分析甲萘威殘留的ELISA檢測試劑盒及其應用的制作方法

文檔序號：11913374閱讀：300來源：國知局

本發(fā)明涉及基于ELISA法的農(nóng)藥殘留分析技術，具體地說，涉及一種分析甲萘威殘留的ELISA檢測試劑盒及其應用。

背景技術：

甲萘威是一種氨基甲酸酯殺蟲劑，這類農(nóng)藥殘留的常規(guī)檢測主要是應用儀器分析法，包括氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)等。這些分析方法所需的儀器價格昂貴，樣品的分離、提取、凈化、衍生等前處理復雜，分析速度慢、檢測靈敏度低，難以滿足現(xiàn)場快速檢測需求。許多理化分析技術本身存在局限性，如甲萘威的熱穩(wěn)定性差，難于用氣相色譜法分析，而液相色譜尚缺乏選擇性好的高靈敏度檢測器等。隨著待檢樣品、特別是要求現(xiàn)場快速檢測樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析手段難以適應要求。

膽堿酯酶抑制法是利用有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制作用原理而建立的一種農(nóng)藥殘留檢測方法，具有通用性強、簡便快速等優(yōu)點，一定程度上滿足了現(xiàn)場檢測需求，但其靈敏度低，在0.1-10mg/L范圍內(nèi)，檢測結果不穩(wěn)定，難以滿足痕量檢測需求。因此，亟待開發(fā)一種高效農(nóng)藥殘留快速分析技術。

基于常規(guī)抗體(多克隆抗體和單克隆抗體)的甲萘威殘留酶聯(lián)免疫吸附分析方法穩(wěn)定性相對較低，本發(fā)明以抗甲萘威納米抗體為基礎，采用酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其熱穩(wěn)定性均優(yōu)于多克隆抗體免疫分析方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對目前農(nóng)藥殘留儀器分析方法成本高、前處理復雜、特異性差、靈敏度低和難以實驗現(xiàn)場檢測等缺點，提供一種具有高特異性、高靈敏度、高準確度、高精確度、操作方法簡單，并能用于大批量樣品快速檢測的，分析甲萘威殘留的ELISA檢測試劑盒。適用于水、土壤等樣品中甲萘威殘留的快速測定。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種抗甲萘威納米抗體，所述抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

所述抗甲萘威納米抗體可以按如下方法進行制備：利用化學反應合成甲萘威的半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸，將半抗原與鑰孔血藍蛋白偶聯(lián)后作為免疫原，免疫實驗動物羊駝，提取外周血淋巴細胞的總RNA，經(jīng)反轉錄及巢式PCR，克隆出納米抗體重鏈(VHH)基因片段，通過酶切連接，將基因片段克隆至噬菌粒載體，高效電轉化至大腸桿菌，經(jīng)輔助噬菌體拯救，構建得到噬菌體納米抗體庫，篩選出特異的甲萘威噬菌體納米抗體，將其表達純化，得到靈敏度高，特異性強的抗甲萘威納米抗體。制備的納米抗體分子小，可溶性強，耐高溫，易純化，易表達。

本發(fā)明的分析甲萘威殘留的ELISA檢測試劑盒，包括盒體、設在盒體內(nèi)可拆卸的酶標板以及設在盒體內(nèi)的試劑，其中，所述酶標板的每個孔包被有甲萘威包被抗原，所述試劑包括所述抗甲萘威納米抗體、甲萘威標準溶液、酶標記的二抗、緩沖液PBS、洗滌液PBST、顯色液(A液)、顯色液(B液)和反應終止液等。

所述甲萘威包被抗原為半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸與牛血清蛋白的偶聯(lián)復合物，所述包被抗原的制備方法如下：(1)將30.2mg N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸、13.9mg N-羥基琥珀酰亞胺和24.3mg N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺溶于1mL無水二甲基甲酰胺中，室溫下攪拌過夜反應。將反應液離心(5000rpm，10min)，棄沉淀，收集上清液，上清液中含有活性酯。(2)將牛血清蛋白20mg溶于0.05M，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液2mL中，攪拌下逐滴加入所述上清液，滴加時緩慢，約20min加完。然后室溫下繼續(xù)攪拌反應4h。(3)反應結束后，將反應液裝入透析袋內(nèi)用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)透析；每6h換液一次，共換液5-6次。透析后離心，棄沉淀，收上清液，作為抗原包被液。

所述酶標板為96孔酶標板，包被抗原的包被濃度為100ng/mL。

所述納米抗體的濃度為0.535ng/mL。

所述酶標記的二抗為辣根過氧化物酶標記的抗HA標簽抗體，濃度為0.1μg/mL。購自Abcam公司，商品編號:ab1265。

所述顯色液A液由過氧化脲1g、檸檬酸10.3g、Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g、吐溫-20 100μL和蒸餾水1000mL配制而成，pH值5。

所述顯色液B液由四甲基聯(lián)苯胺700mg、DMSO 40mL、檸檬酸10.3g和蒸餾水1000mL配制而成，pH值2.4。

所述反應終止液為2M的硫酸液。

本發(fā)明還提供所述試劑盒在ELISA法檢測樣品中甲萘威殘留的應用。分析檢測時，向包被有所述甲萘威包被抗原的酶標板的各孔中依次加入待測甲萘威樣品和所述抗甲萘威納米抗體，固相包被抗原和待測甲萘威相互競爭與納米抗體反應，由于每個孔中的固相抗原和加入的納米抗體含量均一致，因此當待測的甲萘威濃度高時，則被結合在固相抗原上的抗體少，加入的酶標二抗與被固定抗體結合量少，最后加入底物液和顯色液，顯色反應淺，用酶標儀檢測的OD值低，表明抑制率高；反之，當待測甲萘威濃度低時，則所測的OD值高，抑制率低。根據(jù)用已知濃度的甲萘威標準溶液檢測所繪制標準曲線，即可推算出待測甲萘威的濃度。

本發(fā)明進一步提供一種甲萘威ELISA檢測試劑，其有效成分為所述抗甲萘威納米抗體。

本發(fā)明的優(yōu)點是能準確靈敏地檢測水和土壤中甲萘威殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。本發(fā)明對解決大批量樣品的甲萘威殘留現(xiàn)場監(jiān)控技術具有重要的現(xiàn)實意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例6中基于納米抗體的甲萘威的標準抑制曲線。曲線回歸方程為y＝0.0294+0.8956/[1+(x/191.9258)^1.5492](R²＝0.99)抑制中濃度IC₅₀＝179ng/mL，最低檢測限IC₂₀＝59ng/mL。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1 半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸的合成

5.6g NaOH(0.139mol)溶于56mL蒸餾水中，加入20gα-萘酚(0.139mol)?；旌衔镌?5℃下攪拌反應1h，冷卻至室溫。在通風櫥內(nèi)緩慢加入過量的三光氣(19.3g三光氣和100mL甲苯)，室溫下攪拌反應1h。有機相用無水Na₂SO₄干燥，真空減壓除去有機溶劑，得到棕色油狀物質。將其溶于二氯甲烷，真空蒸餾(1mm Hg)，收集100℃的餾分，得到13.7g淡黃色油狀產(chǎn)物氯甲酸萘酯。

稱7.37g 6-氨基己酸(56.1mmol)溶于7.5mL、4mol/L的NaOH中，冷卻至4℃。將6.25g氯甲酸萘酯(30.3mmol)溶于11mL 1,4-二氧雜環(huán)己烷中，冷卻至4℃，然后與7.5mL 4mol/L冷NaOH混合，在冰浴中分5次等批量加入到6-氨基己酸堿液中，每次加入至少間隔5min，攪拌反應3h后，用濃鹽酸將pH調(diào)至4。所得油狀產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取(3次，每次用量35mL)，有機相用1mol/L的鹽酸洗滌(2次，每次用量15mL)，然后用1mol/L的NaHCO₃萃取(3次，每次用量50mL)，萃取液最后在冰浴中用pH 3的濃鹽酸酸化，得到黃色固體物。洗滌、重結晶，得4.8g干燥白色終產(chǎn)物N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸。

實施例2 甲萘威包被抗原的制備

以半抗原N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸和牛血清蛋白制備偶聯(lián)復合物，作為包被抗原。制備方法如下：

(1)將30.2mg N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸、13.9mg N-羥基琥珀酰亞胺和24.3mg N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺溶于1mL無水二甲基甲酰胺中，室溫下攪拌過夜反應。將反應液離心(5000rpm，10min)，棄沉淀，收集上清液，上清液中含有活性酯。(2)將20mg牛血清蛋白溶于2mL 0.05M，pH 9.6碳酸鹽緩沖液中，攪拌下逐滴加入所述上清液，滴加時緩慢，約20min加完。然后室溫下繼續(xù)攪拌反應4h。(3)反應結束后，將反應液裝入透析袋內(nèi)用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)透析；每6h換液一次，共換液5-6次。透析后離心，棄沉淀，收上清液，作為抗原包被液。

實施例3 甲萘威噬菌體展示納米抗體庫的構建

采用活性酯法將實施例1的半抗原與鑰孔血藍蛋白偶聯(lián)，具體方法如下：

將等摩爾量的N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸、NHS和DCC溶于DMF中，室溫下攪拌過夜反應。將反應液離心棄沉淀，上清液為活性酯。將上清液在攪拌狀態(tài)下加入鑰孔血藍蛋白溶液中，室溫下繼續(xù)攪拌反應4h。反應液裝入透析袋內(nèi)用PBS透析。離心，收集上清，冷凍干燥后即得N-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸與鑰孔血藍蛋白的偶聯(lián)物。

取1mg偶聯(lián)物溶于1mL生理鹽水中，與1mL完全弗氏佐劑混合，充分乳化后注射羊駝，以后每隔兩周加強免疫一次，換成不完全弗氏佐劑與免疫原混合，頸背部皮下多點免疫，共免疫5次。從第三次免疫開始，每次免疫后一周從頸鎖靜脈采血檢測血清效價。

從第5次免疫后的外周血中分離白細胞，提取總RNA，經(jīng)反轉錄PCR及巢式PCR，克隆出VHH基因片段，用限制性內(nèi)切酶SfiI修飾粘性末端，通過T4連接酶將VHH基因片段連接至噬菌粒pComb3x，高效電轉化至大腸桿菌ER2738，構建甲萘威的噬菌體納米抗體庫。經(jīng)測定，初級庫容量達10⁸cfu，加入輔助噬菌體(感染復數(shù)為20:1)M13KO7進行拯救，得到噬菌體納米抗體庫，庫容量為10¹⁴pfu/mL，庫的多樣性良好。

反轉錄PCR：

反轉錄試劑盒采用PrimeScript RT-PCR Kit，購自TaKaRa公司，商品編號：AK2701。

反轉錄體系如下：

65℃，反應5min。取出置于冰上，按以下體系加樣，進行cDNA第一鏈合成。

30℃10min；42℃1h；72℃5min。

巢式PCR：

第一輪PCR：

反應體系如下：

反應程序如下：

第二輪PCR：

反應體系如下：

反應程序如下：

巢式PCR引物序列如下(5′-3′)：

GSP-RT：CGCCATCAATRTACCAGTTGA

LP-leader：GTGGTCCTGGCTGCTCTW

F：CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC

R：CATGCCATGACTCGCGGCCGGCCTGGCCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG

其中，R表示堿基A/G，W表示堿基A/T，K表示堿基G/T。

實施例4 特異性甲萘威噬菌體展示納米抗體的篩選

在96孔酶標板的第1個孔包被實施例2的包被抗原，包被濃度為100μg/mL，4℃過夜；次日，倒出包被液，用PBST洗滌3次，將酶標板第1、2兩個孔用BSA封閉，37℃孵育1h；倒出封閉液，用PBST洗滌3次；將實施例3的噬菌體抗體庫加入第1個孔，反應2h；倒出液體，在潔凈的吸水紙上拍干，用PBST洗滌5次；加100μL甲萘威標準品到第1個孔中，反應1h；吸出第1個孔中的液體，加入第2個孔，反應1h，除去與BSA結合的噬菌體；收集洗脫液，取5μL用于滴度測定，其余用于擴增。

將噬菌體洗脫液加入新鮮的大腸桿菌ER2738菌液，37℃，靜置15min；加入羧芐青霉素和SB培養(yǎng)基，37℃，220rpm，培養(yǎng)2h；加入輔助噬菌體M13KO7(感染復數(shù)MOI＝20:1)和卡那霉素，培養(yǎng)過夜；次日，離心取上清，加入PEG-NaCl溶液沉淀純化噬菌體。

將擴增產(chǎn)物進行下一輪篩選，保證每輪篩選加入量相同，抗原包被濃度及甲萘威標準品競爭洗脫濃度按2倍遞減，計算每輪的滴度，挑取單克隆進行擴增及ELISA鑒定。經(jīng)4輪淘選得到陽性單克隆。

實施例5 特異性甲萘威納米抗體的表達

提取陽性單克隆質粒，化轉至大腸桿菌TOP10F’感受態(tài)細胞，復蘇后涂布于固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。次日，挑取單個克隆于SB-羧芐培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG誘導過夜表達；次日，用超聲破碎儀裂解細胞，濾膜過濾后用鎳柱純化，即利用組氨酸標簽與鎳柱中氯化鎳的親和層析對納米抗體進行分離純化，得到高純度的抗甲萘威納米抗體，經(jīng)氨基酸測序分析，所得納米抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

實施例6 分析甲萘威殘留的ELISA檢測試劑盒及其應用

所述試劑盒包括盒體、設在盒體內(nèi)可拆卸的96孔酶標板以及設在盒體內(nèi)的試劑，其中，所述酶標板的每個孔包被有實施例2的甲萘威包被抗原，所述試劑包括實施例5的抗甲萘威納米抗體、甲萘威標準溶液、酶標記的二抗、緩沖液PBS、洗滌液PBST、底物液(A液)、顯色液(B液)和反應終止液等。

抗甲萘威納米抗體的濃度為0.535ng/mL。

酶標記的二抗為辣根過氧化物酶標記的抗HA標簽抗體，濃度為0.1μg/mL。購自Abcam公司，商品編號:ab1265。

A液由過氧化脲1g、檸檬酸10.3g、Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g、吐溫-20 100μL和蒸餾水1000mL配制而成，pH值5。

B液由四甲基聯(lián)苯胺700mg、DMSO 40mL、檸檬酸10.3g和蒸餾水1000mL配制而成，pH值2.4。

反應終止液為2M的硫酸液。

將包被抗原包被于96孔酶標板上，每個孔包被濃度為100μg/mL，4℃過夜反應；次日，甩出孔中的液體，用含0.05％吐溫的PBST洗3次，將酶標板倒置在吸水紙上拍干；加入封閉液，37℃孵育30分鐘，甩出孔中的液體，用0.05％PBST洗3次，將酶標板倒置在吸水紙上拍干；配制0ng/mL，1ng/mL，4ng/mL，12ng/mL，37ng/mL，111ng/mL，333ng/mL，1000ng/mL的甲萘威標準液，加入50μL標樣或處理好的樣品到各孔中，標樣和樣品做2-4個重復，加入50μL稀釋的抗體，37℃孵育30分鐘；甩出孔中的液體，用PBST洗3次，將酶標板倒置在吸水紙上拍干；加入酶標二抗，37℃孵育30分鐘；甩出孔中的液體，用PBST洗板3次，拍干；取A液和B液等體積混勻，每孔加100μL，避光顯色10～15分鐘，加入終止液終止反應，酶標儀上測定各孔在波長為450nm處的OD值。

將含0ng/mL標準品孔的OD值減去含最大濃度標準品孔的OD值定為B₀，其余孔經(jīng)同樣方法校正后的OD值定為B；以B/B₀值為縱坐標，相應標準品濃度為橫坐標，繪制甲萘威標準抑制曲線(圖1)。根據(jù)曲線的回歸方程可以求出對應樣品的濃度，也可以求出甲萘威抑制中濃度IC₅₀(B/B₀＝50％)及最小檢測限IC₂₀(B/B₀＝80％)。

實際樣品檢測過程中，酶標板孔壁上吸附的包被抗原(包被濃度為100ng/mL)和待測甲萘威相互競爭與抗體反應，競爭結果通過顯色反應出來。檢測已知濃度的甲萘威并繪制標準曲線，可以推算出待測甲萘威的濃度。本發(fā)明的優(yōu)點是能準確靈敏地檢測水、土壤和蔬菜中甲萘威殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)大學

<120> 分析甲萘威殘留的ELISA檢測試劑盒及其應用

<130> KHP161116051.3

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 144

<212> PRT

<213> 羊駝

<400> 1