本發(fā)明涉及體外診斷免疫檢測領域，具體地，本發(fā)明提供了一種化學發(fā)光免疫檢測抗Scl-70抗體IgG試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗Scl-70抗體靶抗原為堿性非組蛋白，為DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的降解物，是細胞內(nèi)參與重要生物學功能的酶。因最初僅在系統(tǒng)性硬皮?。⊿Sc）患者中發(fā)現(xiàn)該抗體，且其抗原分子量為70KD，故稱為抗Scl-70抗體。DNA拓樸異構(gòu)酶-1，位于核質(zhì)中，在核仁中的濃度很高。它與DNA超螺旋的松解過程有關(guān)，在DNA雙鏈的復制和轉(zhuǎn)錄中起作用。此酶將DNA鏈切斷，并附著在產(chǎn)生的游離端上，因此，不需整個DNA分子解螺旋，而僅發(fā)生于將復制的區(qū)域。一旦某一區(qū)域復制或轉(zhuǎn)錄完成，DNA雙鏈就重新結(jié)合，拓樸酶釋放。它是細胞內(nèi)具有重要生物功能的關(guān)鍵蛋白。Scl-70抗體主要是IgG，IgA、IgM 較少見。
系統(tǒng)性硬皮病是一種全身性結(jié)締組織病，以皮膚和各臟器系統(tǒng)(如胃腸道、肺、心、腎等)的炎癥、血管和膠原纖維化的病損為主要表現(xiàn)，是一種以血管病變和嚴重纖維化為特征的結(jié)締組織病。
抗Scl-70抗體被視為系統(tǒng)性硬化的血清標記性抗體，陽性常與彌漫性皮膚病變、近端皮膚累及、心臟受累、并發(fā)腫瘤及肺間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，被認為是預后不良的指標。檢測抗Scl-70抗體可提高SSc的診斷率，有利于臨床的鑒別診斷和提高治療效果。
臨床檢測抗Scl-70抗體IgG的主要方法為酶聯(lián)免疫吸附法，但該方法存在著下述的不足之處：
（1） 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應容器，在使用時只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進行獨立的、單人份的檢測；
（2） 定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；
（3） 缺少對檢測信息的相應標注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標識才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；
（4） 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準確性；
（5） 檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復雜，容易發(fā)生操作差錯，檢測結(jié)果的準確度和精密度較差；
（6） 在檢測項目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測10個項目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10個不同的項目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟合理的缺點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
目前抗Scl-70抗體IgG檢測技術(shù)存在以下缺點：檢測成本高、檢測靈敏度低、檢測線性范圍窄、重現(xiàn)性低、不能定量、操作復雜等。
本發(fā)明正是為了克服以上所述缺點，公開了一種檢測成本低、靈敏度高、檢測線性范圍廣、重現(xiàn)性高、可以定量、操作簡單的抗Scl-70抗體IgG試劑盒及其制備方法。本發(fā)明首先制備化學發(fā)光免疫分析試劑盒，主要包括：抗Scl-70抗體IgG單克隆抗體包被的磁顆粒、鼠抗人IgG標記的吖啶酯以及抗Scl-70抗體IgG定標品；然后利用全自動化學發(fā)光免疫分析儀對定標品進行檢測，繪制標準曲線，內(nèi)置于電腦軟件，測試實際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計算樣本濃度；最后對抗Scl-70抗體IgG全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評價。
本發(fā)明與目前技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：
1、本發(fā)明選擇吖啶酯作為標記材料，并應用于化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學發(fā)光相比，該反應不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；
2、本發(fā)明選用的吖啶酯化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測靈敏度高，能夠達到0.4 AU/mL，相比其它的抗Scl-70抗體IgG檢測方法靈敏度至少提高了5倍；
3、本發(fā)明選用的吖啶酯化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達到3-190 AU/mL，其它的抗Scl-70抗體IgG化學發(fā)檢測方法的檢線性范圍為20-135 AU/mL；
4、本發(fā)明選用的吖啶酯化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達到的；
5、本發(fā)明的化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標準曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
6、本發(fā)明的化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實現(xiàn)全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。
附圖說明
圖1為實施例3得到的抗Scl-70抗體IgG標準曲線圖。
具體實施方式
實施例1：抗Scl-70抗體IgG化學發(fā)光免疫檢測試劑盒制備方法
（1）抗Scl-70抗體IgG單克隆抗體包被的納米磁珠制備：
取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1um）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 抗Scl-70抗體IgG單克隆抗體，室溫下混懸2-10 h，磁分離，去除上清，用含2% BSA 的0.1 M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到抗Scl-70抗體IgG單克隆抗體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（2）鼠抗人IgG標記的吖啶酯的制備：
取50 uL 25mg/mL的鼠抗人IgG，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應，1-2 h后取出，用2 mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，最后加入得到的鼠抗人IgG標記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到鼠抗人IgG標記的吖啶酯，每瓶5 mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（3）抗Scl-70抗體IgG定標品的制備：
用標準品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將抗Scl-70抗體IgG配置成濃度為0.1 AU/mL、13.1 AU/mL、26.0 AU/mL、51.3 AU/mL、102.2 AU/mL、202.3 AU/mL，每瓶0.5 mL分裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(4)化學發(fā)光預激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入80uL質(zhì)量分數(shù)為20%的雙氧水(H2O2)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。
(5)化學發(fā)光激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克PC300、0.5g疊氮化鈉、1.5克Triton 405，搖勻后避光存放。
實施例2：抗Scl-70抗體IgG化學發(fā)光免疫檢測方法：
本發(fā)明以全自動化學發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，本發(fā)明的方法學模式為間接法，即儀器依次加入5 uL的樣品（1:20稀釋）、50 uL的抗Scl-70抗體IgG單克隆抗體包被的磁顆粒反應10 min后，清洗，加入100 uL的抗Scl-70抗體IgG測試稀釋液及50 uL的鼠抗人IgG標記的吖啶酯，反應10 min后，進行磁分離，儀器將反應混合物送入暗室，依次加入50uL化學發(fā)光預激發(fā)液、50uL化學發(fā)光激發(fā)液進行發(fā)光反應，最后記錄發(fā)光強度，從標準曲線計算出被測樣品的 抗Scl-70抗體IgG含量。
實施例3：抗Scl-70抗體IgG化學發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評價
檢測曲線見附圖1。
靈敏度的檢測：
參照CLSI EP17-A 文件推薦實驗方案，計算抗Scl-70抗體IgG化學發(fā)光免疫層析試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為0.4AU/ mL。
線性的檢測：
對濃度為13.1 AU/mL、26.0 AU/mL、51.3 AU/mL、102.2 AU/mL、202.3 AU/mL 標準品做線性分析，計算線性相關(guān)系數(shù)，r=0.9996，另外，該試劑盒對抗Scl-70抗體IgG樣品檢測的線性范圍為3-190 AU/mL。
精密度測定：
取濃度為43.3 AU/mL及107.7AU/mL兩個抗Scl-70抗體IgG樣品，每個樣本每個濃度各做3個平行，用三批試劑盒進行檢測，計算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%。
干擾性實驗：
取混合血清分別添加干擾物包括： 結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照 1: 20 進行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計算二者之間的偏差，以 ±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達到 NCCLS 的文件標準，可用于臨床實驗室抗Scl-70抗體IgG狀況的準確評估。
實施例4:抗Scl-70抗體IgG化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的靈敏度對比實驗
分別用化學發(fā)光檢測方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對濃度為0AU/mL的校準品或樣本稀釋液為樣本進行檢測，重復測定20次，得出20次測量結(jié)果的RLU值（相對發(fā)光值），計算其平均值（M）和標準差（SD），得出M+2SD，將該發(fā)光值代入校準曲線計算得到相應的濃度值。采用化學發(fā)光檢測方法得到的濃度值為0.4AU/mL，相對于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法最低檢測限2.5AU/mL，提高了約6倍。