鎳與步驟一中鈦酸四丁酯的摩爾比為(0.5～1.5):100。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二不同的是步驟一中鈦酸四丁酯與無水乙醇的體積比為1:1；步驟二中無水乙醇、水和濃硝酸與步驟一中鈦酸四丁酯的體積比為4:1:0.2:1；其中濃硝酸的質(zhì)量百分濃度為63％～66％。其它與具體實(shí)施方式二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二或三不同的是步驟四中，水熱反應(yīng)的溫度為160℃，反應(yīng)時(shí)間為6h。其它與具體實(shí)施方式二或三相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二至四之一不同的是步驟五中，焙燒溫度為450℃，焙燒時(shí)間為2h。其它與具體實(shí)施方式二至四之一相同。

具體實(shí)施方式六：具體實(shí)施方式一所述的用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底的應(yīng)用是將該活性基底用于檢測恩諾沙星，具體的應(yīng)用方法如下：

將本發(fā)明的活性基底分散到含恩諾沙星待測樣品的甲醇溶液中，再調(diào)節(jié)溶液的pH為6～7.2，攪拌5～11h；然后離心分離出固相物，再用甲醇洗滌，干燥后，得到恩諾沙星分子表面修飾的活性基底，再進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜法測試。

具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式六不同的是pH為7.04。其它與具體實(shí)施方式六相同。

具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式六或七不同的是攪拌時(shí)間為7小時(shí)。其它與具體實(shí)施方式六或七相同。

用以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：

試驗(yàn)1：本試驗(yàn)的用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、將15mL鈦酸四丁酯加入到15mL無水乙醇中攪拌5min至均勻，得到溶液A；

二、將a克硝酸鋅、b克硝酸鎳、60mL無水乙醇、15mL水和3mL質(zhì)量百分濃度為63％的濃硝酸混合，攪拌均勻，得到溶液B；

三、在攪拌條件下，將溶液A以滴加速度2～3秒1滴的速度滴加到溶液B中水解，滴加結(jié)束后，繼續(xù)攪拌2h，得到淡黃色透明溶膠；

四、將步驟三制得的溶膠轉(zhuǎn)移至水熱釜中，放入烘箱中，在溫度為160℃的條件下水熱反應(yīng)6h，自然冷卻至室溫，倒掉廢液后，將產(chǎn)物均勻分散到表面皿中，再把表面皿放入烘箱中在80℃下干燥8h，得到前驅(qū)物；

五、將前驅(qū)物放入研缽中研磨成粉末，然后在450℃的條件下焙燒2h，得到用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測恩諾沙星的活性基底。

其中步驟二中的a、b的取值及對應(yīng)的活性基底如下表1

本試驗(yàn)第一組得到的是純的銳鈦礦相TiO₂納米粒子，第二組得到的是只摻雜鋅的TiO₂納米粒子，第三組得到的是只摻雜鎳的TiO₂納米粒子，第四至第七組得到的是雙金屬摻雜的TiO₂納米粒子。

本試驗(yàn)第一組得到的純銳鈦礦相TiO₂納米粒子和第四至第七組得到的雙金屬摻雜的TiO₂納米粒子的XRD譜圖如圖1所示，從圖1可以看出，雙金屬摻雜的TiO₂納米粒子的衍射峰向高角度偏移，這主要?dú)w因于摻雜的鎳離子不同程度地進(jìn)入到了TiO₂的晶格取代了Ti離子，導(dǎo)致了TiO₂的晶格畸變，相應(yīng)的衍射峰發(fā)生了位移。

將20mg第一至第七組的活性基底分別分散到10mL濃度為1×10^-3M的恩諾沙星的甲醇溶液(稱取35.9mg的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容于100mL容量瓶制得的)中，攪拌均勻，此時(shí)該溶液的pH值為7.04，室溫下磁力攪拌7h。然后，將混合物放入離心機(jī)以9500轉(zhuǎn)/秒速度離心10分鐘，之后用甲醇洗滌后再離心。固相物自然干燥后，即得到恩諾沙星分子表面修飾的TiO₂納米粒子。

采用英國雷尼紹公司Renishaw 1000model型共聚焦顯微拉曼光譜儀測量拉曼光譜，激發(fā)光源的波長為532nm。得到的吸附在未摻雜和不同金屬摻雜TiO₂(Zn-TiO₂、Ni-TiO₂和Ni-Zn-TiO₂)納米粒子上ENR藥物分子的SERS光譜圖如圖2所示。從圖2可以看出，ENR吸附在不同基底上的增強(qiáng)程度不同，與第一組的純的銳鈦礦相TiO₂納米粒子基底相比，吸附在第二組的單純摻雜鋅的TiO₂納米粒子、第三組的單純摻雜鎳的TiO₂納米粒子基底上的藥物分子都表現(xiàn)出較強(qiáng)的SERS增強(qiáng)，活性都比純TiO₂有所提高，但提高的輻度不大，僅為100％～130％。ENR藥物分子吸附在第四至第六組制備的雙金屬摻雜的TiO₂納米粒子上表現(xiàn)出很大的SERS增強(qiáng)，可知，在摻雜量較小時(shí)(鎳、鋅的摻雜量分別小于1.5％時(shí))，雙金屬摻雜大大提高了基底的活性；當(dāng)鎳、鋅的摻雜量分別達(dá)到2％時(shí)，活性反而降低。這表明，適量的雙金屬(Zn²⁺和Ni²⁺)摻雜可以更好地提高TiO₂納米粒子的SERS增強(qiáng)效果。

這是由于適量的Zn²⁺摻雜可以增加二氧化鈦納米粒子的表面缺陷(表面態(tài)能級)，從而提高藥物分子的SERS信號。通過金屬摻雜引起的表面缺陷的增加促進(jìn)了半導(dǎo)體到藥物分子的電荷轉(zhuǎn)移過程。而適量Ni²⁺摻雜可以進(jìn)入TiO₂晶格取代Ti⁴⁺離子，它可以在TiO₂的帶隙間嵌入一個(gè)豐富的金屬摻雜能級，進(jìn)而促進(jìn)了半導(dǎo)體到藥物分子的電荷轉(zhuǎn)移過程和SERS增強(qiáng)效應(yīng)。因此，豐富的表面態(tài)(缺陷)和金屬摻雜能級都有利于半導(dǎo)體到藥物分子的電荷轉(zhuǎn)移過程。采用Zn和Ni雙金屬摻雜TiO₂，控制金屬的摻雜量從而調(diào)控表面態(tài)(缺陷)能級和金屬摻雜能級，使二者同時(shí)貢獻(xiàn)于TiO₂到藥物分子的電荷轉(zhuǎn)移過程，得到了更強(qiáng)的藥物分子的SERS信號。

以本試驗(yàn)第五組制備的1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子做為活性基底，改變吸附時(shí)間，考察不同吸附時(shí)間對吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子上恩諾沙星SERS增強(qiáng)的影響。具體步驟是：將20mg 1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子活性基底分散到10mL濃度為1×10^-3M的恩諾沙星的甲醇溶液(稱取35.9mg的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容于100mL容量瓶制得的)中，攪拌均勻，此時(shí)該溶液的pH值為7.04。上述樣品配制六份，室溫下分別磁力攪拌1、3、5、7、9和11h。然后，將混合物放入離心機(jī)以9500轉(zhuǎn)/秒速度離心10分鐘，之后用甲醇洗滌后再離心。固相物自然干燥后，即得到恩諾沙星分子表面修飾的TiO₂納米粒子。采用英國雷尼紹公司Renishaw 1000model型共聚焦顯微拉曼光譜儀測量拉曼光譜，激發(fā)光源的波長為532nm。得到的吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子上ENR藥物分子的SERS光譜圖如圖3所示，從圖3可以清楚地看到，吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子基底上ENR藥物分子的SERS信號強(qiáng)度隨著吸附時(shí)間的增加明顯提高。這是因?yàn)殡S著吸附時(shí)間的增加，吸附在納米TiO₂上ENR藥物分子的數(shù)量也隨之增加。當(dāng)吸附時(shí)間為7、9和11h時(shí)，ENR藥物分子的SERS信號強(qiáng)度幾乎彼此相同。這表明，ENR分子吸附時(shí)間為7小時(shí)時(shí)在TiO₂表面的吸附量達(dá)到飽和狀態(tài)。

以本試驗(yàn)第五組制備的1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子做為活性基底，改變pH值，考察不同pH值對吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子上恩諾沙星SERS增強(qiáng)的影響。具體步驟是：將20mg 1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子活性基底分散到10mL濃度為1×10^-3M的恩諾沙星的甲醇溶液(稱取35.9mg的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容于100mL容量瓶制得的)中，攪拌均勻。上述樣品配制六份，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值分別為2.97、4.92、7.04、9.02和10.96，磁力攪拌7h。然后，將混合物放入離心機(jī)以9500轉(zhuǎn)/秒速度離心10分鐘，之后用甲醇洗滌后再離心。固相物自然干燥后，即得到恩諾沙星分子表面修飾的TiO₂納米粒子。采用英國雷尼紹公司Renishaw 1000model型共聚焦顯微拉曼光譜儀測量拉曼光譜，激發(fā)光源的波長為532nm。得到的吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子上ENR藥物分子的SERS光譜圖如圖4所示，從圖4可以清楚地看到，當(dāng)pH值為7.04時(shí)，ENR分子表現(xiàn)出最大的SERS增強(qiáng)。這是由于ENR是兩性化合物，它的pK_a1和pK_a2分別為5.88和7.74。因此，ENR離子狀態(tài)受溶液的pH值和ENR的解離常數(shù)(pKa)所控制。當(dāng)溶液pH值小于6時(shí)，ENR的存在形式主要是陽離子狀態(tài)(ENR⁺)。當(dāng)pH值為6～8時(shí)，ENR的存在形式主要是兩性離子狀態(tài)(ENR⁰)，這也導(dǎo)致了-COO^-基數(shù)目的增加。當(dāng)溶液pH值大于8時(shí)，ENR的存在形式主要是陰離子狀態(tài)(ENR^-)，ENR的SERS信號增強(qiáng)應(yīng)該隨著-COO^-基團(tuán)增加而增加。但TiO₂的等電點(diǎn)(PZC)范圍是5.9～7.2，因此當(dāng)溶液pH值大于7.2時(shí)，TiO₂表面帶負(fù)電荷將對吸附產(chǎn)生負(fù)面影響，不利于ENR在TiO₂表面的吸附。因此pH值為7.04時(shí)，ENR分子的SERS信號最強(qiáng)。

以本試驗(yàn)制備的1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子做為活性基底，改變恩諾沙星濃度，考察不同恩諾沙星濃度對吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子上恩諾沙星SERS增強(qiáng)的影響。具體步驟是：將20mg 1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子活性基底分別分散到10mL濃度為1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8、1×10^-9、1×10^-10M的恩諾沙星的甲醇溶液中，攪拌均勻，調(diào)節(jié)溶液的pH值分別為7.04，磁力攪拌7h。然后，將混合物放入離心機(jī)以9500轉(zhuǎn)/秒速度離心10分鐘，之后用甲醇洗滌后再離心。固相物自然干燥后，即得到恩諾沙星分子表面修飾的TiO₂納米粒子。采用英國雷尼紹公司Renishaw 1000model型共聚焦顯微拉曼光譜儀測量拉曼光譜，激發(fā)光源的波長為532nm。得到的吸附在1％Ni-1％Zn-TiO₂納米粒子上ENR藥物分子的SERS光譜圖如圖5所示，從圖5可以看出，拉曼信號強(qiáng)度會(huì)隨著ENR濃度減小而變?nèi)?。?dāng)ENR濃度低至10^-10M時(shí)，難以觀察到明顯的SERS信號。因此，10^-9M是本方法檢測ENR的最低濃度。而采用相同的方法測試的單金屬摻雜的TiO₂，如1％Zn-TiO₂和1％Ni-TiO₂檢測的ENR的最低濃度都為10^-7M，對比可知這種雙摻雜的能級可調(diào)控的TiO₂檢測恩諾沙星的最低濃度低于單金屬摻雜TiO₂，能更好地勝任ENR藥物檢測的工作。將ENR濃度及相對應(yīng)的SERS信號強(qiáng)度繪于圖中，可以看出ENR濃度和SERS信號強(qiáng)度之間的定量關(guān)系如圖6所示。從圖6可以看出，曲線在1×10^-4～1×10^-9M的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性方程可以表示為：y＝21473.66+2306.42C，相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)R²為0.991。通過該方法，檢測限(LOD)可達(dá)3×10^-10mol/L(對應(yīng)于3倍信噪比)。這表明該方法可以有效的檢測ENR藥物分子，并且有較低的檢測限可以達(dá)到歐盟標(biāo)準(zhǔn)。