本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)領域，涉及一種高通量測量間充質干細胞數(shù)量的方法。
背景技術：
細胞計數(shù)是在細胞培養(yǎng)過程中最為常見的操作，復蘇、傳代、制劑等操作都需要對培養(yǎng)細胞進行計數(shù)，以確認細胞數(shù)量。
目前常見的技術方法有兩種。一種是人工計數(shù)法，基本方法是將細胞懸液稀釋，然后將少量懸液注入人工計數(shù)版，利用顯微鏡人工目測計數(shù)，最后依據(jù)計數(shù)板規(guī)格，通過公式計算出細胞數(shù)量；另一種是機器計數(shù)法，細胞稀釋和處理過程與人工計數(shù)類似，只是計數(shù)時將少量稀釋后的懸液注入機器配件中，再掃描計數(shù)。
兩種計數(shù)方法的基本原理沒有脫離：測量少量樣本個數(shù)，計算總樣本個數(shù)這一思路。但這兩種方法都有著自身的局限性：
1、計數(shù)過程誤差：人工計數(shù)法需要利用顯微鏡肉眼觀測計數(shù)，這一過程人為主觀性較大，常會出現(xiàn)不同人計數(shù)同一樣本但結果不同的情況；而機器計數(shù)多采用掃描計數(shù)，有時會將不是細胞的顆粒計入其中，或者將過小的細胞漏計，造成計數(shù)誤差。
2、操作過程誤差：人工計數(shù)和機器計數(shù)最終所需樣本多為10-50μL左右，細胞數(shù)過多時還需要高倍稀釋。因為樣本量過少，在吸取樣本和稀釋的過程中，非常容易產生誤差，而在加樣過程中，因為計數(shù)池過薄，樣本在擴散過程中也容易分布不均。這些操作過程的誤差都會導致最終計算時所得結果的不準確。
不適用于大批量操作：現(xiàn)今常用的細胞計數(shù)方法中，在不做重復實驗的情況下，人工計數(shù)一次實驗結束至少需要10-15分鐘，機器計數(shù)也至少需要5分鐘。并且這種兩種方法每次只能對一個樣本進行計數(shù)，針對大批量樣本效率較低，有時甚至會因為計數(shù)時間問題影響后續(xù)的細胞實驗。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種計數(shù)誤差小、計數(shù)效率高的高通量測量間充質干細胞數(shù)量的方法。
本發(fā)明采用的技術方案是：
一種高通量測量間充質干細胞數(shù)量的方法，步驟如下：
⑴標準品選擇：利用標準間充質干細胞溶液，使用PBS為溶劑，制備標準間充質干細胞標準曲線；
⑵樣本制備：取1mL待測細胞樣本，加入至1.5mL離心管中，300g離心5分鐘；棄去上清液，向沉淀細胞中加入PBS至1mL，反復吹打混勻；
⑶空白對照品制備：取上述步驟⑵制成的樣本1mL，300g離心5分鐘，取上清液做空白對照品備用；
⑷加樣：分別取制備好的對照品、標準品和樣本200μL，加入至96孔板中，每個樣本/標準品做一個復孔；
⑸測量：使用酶標儀或紫外分光光度計，選擇360nm波長對樣本進行檢測；
⑹測量：使用酶標儀或紫外分光光度計，選擇360nm波長對樣本進行檢測；
⑺結果有效性判斷：重復實驗吸光度值的CV值應小于5％；相關系數(shù)R2應大于0.980；實驗方成立；
⑻結果計算：
矯正系數(shù)的計算：按以下公式計算矯正系數(shù)
λ＝A標/(A陽-A樣)
上式中：λ為矯正系數(shù)
A標＝最低濃度標準品的吸光度值
A陽＝樣本陽性對照品的的吸光度值
A樣＝樣本的吸光度值
標準曲線制備：以5個標準品的吸光度檢測結果為縱坐標，標準品細胞密度為橫坐標，制出線性方程；
樣本結果計算：將未知樣本和空白對照品的吸光度值代入線性方程，求出細胞密度，計算未知樣本和空白對照品的細胞密度差值，再乘以矯正系數(shù)即為樣本的的細胞密度。
而且，所述標準曲線為5個點，各點之間為2倍稀釋，根據(jù)所測細胞的估算數(shù)量，制定相應夸度范圍的標準曲線；標準曲線在106個/mL則標準曲線選點應為：0.25*106個/mL、0.5*106個/mL、1*106個/mL、2*106個/mL、4*106個/mL。
本發(fā)明具有的有益效果：
1、高通量計數(shù)：使用本方法進行細胞計數(shù)，在使用96孔板并做復孔和空白對照的情況下，一次實驗可進行20多個樣本的檢測(如使用其他規(guī)格的孔板，則可獲得更大的檢測通量)，極大的提高了實驗效率，實現(xiàn)了高通量計數(shù)。
2、減少取樣誤差：本方法在測量時所使用的樣本量為200μL，與常規(guī)計數(shù)法相比，增加了檢測樣本量，降低了取樣誤差，提高計數(shù)準確度。
3、減少人為誤差：使用常規(guī)計數(shù)方法時，往往因為機器要求或者人工計數(shù)要求等問題需要將樣本進行高倍數(shù)的稀釋，而高倍數(shù)的稀釋易造成較大誤差，本方法可直接取樣進行檢測，避免高倍數(shù)稀釋從而減少實驗誤差。
4、在本方法中，一些蛋白類的可溶物可能會對實驗帶來微小誤差，但通過多次離心稀釋減小誤差并不現(xiàn)實，所以本方法的空白對照品采用了制備后樣本的離心上清液，以減少誤差。
5、控制樣本影響：考慮到樣本自身性質或含有的一些物質可能會影響吸光度大小，使得檢測結果與真實值可能有輕微偏移，從而引起一定誤差產生；所以本方法引入了矯正系數(shù)，通過標準品的檢測獲得誤差信息，再通過矯正系數(shù)換算計算出結果。
6、本方法節(jié)約成本：在機器計數(shù)法中，每次計數(shù)都會消耗一定計數(shù)耗材，本法意圖節(jié)約本部分經(jīng)濟開支。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
一種高通量測量間充質干細胞數(shù)量的方法，步驟如下：
⑴標準品選擇：利用標準間充質干細胞溶液，使用PBS為溶劑，制備標準間充質干細胞標準曲線，標準曲線為5個點，各點之間為2倍稀釋，根據(jù)所測細胞的估算數(shù)量，制定相應夸度范圍的標準曲線。(如目的樣本的細胞數(shù)應在106個/mL則標準曲線選點應為：0.25*106個/mL、0.5*106個/mL、1*106個/mL、2*106個/mL、4*106個/mL)。
⑵樣本制備：取1mL待測細胞樣本，加入至1.5mL離心管中，300g離心5分鐘；棄去上清液，向沉淀細胞中加入PBS至1mL，反復吹打混勻。
⑶空白對照品制備：取上述步驟⑵制成的樣本1mL，300g離心5分鐘，取上清液做空白對照品備用。
⑷加樣，分別取制備好的對照品、標準品和樣本200μL，加入至96孔板中，每個樣本/標準品做一個復孔。
⑸測量：使用酶標儀(紫外分光光度計)，選擇360nm波長對樣本進行檢測。
⑹結果有效性判斷：重復實驗吸光度值的CV(變異系數(shù))值應小于5％；相關系數(shù)R2應大于0.980；實驗方成立。根據(jù)發(fā)明人的驗證試驗，當變異系數(shù)大于5％時，并不能確保本方法的精密度。
⑺結果計算：以5個標準品的吸光度檢測結果為縱坐標，標準品細胞密度為橫坐標，制出線性方程；將未知樣本和空白對照品的吸光度值代入線性方程，未知樣本和空白對照品的差值即為未知樣本細胞數(shù)量。
⑻結果有效性判斷：重復實驗吸光度值的CV值應小于5％；相關系數(shù)R2應大于0.980；實驗方成立；(在驗證實驗的過程中重復組的CV值均保持在5％以下，故本方法建議重復組的CV值小于5％，以保證實驗的準確性)；
⑻結果計算：
矯正系數(shù)的計算：按以下公式計算矯正系數(shù)
λ＝A標/(A陽-A樣)
上式中：λ為矯正系數(shù)
A標＝最低濃度標準品的吸光度值
A陽＝樣本陽性對照品的的吸光度值
A樣＝樣本的吸光度值
標準曲線制備：以5個標準品的吸光度檢測結果為縱坐標，標準品細胞密度為橫坐標，制出線性方程；
樣本結果計算：將未知樣本和空白對照品的吸光度值代入線性方程，求出細胞密度，計算未知樣本和空白對照品的細胞密度差值，再乘以矯正系數(shù)即為樣本的的細胞密度。