本發(fā)明屬于生物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種抗pedv的單克隆抗體及其化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉（ped）由豬流行性腹瀉病毒（pedv）引起豬只發(fā)生嘔吐、腹瀉、腸炎、脫水以及哺乳仔豬的高死亡率為特征。所有不同階段的豬群均可感染，發(fā)病率可達(dá)100%，哺乳仔豬的死亡率高達(dá)90%以上。在許多養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家都己有此病暴發(fā)的報(bào)道,尤其是在亞洲、歐洲等地區(qū)引起了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

ped首次在1971年于英國(guó)報(bào)道，隨后在1978年該病在比利時(shí)和英國(guó)首次得到鑒定，我國(guó)于1984年證實(shí)該病在的存在，目前世界上大多數(shù)養(yǎng)豬國(guó)家都有該病的報(bào)道，尤其以韓國(guó)、日本、中國(guó)、泰國(guó)和越南等國(guó)家發(fā)病嚴(yán)重。自2010年秋以來(lái),我國(guó)南方部分省份出現(xiàn)了嚴(yán)重的仔豬流行性腹瀉,發(fā)病情況比先前更為兇猛，造成仔大量的哺乳仔豬發(fā)病死亡，尤其是7日齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達(dá)100%，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并已成為影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。由于ped與豬傳染性胃腸炎(tge)在流行病學(xué)、臨床癥狀等變化上非常相似這給該病的快速診斷與防治都帶來(lái)了一定困難。另外，由于pedv具有在體外分離培養(yǎng)難度大的特點(diǎn)，在研制單克隆抗體方面大多通過(guò)原核表達(dá)病毒的某個(gè)蛋白，制備抗相應(yīng)蛋白的單克隆抗體，而通過(guò)pedv疫苗弱毒株，研制出抗pedv的igg2a單克隆抗體，并利用單克隆抗體，建立化學(xué)方法檢測(cè)pedv方法，未見報(bào)道。因此，本研究利用空斑純化技術(shù)，從豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎-輪狀病毒的三聯(lián)弱毒疫苗中獲得pedv弱毒株，作為抗原，制備pedv單克隆抗體，并建立化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用于該病的診斷，對(duì)該病的有效診斷與防控具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抗pedv的單克隆抗體及其化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)方法，主要利用空斑純化技術(shù)，從豬流行性腹瀉病毒-豬傳染性胃腸炎-豬輪狀病毒的三聯(lián)活疫苗中純化獲得pedv弱毒，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、梯度離心、免疫小白鼠和制備單克隆抗體核心技術(shù)，獲得抗pedv單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及pedvigg2a單克隆抗體，單克隆抗體具有效價(jià)高、特異性強(qiáng)及穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。利用pedv單克隆抗體，通過(guò)包被液、單抗包被濃度等系列條件優(yōu)化，建立了一種檢測(cè)pedv的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、一次性檢測(cè)量大及穩(wěn)定性好等特點(diǎn),能檢測(cè)到0.26ng的病毒。建立的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，應(yīng)用表明與rt-pcr檢測(cè)技術(shù)的符合率在95%以上，與熒光定量rt-pcr檢測(cè)方法符合率100%，適合對(duì)pedv的快速診斷。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種利用所述pedv單克隆抗體建立檢測(cè)pedv的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，具體包括如下步驟：

（1）抗體包被：采用磷酸鹽緩沖液為包被液，以4ug/mlpedv單克隆抗體濃度包被于固相載體微孔板上，100ul/孔，37℃孵育2h或4℃過(guò)夜，洗滌3次；

（2）封閉：以2.5%bsa作為封閉液體封閉覆蓋微孔板，每孔300ul/孔，4℃過(guò)夜，洗板3次；

（3）加樣：依次加入樣品，100ul/孔37℃溫育1小時(shí)，洗板3次；

（4）加酶標(biāo)二抗：加入hrp酶標(biāo)記的pedv單克隆抗體，以1:4000稀釋后的液體加100ul/孔，37℃45min，洗板6次；

（5）加檢測(cè)底物：加入化學(xué)發(fā)光底物液thermoscientificsupersignalelisafemto底物液（購(gòu)自thermofisher）100ul/孔，避光反應(yīng)3分鐘；

（6）檢測(cè)：用發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)光計(jì)數(shù)。

hrp酶標(biāo)記pedv單克隆抗體的方法通過(guò)常規(guī)方法標(biāo)記獲得。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

所獲得單克隆抗體具有特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，抗體效價(jià)高等特點(diǎn)（elisa和ifa效價(jià)均在10^-5），且是針對(duì)pedvm蛋白的單克隆抗體，同時(shí)pedv單克隆抗體株具有中和病毒特性，其效價(jià)為10^-3。利用pedv單克隆抗體，建立了一種檢測(cè)pedv的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，該方法具有特異性強(qiáng)（只能檢測(cè)到pedv），敏感性高(能檢測(cè)到0.26ng的病毒，比普通rt-pcr敏感10倍以上)、操作簡(jiǎn)單（相當(dāng)于普通elisa檢測(cè)方法）、一次性檢測(cè)量大（一次可以檢測(cè)80以上個(gè)樣品）及穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，具有比其他檢測(cè)方法無(wú)可比擬的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用表明與rt-pcr檢測(cè)技術(shù)的符合率在95%以上，與熒光定量rt-pcr檢測(cè)方法符合率100%。適合對(duì)pedv的快速診斷及科研試驗(yàn)。

附圖說(shuō)明

圖1是pedv接種vero細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)萎縮脫落的病變。

圖2是pedv接種vero細(xì)胞的空斑形態(tài)。

圖3是pedv-e1雜交瘤細(xì)胞上清ifa染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明主要是利用空斑純化技術(shù)，從豬流行性腹瀉病毒-豬傳染性胃腸炎-豬輪狀病毒的三聯(lián)活疫苗中純化獲得pedv弱毒，病毒通過(guò)梯度離心、免疫小白鼠和制備單克隆抗體核心技術(shù)，獲得抗pedvigg2a單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及相應(yīng)單克隆抗體。利用單克隆抗體，通過(guò)系列條件優(yōu)化，首次建立化學(xué)發(fā)光診斷技術(shù)，用于防治ped疾病。以下說(shuō)明本發(fā)明制備抗pedvigg2a單克隆抗體及建立的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法在疫病診斷防控中應(yīng)用，選用理由及其具體操作方法：

實(shí)施例1

（一）純化培養(yǎng)ped病毒

利用空斑純化技術(shù)，通過(guò)vero細(xì)胞從豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎-輪狀病毒的三聯(lián)弱毒疫苗中，純化獲得pedv毒株。該病毒能致vero細(xì)胞出現(xiàn)典型的病理變化（見附圖1），病毒效價(jià)達(dá)10^-7.5/0.1ml,為制備pedv單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。其空斑純化步驟如下：

1、用dmem沖洗長(zhǎng)滿單層vero細(xì)胞的6孔板3遍；加入400μl倍比稀釋（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7）的病毒液，并設(shè)置陰性對(duì)照加入400μldmem，37℃孵育45min，每15min搖勻以充分接觸；孵育后吸出病毒液，用dmem沖洗3遍，每孔加入4ml低熔點(diǎn)瓊脂混合液（2.0%低熔點(diǎn)瓊脂與2×dmem等比例混合，并加入1.5%的fbs）；待其凝固后，37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)4-6d，注意觀察；空斑隨時(shí)間而慢慢變大，我們發(fā)現(xiàn)病毒在10^-6稀釋度時(shí)，其空斑形態(tài)最容易觀察和辨別，隨后棄覆蓋瓊脂，用0.5%結(jié)晶紫染色后，可以清晰的看到典型的pedv空斑(附圖2)。

2、挑取合適的空斑于400μldmem（無(wú)血清）中，凍融4次，將病毒液進(jìn)行5輪的空斑純化。待空斑長(zhǎng)置合適大小的時(shí)候，棄覆蓋瓊脂，用10%甲醛固定20min，0.5%結(jié)晶紫染液染色10min，pbs沖洗3遍，觀察并記錄空斑形態(tài)。

3、將5輪純化過(guò)的病毒液于vero細(xì)胞中擴(kuò)大培養(yǎng)，收集病毒液進(jìn)行pcr鑒定，確定病毒液是否存在其他嗜細(xì)胞系病毒。結(jié)果表明純化的病毒液中豬傳染性胃腸炎和輪狀病毒等其他嗜細(xì)胞系病毒檢測(cè)為陰性，而pedv檢測(cè)為陽(yáng)性。說(shuō)明試驗(yàn)獲得單一pedv毒株。

(二)制備pedvigg2a單克隆抗體

1、ped抗原制備

將pedv接種于vero細(xì)胞單層，培養(yǎng)2～3d，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)85%以上時(shí)，收獲細(xì)胞毒。細(xì)胞毒經(jīng)超聲裂解，10000r·min^-1離心60min，取上清液，45000r·min^-1離心180min，用0.01mol·l^-1pbs（ph7.2）懸浮沉淀，即為粗提病毒；取粗提抗原鋪依次墊于30%-60%蔗糖-pbs，33000r·min^-1離心150min，收集30-40%病毒目的條帶，重懸于pbs中，45000r·min^-1離心180min洗脫蔗糖，沉淀重懸于pbs中即為純化的病毒抗原，經(jīng)w-b和rt-pcr鑒定為pedv后，測(cè)定蛋白濃度為4mg/ml，用于免疫balb/c小鼠。

2、免疫balb/c小鼠

采用常規(guī)免疫方法進(jìn)行長(zhǎng)程免疫。將取純化病毒抗原(1mg/ml)與等體積弗氏完全佐劑乳化后，皮下多點(diǎn)注射6周齡babl/c鼠，0.2ml/只。初次免疫后第14天、28天和第42天，取抗原與弗氏不完全佐劑等量混勻乳化，進(jìn)行二免、三免及四免，當(dāng)血清e(cuò)lisa抗體效價(jià)達(dá)1:10000以上時(shí)，于融合前3天取純化抗原經(jīng)尾靜脈加強(qiáng)免疫，100μg/只。

3、細(xì)胞融合

即無(wú)菌取免疫小鼠脾臟，分散脾淋巴細(xì)胞，1000rpm離心10min，將細(xì)胞疏松后加nh4cl，冰浴10min，同上離心，疏松、重懸于10mldmem，收集sp2/o細(xì)胞，進(jìn)行脾細(xì)胞和sp2/o細(xì)胞計(jì)數(shù)，取脾細(xì)胞和sp2/o細(xì)胞按6:1的比例混合，1200r·min^-1離心5min，疏松后1min內(nèi)緩緩加入1ml37℃預(yù)熱的peg進(jìn)行細(xì)胞融合，捻轉(zhuǎn)5min，緩慢加入dmem，同上離心，疏松細(xì)胞后，重懸雜交瘤細(xì)胞于含20%牛血清的hat-dmem培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)脾細(xì)胞數(shù)量，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0.1ml/孔，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第5天補(bǔ)加0.1ml含15%牛血清的ht-dmem，每天觀察生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底的1/3，或培養(yǎng)液變黃時(shí)，上清進(jìn)行抗體檢測(cè)。

4、pedv間接elisa方法的建立

pedv抗原用ph9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋，包被于elisa板條，100μl/孔，置37℃2h，0.01mpbst洗滌液洗滌3次后，以1.5％bsa-pbst封閉，300μl/孔，37℃2h，同上洗滌，加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，100μl/孔，37℃反應(yīng)1h，同上洗滌后加1:40000稀釋的羊抗鼠igg辣根過(guò)氧化物酶，100μl/孔，37℃反應(yīng)1h，同上洗滌后，加入opd，100μl/孔，37℃避光顯色15min，2mol／lh2so4終止反應(yīng)，在自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的od490值，以p:n≥2.1時(shí)，判斷為雜交瘤細(xì)胞分泌抗體陽(yáng)性。經(jīng)方陣滴定法測(cè)定，當(dāng)抗原包被濃度為2.5μg/0.1ml/孔，血清稀釋度為1:2000或抗原包被濃度為3.5μg/0.1ml/孔，血清稀釋度為1:4000時(shí)，陽(yáng)性血清od490值均達(dá)1.0，陰性血清的od490值較小，od490值均在0.08以下，p/n值達(dá)15以上，確定最佳抗原包被濃度為2.5-3.5μg/0.1ml/孔。

5、篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株

用間接elisa篩選雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔特異性抗體，從檢出的陽(yáng)性孔中，挑選od值高、細(xì)胞形態(tài)好生長(zhǎng)旺盛且不與正常細(xì)胞培養(yǎng)物交叉的陽(yáng)性孔，通過(guò)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行有限稀釋法克隆。經(jīng)多次有限稀釋后，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗pedv抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為pedv-e1。這株細(xì)胞在體外連續(xù)培3個(gè)月，能穩(wěn)定分泌抗體，經(jīng)液氮凍存、復(fù)蘇后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，且上清液抗體效價(jià)不變。

6、腹水制備

6.1babl/c小鼠誘導(dǎo)

8周齡balb/c小鼠腹腔注射滅菌的液體石蠟進(jìn)行誘導(dǎo)，分籠飼養(yǎng)8天。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)1500r/min離心5min沉淀細(xì)胞，用不含血清的dmem約1ml重懸，腹腔注射石蠟誘導(dǎo)的babl/c鼠，每只小鼠注射1×10⁶雜交瘤細(xì)胞。

6.2收集腹水

小鼠注射雜交瘤細(xì)胞約10天后觀察小鼠腹部，有產(chǎn)生腹水的小鼠腹部會(huì)明顯膨大。此時(shí)采用引流收集腹水，1000r/min，離心15min，收集上層淡黃色腹水，采用thermo公司生產(chǎn)的nabtmspinkits試劑盒進(jìn)行純化，測(cè)定elisa效價(jià)和間接免疫熒光試驗(yàn)（ifa）效價(jià)，做好標(biāo)記，凍于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

6.3pedv感染細(xì)胞的制備及免疫熒光試驗(yàn)(ifa)

將pedv接種于已長(zhǎng)成單層的vero96孔細(xì)胞板，37℃5%co2培養(yǎng)至30%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，棄上清，pbs洗滌1次，每孔加入預(yù)冷甲醇100μl，4℃固定30min，棄甲醇，pbs洗滌1次，涼干后，-30℃凍存?zhèn)溆?。同樣處理不接毒的vero細(xì)胞用于陰性對(duì)照。ifa檢測(cè)時(shí)，于上述細(xì)胞板中每孔加入30ul雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液于37℃作用30min，用0.85%生理鹽水洗滌3次，每次5分鐘，甩干，加羊抗鼠igg-fitc每孔30ul，37℃作用30分鐘，洗滌同上，甩干，加50%pbs—甘油，每孔30ul，于倒置熒光顯微鏡下觀察ifa染色結(jié)果,具有熒光反應(yīng)（見附圖3）。

7、單抗特性分析

7.1單抗亞級(jí)份的測(cè)定

按照單克隆抗體分型試劑盒介紹的方法進(jìn)行。經(jīng)過(guò)抗體亞型試劑盒鑒定，單抗在亞類鑒定中pedv-e1株屬于igg2a。

7.2細(xì)胞株穩(wěn)定性試驗(yàn)

將具有分泌特性的雜交瘤細(xì)胞體外連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月，每15天檢測(cè)其上清液的抗體效價(jià)穩(wěn)定；將液氮凍存的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞每個(gè)月復(fù)蘇一次，連續(xù)3個(gè)月，測(cè)定上清抗體效價(jià)基本不變。

7.3單抗特異性的測(cè)定

單抗只能識(shí)別pedv；間接免疫熒光試驗(yàn)（ifa）結(jié)果表明：?jiǎn)慰苟疾慌cvero細(xì)胞、prrsv、prv、pcv2和scfv發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明單抗的特異性好。

7.4單抗elisa效價(jià)及單抗ifa價(jià)測(cè)定

應(yīng)用間接elisa檢測(cè)雜交瘤培養(yǎng)上清液和ifa腹水抗體的效價(jià)，雜交瘤細(xì)胞上清液用抗體稀釋液稀釋成2^-1～2^-10，腹水用抗體稀釋液按10倍稀釋成10^-2～10^-8。結(jié)果elisa效價(jià)pedv-e1株單抗的培養(yǎng)上清液為2^-5，腹水抗體效價(jià)為10^-5，ifa效價(jià)為10^-5。

8westernblot試驗(yàn)

以pedv抗原進(jìn)行sds-page電泳。轉(zhuǎn)印至nc膜用tbs-t封閉，4℃過(guò)夜，tbs-t洗膜3次，加1:100倍稀釋的腹水單克隆抗體，37℃作用2h，洗滌，加入羊抗鼠igg堿性磷酸酶標(biāo)記抗體(1:10000)，室溫反應(yīng)2h，同上洗滌，置于底物顯色，結(jié)果表明pedv-e1是針對(duì)m蛋白的單克隆抗體。

(三)建立pedv化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法

1、化學(xué)發(fā)光的工作流程

本實(shí)驗(yàn)采用酶促化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)的方法，以pedv單克隆抗體作為包被抗體、以hrp標(biāo)記的pedv單克隆抗體為標(biāo)記抗體。具體工作流程如下：（1）包被：將pedv單克隆抗體包被于固相載體微孔板上,100ul/孔，37℃孵育2h或4℃過(guò)夜，洗滌3次；（2）封閉：覆蓋微孔板每孔加入2.5%bsa進(jìn)行封閉，300ul/孔，4℃過(guò)夜，洗板3次;（3）加樣：依次加入樣品100ul/孔，濃度為80ug/ml（s5），37℃溫育1h，洗板3次；（4）加二抗：hrp酶標(biāo)記的pedv單克隆抗體（以1:4000稀釋后的液體）100ul/孔，37℃40min，洗板6次；（5）加檢測(cè)底物：加入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)thermoscientificsupersignalelisafemto底物液購(gòu)自thermofisher）100ul/孔，避光反應(yīng)3分鐘；(6)檢測(cè)：用發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)光計(jì)數(shù)。

2、化學(xué)發(fā)光工作條件的優(yōu)化

2.1包被液的選擇

按化學(xué)發(fā)光工作流程，選擇3種緩沖液，第一種為5%bsa磷酸鹽緩沖液，第2種為磷酸鹽緩沖液，第三種為碳酸鹽緩沖液。稀釋包被單克隆抗體，其它條件不變，根據(jù)單克隆抗體包被濃度80ug（s5）/0ug(s0)的值確定最佳包被液。結(jié)果以磷酸鹽緩沖液為包被緩沖液時(shí)，其s0點(diǎn)的發(fā)光值明顯低于其他包被液，且s5/s0的值明顯高于其他包被緩沖液，因此，選擇磷酸鹽緩沖液作為包被緩沖液。見下表1

表1不同包被緩沖液的s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.2封閉液的選擇

按化學(xué)發(fā)光的工作流程，封閉液分別為2.5%bsa和5%bsa,2.5%明膠和5%明膠300ul/孔，其他2條件不變，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和s5/s0的值確定最佳稀釋液。結(jié)果以2.5%bsa磷酸鹽緩沖液作為稀釋液時(shí)，且s5/s0的值明顯高于其他組，因此，選擇2.5%bsa磷酸鹽緩沖液作為封閉液。見下表2。

表2不同封閉液的s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.3包被抗體濃度的選擇

按化學(xué)發(fā)光的工作流程，包被液將單抗分別稀釋為1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml，8ug/ml孔，其他條件不變，根據(jù)s5/s0的值確定最佳包被濃度。結(jié)果以4ug/ml作為單克隆抗體包被濃度時(shí)，其s0點(diǎn)的發(fā)光值明顯低于其他，且s5/s0的值明顯高于其他組，因此，選擇單克隆抗體包被濃度為4ug/ml。見下表3。

表3不同單克隆抗體包被濃度s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.4酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇

按化學(xué)發(fā)光工作流程，將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)的單抗分別以1:2000、1:4000和1:6000倍稀釋，其他條件不變，根據(jù)根據(jù)s5/s0的值確定最佳酶標(biāo)記單抗的稀釋濃度。結(jié)果以酶標(biāo)記單克隆抗體的濃度為1:4000時(shí)，其s0點(diǎn)的發(fā)光值明顯低于其他，s5/s0的值也較高，因此，選擇酶標(biāo)記單克隆抗體的濃度為1:4000。見下表4。

表4不同酶標(biāo)記單克隆抗體的濃度s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.5酶標(biāo)記單抗最佳工作時(shí)間的選擇

按化學(xué)發(fā)光的工作流程，根據(jù)上述確定的最佳工作條件，分別反應(yīng)30min、45min和60min，其他條件不變，根據(jù)s5/s0的值確定酶標(biāo)記單抗的最佳工作時(shí)間。結(jié)果以酶標(biāo)記單克隆抗體的工作時(shí)間為45min，且s5/s0的值明顯高于其他組，因此，選擇酶標(biāo)記單克隆抗體的工作時(shí)間45min,見下表5。

表5不同酶標(biāo)記單克隆抗體的工作時(shí)間s0、s5的發(fā)光值及s5/s0的值

2.6化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系及條件的確定

經(jīng)過(guò)以上一系列條件的優(yōu)化，確立了化學(xué)發(fā)光最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：采用磷酸鹽緩沖液為稀釋液體，以4ug/mlpedv單克隆抗體濃度包被于固相載體微孔板上100ul/孔，37℃孵育2h或4℃過(guò)夜，洗滌3次；封閉：以2.5%bsa作為封閉液體封閉覆蓋微孔板，300ul/孔，4℃過(guò)夜,洗板3次;加樣：依次加入樣品，100ul/孔37℃溫育1h,洗板3次；加二抗：hrp酶標(biāo)記的pedv單克隆抗體（以1:4000稀釋后的液體）100ul/孔，37℃45min，洗板6次；

(5）加檢測(cè)底物：加入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)thermoscientificsupersignalelisafemto底物液

（購(gòu)自thermofisher）100ul/孔，避光反應(yīng)3min；(6)檢測(cè)：用發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)光計(jì)數(shù)。

3、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法特異性、敏感性及重復(fù)性的測(cè)定

3.1特異性的測(cè)定

根據(jù)建立的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，分別采用豬流行性腹瀉病毒（pedv）、豬瘟病毒(scfv)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)、豬偽狂犬病毒(prv)、豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)、豬傳染性胃腸病毒(tegv)及豬輪狀病毒(rv)為被檢測(cè)樣品，測(cè)定方法的特異性。結(jié)果只有pedv檢測(cè)到強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光值421975,為陽(yáng)性，其他病毒檢測(cè)為陰性，說(shuō)明建立的化學(xué)發(fā)光方法具有很好的特異性。見下表6。

表6特異性測(cè)定

注：+表示陽(yáng)性，表示-陰性

3.2敏感性的測(cè)定

根據(jù)建立的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，將pedv進(jìn)行1:10、1:100、1:1000、1:10000依次倍比稀釋，測(cè)定檢測(cè)方法的敏感性。結(jié)果該方法能檢測(cè)到2.6ng的病毒含量，說(shuō)明方法具有較好的靈敏性。見下表7。

表7敏感性測(cè)定

+表示陽(yáng)性，表示-陰性

3.3重復(fù)性的測(cè)定

根據(jù)建立的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，將pedv樣品進(jìn)行5次重復(fù)，測(cè)定檢測(cè)方法的重復(fù)性。結(jié)果化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度基本一致，說(shuō)明方法具有良好的重復(fù)性，見下表8。

表8重復(fù)性測(cè)定

注：+表示陽(yáng)性，表示-陰性

4、化學(xué)發(fā)光方法的臨床初步應(yīng)用

通過(guò)檢測(cè)56份疑似病料進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)rt-pcr檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行比較，符合率在95%以上，與熒光定量rt-pcr檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行比較，符合率為100%，說(shuō)明建立的pedv化學(xué)方法檢測(cè)方法，適合對(duì)pedv的快速診斷，能為ped的快速診斷提供了良好的技術(shù)支撐。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。