本發(fā)明屬于細(xì)胞平鋪緩沖系統(tǒng)，特別涉及一種適用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)。

背景技術(shù)：

細(xì)胞是人體最重要，最基礎(chǔ)的組成部分，其狀態(tài)優(yōu)劣常與人體健康存在直接關(guān)系。常用來進(jìn)行細(xì)胞分析的儀器設(shè)備主要流式細(xì)胞儀、血細(xì)胞分析儀或熒光顯微鏡等。利用流式或血細(xì)胞檢測儀器進(jìn)行細(xì)胞分析的原理是依賴細(xì)胞自身的物理或化學(xué)特性(比如大小、折射率、形態(tài)等)的不同，細(xì)胞在分析前需要制備成懸液，分析過程中細(xì)胞需要在鞘液的配合下依次通過檢測單元，記錄每個(gè)細(xì)胞的參數(shù)后，進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)而用于疾病的檢測或健康評(píng)估。

顯微鏡是一種用于觀察生物微觀世界的重要工具，在生物健康領(lǐng)域其應(yīng)用十分廣泛，例如利用光學(xué)顯微鏡對(duì)染色后的血液進(jìn)行觀察可用于疾病的診斷、使用激光光聚焦掃描顯微鏡可以對(duì)病變細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物的有無以及含量進(jìn)行測定、利用STED顯微鏡可以對(duì)細(xì)胞表面納米級(jí)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像觀測等。

顯微鏡的應(yīng)用十分廣泛，其應(yīng)用時(shí)的測試對(duì)象需要為一個(gè)平面載體，一般為載玻片，或者形狀類似載玻片的平面結(jié)構(gòu)。使用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞分析時(shí)常需要將細(xì)胞平鋪在平面載體上，保持細(xì)胞的固定狀態(tài)，才能用于進(jìn)一步的觀察。例如在使用顯微鏡對(duì)血涂片進(jìn)行觀察前，需要制備具有單層細(xì)胞分布的血涂片，進(jìn)入血涂片干燥形成血膜后才能使用瑞特染色液等進(jìn)行染色，染色也相對(duì)復(fù)雜需要經(jīng)過幾次加染料、沖洗和再加染料再?zèng)_洗的過程。而最終觀察的具有單層細(xì)胞分布的區(qū)域其大小只占血膜的很小部分，由于細(xì)胞的重疊其它部分無法觀察，其獲得的生物信息也相對(duì)有限。眾所周知，對(duì)于統(tǒng)計(jì)分析獲得的結(jié)果而言，其樣本量越大結(jié)果也越準(zhǔn)確。因此，如果能夠減少重疊細(xì)胞，形成更多便于觀察的的單層細(xì)胞，對(duì)檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性而言將大大提升。

在制備單層細(xì)胞時(shí)過程中需要從多個(gè)方面綜合考慮才能制備出適合于顯微觀察的優(yōu)質(zhì)玻片。例如細(xì)胞所處的緩沖液離子條件(即人工基質(zhì))，可直接影響細(xì)胞形態(tài)，不佳的緩沖液甚至可以導(dǎo)致細(xì)胞破碎從而無法觀察；又例如細(xì)胞在緩沖液中的固定程度，如果細(xì)胞漂浮在緩沖液中，往往使自動(dòng)化圖像觀察變得十分困難，影響成像效果；再例如細(xì)胞所處的緩沖液干燥后的結(jié)晶狀況，由于單層細(xì)胞的所形成膜十分薄，可在幾分鐘內(nèi)干燥，隨之伴隨的是大量結(jié)晶鹽的析出，對(duì)后期觀察尤其是熒光成像效果的觀察將產(chǎn)生極大影響等等。

由于上述問題的存在，制備一種可用于細(xì)胞單層分布平鋪的緩沖液人工基質(zhì)顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的細(xì)胞易聚團(tuán)、易結(jié)晶以及細(xì)胞形態(tài)易改變甚至破裂等問題，本案的目的在于提供一種適用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，來有效避免細(xì)胞聚團(tuán)、結(jié)晶，保護(hù)細(xì)胞形態(tài)，利于后續(xù)觀察和結(jié)果判讀。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本案通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其至少包括有緩沖基液、牛血清白蛋白、糖源、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和明膠；

其中，所述緩沖基液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液和NaCl水溶液中的一種；

所述糖源選自蔗糖、海藻糖、甘露糖或其組合。

優(yōu)選的是，所述的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，所述牛血清白蛋白的濃度為1-8％。

優(yōu)選的是，所述的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，所述糖源的濃度為0.2-2％。

優(yōu)選的是，所述的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，所述聚乙二醇的濃度為0.1-2％。

優(yōu)選的是，所述的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，所述聚乙烯吡咯烷酮的濃度為0.2-2％。

優(yōu)選的是，所述的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，所述明膠的濃度為0.5-5％。

優(yōu)選的是，所述的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其中，所述PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液和硼酸鹽緩沖液的濃度為0.01M；所述NaCl水溶液的濃度為0.85wt％。

優(yōu)選的是，所述的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其中，所述緩沖基液的pH為7.2-7.4。

優(yōu)選的是，所述的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其中，所述人工基質(zhì)中還包括有醋酸鋅和硫酸鎂。

優(yōu)選的是，所述的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，所述醋酸鋅的濃度為0.02-0.04％，所述硫酸鎂的濃度為0.02-0.04％。

本發(fā)明的有益效果是：本案通過對(duì)現(xiàn)有人工基質(zhì)緩沖液的配方改進(jìn)，可以使血液中的細(xì)胞或者實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞在經(jīng)過預(yù)處理(如染色液或熒光標(biāo)記處理)后，在加入本案人工基質(zhì)后，可以更好實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在載玻片或類似的載玻片平面結(jié)構(gòu)的單層平鋪，以利于光學(xué)顯微鏡或者熒光顯微鏡(預(yù)期為自動(dòng)化掃描判讀裝置)進(jìn)行觀察，提高檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1為本案實(shí)施例1的光學(xué)顯微鏡圖。

圖2為本案實(shí)施例3的光學(xué)顯微鏡圖。

圖3為本案對(duì)比例1的光學(xué)顯微鏡圖。

圖4為本案對(duì)比例2的光學(xué)顯微鏡圖。

圖5為本案對(duì)比例3的光學(xué)顯微鏡圖。

圖6為本案對(duì)比例4的光學(xué)顯微鏡圖。

光學(xué)顯微鏡：ZEISS；型號(hào)：Lab A1；放大倍數(shù)：物鏡40倍,目鏡10倍。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

本案列出一實(shí)施例的用于單層細(xì)胞平鋪的人工基質(zhì)，其至少包括有緩沖基液、牛血清白蛋白(BSA)、糖源、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和明膠；

其中，緩沖基液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液和NaCl水溶液中的一種；

糖源選自蔗糖、海藻糖、甘露糖或其組合。

緩沖基液的作用是維持細(xì)胞滲透壓，保持細(xì)胞狀態(tài)，防止細(xì)胞破裂。其中，NaCl水溶液對(duì)血液中固有細(xì)胞(如紅細(xì)胞、白細(xì)胞)的平鋪制備效果最好；PBS、Tris-HCl、硼酸鹽緩沖液對(duì)人工培養(yǎng)細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)或者人血液稀有細(xì)胞的平鋪制備效果最好。

牛血清白蛋白、糖源、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和明膠的作用是增加細(xì)胞與玻片粘性，有助于單層細(xì)胞形成，利于細(xì)胞平鋪和細(xì)胞分散，保持細(xì)胞表面的抗原活性，減少細(xì)胞聚集，防止結(jié)晶。

其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，牛血清白蛋白的濃度優(yōu)選為1-8％。

其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，糖源的濃度優(yōu)選為0.2-2％。

其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，聚乙二醇的濃度優(yōu)選為0.1-2％。

其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，聚乙烯吡咯烷酮的濃度優(yōu)選為0.2-2％。

其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，明膠的濃度優(yōu)選為0.5-5％。

其中，PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液和硼酸鹽緩沖液的濃度優(yōu)選為0.01M；NaCl水溶液的濃度優(yōu)選為0.85wt％。

其中，緩沖基液的pH為7.2-7.4。

作為本案另一實(shí)施例，其中，人工基質(zhì)中還可優(yōu)選包括有醋酸鋅和硫酸鎂。醋酸鋅和硫酸鎂的組合可以進(jìn)一步提高人工基質(zhì)維持細(xì)胞滲透壓的能力，降低細(xì)胞對(duì)溫度和pH波動(dòng)的敏感度，同時(shí)可以平衡細(xì)胞在人工基質(zhì)中的擴(kuò)散速率，提高細(xì)胞的平鋪分散度，以利于后期觀察尤其是對(duì)熒光成像效果的觀察。其中，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為計(jì)，醋酸鋅的濃度優(yōu)選為0.02-0.04％，硫酸鎂的濃度優(yōu)選為0.02-0.04％。

實(shí)施例1

新型血涂片

1、取適當(dāng)體積全血；

2、加入全血體積3-5倍的瑞特染色液并混合均勻，染色30-60s；

3、加入與染色液體積相當(dāng)?shù)牧姿猁}緩沖液并與瑞特染色液混合均勻，放置5-10min；

4、將上述染色液在800RPM下離心5min，棄上層染色液，保留下層細(xì)胞；

5、將下層細(xì)胞加入人工基質(zhì)中，其主要成分是0.85％NaCl、5％BSA、1％蔗糖、0.1％PEG、0.2％PVP以及0.5％明膠；

6、將上述細(xì)胞混勻后，將其制成單層細(xì)胞，配合光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

實(shí)施例2

用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測

1、取新鮮全血7.5ml，加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液，將紅細(xì)胞完全裂解，800rpm離心10min，棄上清保留下層細(xì)胞；

2、將上述細(xì)胞放置于抗體染色液中(內(nèi)部含有不同熒光標(biāo)記的anti-45、DAPI、CK8/CK18/CK19抗體)，染色15min；

3、800rpm離心10min，分離染色后的細(xì)胞，加入細(xì)胞平鋪人工基質(zhì)中，其主要成分為0.01M PBS、4％BSA、1％海藻糖、0.2％PEG、0.1％PVP、0.5％明膠；

4、將上述細(xì)胞混勻后，將其制成單層細(xì)胞，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞表面熒光分布情況，EpCAM+，CK+，DAPI+和CD45-細(xì)胞即為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

實(shí)施例3

在人工基質(zhì)中再加入0.03％的醋酸鋅和0.03％的硫酸鎂，其余與實(shí)施例1相同。

對(duì)比例1(現(xiàn)有技術(shù)中最常用的人工基質(zhì))

將實(shí)施例1中人工基質(zhì)的組成變?yōu)閮H含有“0.85％NaCl”，刪除5％BSA、1％蔗糖、0.1％PEG、0.2％PVP以及0.5％明膠，其余不變。

對(duì)比例2

將實(shí)施例1中人工基質(zhì)中的“0.85％NaCl”替換為“0.85％KCl”，其余不變。

對(duì)比例3

刪除實(shí)施例3中人工基質(zhì)中的“0.03％的醋酸鋅”，其余不變。

對(duì)比例4

刪除實(shí)施例3中人工基質(zhì)中的“0.03％的硫酸鎂”，其余不變。

由圖1-6可以看出，實(shí)施例1和3的平鋪效果最好，其中，從細(xì)胞分散均勻度來看，實(shí)施例3的效果要略好于實(shí)施例1。圖4表明KCl并不能替代NaCl，NaCl在整個(gè)配方中的作用要明顯優(yōu)于KCl。圖5和圖6中的細(xì)胞團(tuán)聚點(diǎn)的數(shù)量略高于圖2，跟圖1類似，說明醋酸鋅和硫酸鎂作為組合使用時(shí)，其改進(jìn)效果要略優(yōu)于其獨(dú)自被添加，當(dāng)獨(dú)自被添加進(jìn)實(shí)施例1的方案中時(shí)，其所獲得的效果與實(shí)施例1相近。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。