本發(fā)明屬于癌癥標記物檢測技術領域，具體涉及一種根據(jù)辣根過氧化物酶(HRP)與沉淀型3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應在紙芯片上遷移距離不同，通過免疫法定性半定量檢測抗原的方法。

背景技術：

紙質(zhì)微流控芯片(μPADs)首次被Whitesides提出，由于其具有成本低、操作簡單、化學相容性好等特點，為紙芯片的發(fā)展提供了廣闊的平臺。紙芯片是集固定、反應、分離、檢測于一體的微型分析平臺，方便快捷，已大量用到疾病標記物的檢測，如前列腺蛋白、免疫球蛋白、癌胚抗原、甲胎蛋白等。對于紙芯片自身來說，它是一種常見的纖維材料，表面含有大量的羥基官能團，很容易進行功能化處理，修飾其它基團，比如傳統(tǒng)的殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法、高碘酸鈉改性法等，因此，比較易實現(xiàn)抗體或者蛋白質(zhì)的固定，可以高效的用于生物分析和各種疾病檢測。

紙質(zhì)微流控芯片可以直接用于檢測，目前檢測方法中，常見的有比色分析法、熒光、電化學、化學發(fā)光、電化學發(fā)光的方法。在這些分析方法中，比色法是其最常見的方法，通過紙芯片上顏色的改變來測定樣品的含量，但該方法需要眼睛對顏色做出靈敏的辨別，而人眼睛的分辨率不超過4K，檢測的靈敏度低，不利于低含量樣品的測定，很難達到定性和定量的要求，且需要特定圖片處理軟件達到對樣品檢測的目的。熒光分析法靈敏度高，但在紙芯片中很難克服高的背景信號。電化學檢測法中需要電極，成本高，操作復雜。化學發(fā)光和電化學發(fā)光的方法都需要特殊檢測儀器和專業(yè)技術操作人員。因此，近年來新興的距離檢測法因其無需檢測儀器、專業(yè)技術操作人員、操作簡單、成本低廉等特點而受到了青睞，并發(fā)展成為紙芯片上的新興檢測方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種操作簡便、成本低、無需復雜儀器，根據(jù)HRP與沉淀型TMB反應產(chǎn)生距離長短變化對抗原進行定性半定量檢測的方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案由下述步驟組成：

1、利用畫圖軟件設計出紙芯片模型，然后利用刻字機的切割刀按照紙芯片模型在Whatman濾紙上切割出紙芯片。

2、將紙芯片經(jīng)氧等離子體處理，使其表面生成用于固定抗體的醛基。

3、將捕獲抗體溶液滴加到紙芯片的檢測區(qū)，室溫孵育30分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液洗滌，除去未反應的捕獲抗體；然后在檢測區(qū)滴加牛血清蛋白溶液，室溫反應15分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液洗滌，除去未反應的牛血清蛋白；再將抗原溶液滴加到檢測區(qū)，室溫孵育15分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液洗滌，除去未反應的抗原；最后在檢測區(qū)滴加辣根過氧化物酶標記的抗體溶液，室溫孵育15分鐘，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物。

4、將步驟3形成抗體-抗原-酶標抗體復合物的檢測區(qū)剪下固定在長60～80mm、寬2～3mm的Whatman濾紙條一端，用pH＝7.4的PBS緩沖液沖洗后，在檢測區(qū)加入藍色沉淀型TMB顯色液，反應2～3分鐘后，測量剩余辣根過氧化物酶標記的抗體與TMB反應后在Whatman濾紙條上的遷移距離。

5、按照上述步驟3～4測量實際血清樣品，根據(jù)剩余辣根過氧化物酶標記的抗體與TMB反應后在Whatman濾紙條上對應的遷移距離，即可實現(xiàn)實際血清樣品中抗原的定性及半定量檢測。

上述步驟1中，優(yōu)選紙芯片至少有4個圓形檢測區(qū)，每個檢測區(qū)的直徑為5～6mm。

上述步驟2中，優(yōu)選氧等離子體處理的時間為3～5分鐘，氧等離子體的頻率為射頻13.56MHz、功率為100W。

上述的抗原為癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、前列腺蛋白抗原、免疫球蛋白抗原等中的任意一種。

上述的捕獲抗體溶液是將捕獲抗體加入到pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成，其中捕獲抗體的濃度為15～25μg/mL。

上述的牛血清蛋白溶液是將牛血清蛋白加入pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成，其中牛血清蛋白的濃度為0.1～0.5mg/100mL。

上述的辣根過氧化物酶標記的抗體溶液是將辣根過氧化物酶標記的抗體加入pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成，其中辣根過氧化物酶標記的抗體的濃度為100～250μg/mL。

上述的藍色沉淀型TMB顯色液的加入量優(yōu)選為辣根過氧化物酶標記的抗體溶液體積的12～15倍。

上述的紙優(yōu)選Whatman 1號濾紙或Whatman 3號濾紙。

本發(fā)明根據(jù)競爭免疫反應完全后，剩余辣根過氧化物酶標記的抗體在Whatman濾紙條上與TMB反應，導致毛細作用力不同而引起的遷移距離不同，首次提出HRP與沉淀型TMB反應能產(chǎn)生距離長短變化，并且利用距離變化檢測抗原，無需檢測儀器即可實現(xiàn)不同濃度癌癥標記物的定性及半定量檢測，該方法只需用普通測量長度的工具尺子測量不同濃度分析物質(zhì)產(chǎn)生的距離，即可對物質(zhì)性質(zhì)做出判斷，真正實現(xiàn)了簡單快速、成本低廉的分析，在普通的化學及生物相關實驗室均可進行，克服了傳統(tǒng)比色分析法眼睛對顏色識別的局限性，以及熒光、化學發(fā)光、電化學分析方法等需要昂貴檢測儀器、操作復雜、需要專業(yè)操作等不足，非常適合于個體對自我癌癥早期預防與監(jiān)測，在人們的日常生活中也展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。

附圖說明

圖1是實施例1設計的紙芯片的實際效果圖。

圖2是實施例1中經(jīng)過夾心免疫反應后不同濃度癌胚抗原與沉淀型TMB反應距離變化實際效果圖。

圖3是實施例1中經(jīng)過夾心免疫反應后不同濃度實際血清樣品中癌胚抗原與沉淀型TMB反應距離變化實際效果圖。

圖4是沉淀型TMB與HRP反應產(chǎn)生距離變化圖。

圖5是非沉淀型TMB與HRP反應產(chǎn)生距離變化圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于這些實施例。

實施例1

1、利用CorelDraw X6畫圖軟件設計出紙芯片模型，如圖1所示，該紙芯片模型具有8個直徑為6mm的圓形檢測區(qū)、1個直徑為6mm的進樣區(qū)和廢液區(qū)，各個區(qū)之間經(jīng)流通通道連接，流通通道寬為2mm、長為3mm；然后利用日圖CE5000-40-CRP刻字機的切割刀按照上述紙芯片模型在Whatman 1號濾紙上切割出紙芯片。

2、將紙芯片放入PDC-32G型氧等離子體清洗機中處理4分鐘，氧等離子體的頻率為射頻13.56MHz、功率為100W，處理完后紙芯片表面生成用于固定抗體的醛基。

3、將2.5μL 20μg/mL癌胚抗原的捕獲抗體溶液(將捕獲抗體加入到pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成)滴加到紙芯片的檢測區(qū)，室溫孵育30分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液在環(huán)爐(環(huán)爐結構與文獻Ring-Oven Washing Technique Integrated Paper-based Immunodevice for Sensitive Detection of Cancer Biomarker(Anal.Chem.2015,87,7951-7957)中公開的相同)上洗滌5分鐘，除去未反應的抗體；然后在檢測區(qū)滴加2.5μL 0.1mg/100mL牛血清蛋白溶液(將牛血清蛋白加入pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成)，室溫反應15分鐘，以封閉紙芯片上未反應的結合位點，減少非特異性吸附，反應完后再用pH＝7.4的PBS緩沖液在環(huán)爐上洗滌5分鐘，除去未反應的牛血清蛋白；再分別將濃度為0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的癌胚抗原溶液(癌胚抗原(CEA)來自癌胚抗原定量檢測試劑盒)滴加到檢測區(qū)，室溫孵育15分鐘后，用pH＝7.4的PBS緩沖液在環(huán)爐上洗滌5分鐘，除去未反應的抗原；最后在檢測區(qū)滴加2.5μL 200μg/mL辣根過氧化物酶標記的癌胚抗體溶液(將辣根過氧化物酶標記的癌胚抗體加入pH＝7.4的PBS緩沖液中配制而成)，室溫孵育15分鐘，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物。

4、將步驟3形成抗體-抗原-酶標抗體復合物的檢測區(qū)剪下固定在長70mm、寬2mm的Whatman1號濾紙一端，用10μL pH＝7.4的PBS緩沖液沖洗后，在檢測區(qū)加入20μL藍色沉淀型TMB顯色液，反應2分鐘后，測量剩余辣根過氧化物酶標記的抗體與TMB反應后在Whatman濾紙條上的遷移距離，結果見圖2及表1。

表1

注：當CEA含量≤5ng/mL時判為陰性；當CEA含量在5ng/mL～20ng/mL時判為弱陽性；當CEA含量≥20ng/mL時判為陽性。

5、按照上述步驟3和4的方法測定在1～6號實際血清樣品(其中癌胚抗原采用標準ELISA方法測定的濃度分別為2.63ng/mL、18.55ng/mL、1.27ng/mL、14.28ng/mL、4.12ng/mL、19.26ng/mL)加入藍色沉淀型TMB顯色液后，剩余辣根過氧化物酶標記的抗體與TMB反應后在Whatman濾紙條上的遷移距離，結果見圖3。

由圖3的結果可見，1號、3號、5號對應的遷移距離小于正常人體中癌胚抗原(CEA)對應的遷移距離，即這三個實際血清樣品中癌胚抗原的濃度小于5ng/mL，說明該人體內(nèi)癌胚抗原的值在正常范圍內(nèi)，2號、4號、6號對應的遷移距離大于正常人體中CEA對應的遷移距離，但小于表1中癌胚抗原濃度為20ng/mL對應的遷移距離，說明這三個實際血清樣品中癌胚抗原的濃度大于5ng/mL小于20ng/mL，建議定期動態(tài)觀察。由此可見，本發(fā)明方法實現(xiàn)了癌胚抗原的定性及半定量分析。

發(fā)明人分別采用沉淀型TMB、非沉淀型TMB與不同濃度的HRP進行反應，具體試驗方法如下：

將酶標板用二次水洗干凈并烘干，然后向一個酶標板每孔加入100μL藍色沉淀型TMB顯色液和不同濃度HRP，另一個酶標板每孔加入100μL非沉淀型TMB和不同濃度HRP(HRP的濃度分別為25μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、6μg/mL、1μg/mL、500ng/mL)，反應20秒后，將得到的紙芯片用鑷子豎直插入到酶標孔中，反應30min觀察區(qū)別，結果見圖4和圖5。由圖可見，沉淀型TMB與HRP反應可以產(chǎn)生距離長短變化，而非沉淀型TMB與HRP反應不能產(chǎn)生距離長短變化。