本發(fā)明涉及紙芯片技術(shù)、納米材料技術(shù)、DNA適配體、便攜式血糖儀，更具體地說是一種基于便攜式血糖儀的適合現(xiàn)場快速檢測非葡萄糖的紙分析器件的構(gòu)建。

背景技術(shù)：

目前具有原位快速檢測，低消耗，易操作環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)的便攜式設(shè)備已被廣泛應(yīng)用于日常生活中。其中商業(yè)化的便攜式血糖儀已經(jīng)被人們廣泛使用，但是它只針對糖尿病患者血液中葡萄糖濃度進(jìn)行檢測。結(jié)合DNA探針利用便攜式血糖儀達(dá)到檢測多種目標(biāo)物受到人們越來越多的關(guān)注。通過蔗糖轉(zhuǎn)化酶的橋梁作用，可將便攜式血糖儀用于多種目標(biāo)物的檢測。

由于凝血酶在心血管疾病，炎癥調(diào)理，抗凝治療過程中具有重要的意義，凝血酶的定量檢測在臨床中變得越來越重要。目前已有利用電化學(xué)，電化學(xué)發(fā)光，比色，熒光等方法檢測凝血酶的含量，但是這些傳統(tǒng)的方法都面臨著一個操作復(fù)雜，儀器昂貴等缺陷。為了解決這些問題，構(gòu)建一個簡單，便宜，環(huán)保易于操作的紙基器件是非常必要的。凝血酶蛋白和對應(yīng)的核酸適配體有特異性的結(jié)合位點(diǎn)。核酸適配體是一類能與蛋白質(zhì)等靶物質(zhì)特異性結(jié)合的寡聚核苷酸片段,相對于傳統(tǒng)地抗體具有良好地化學(xué)穩(wěn)定性和成熟地合成技術(shù)。我們將日常生活中普遍存在的便攜式血糖儀與適配體技術(shù)結(jié)合建立了一快速、簡便、低消耗高效率定量檢測凝血酶方法。

目前紙基器件以其低廉的成本、簡單的制作過程、便于攜帶和處理等優(yōu)點(diǎn)在臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到了快速發(fā)展。粗糙的表面和復(fù)雜的內(nèi)部孔洞以及負(fù)載的大量官能團(tuán)大大提高了紙的有效面積，為負(fù)載更多材料提供了良好的微環(huán)境，因此基于便攜式血糖儀和適配體技術(shù)檢測凝血酶的紙分析器件的構(gòu)建具有很重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是基于便攜式血糖儀和適配體技術(shù)構(gòu)建用于簡便、快速、高靈敏地檢測凝血酶的紙分析器件。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的：

（1）在計(jì)算機(jī)上利用Adobe illustrator CS4軟件設(shè)計(jì)微流控紙芯片的疏水蠟打印圖案，如附圖1所示；

（2）將步驟（1）中設(shè)計(jì)的打印圖案通過蠟打印機(jī)打印在色譜紙上，隨后將打印過的A4色譜紙放置到平板加熱器或烘箱中，在100 oC下加熱100 s，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻；

（3）對步驟（2）中獲得的紙芯片的親水區(qū)域功能化；

（4）在步驟（3）中所得到金納米粒子修飾的工作區(qū)域上固定5′端帶有巰基的適配體鏈，隨后采用牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，使用濃度為0.01 M、pH 7.4的磷酸緩沖溶液清洗，備用；滴加20 μL 待檢測的凝血酶溶液，孵育35 min 后用磷酸緩沖溶液清洗；滴加20 μL 蔗糖酶標(biāo)探針孵育45 min后用磷酸緩沖溶液清洗；滴加60 μL 濃度為1 M的蔗糖溶液，反應(yīng)1 h, 備用；

（5）用便攜式血糖儀相匹配的試紙條置于步驟（4）所得的溶液上，吸收至血糖儀要求刻度，插入便攜式血糖儀進(jìn)行檢測。

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的紙芯片的尺寸如附圖1所示，紙芯片為邊長為20 mm 的正方形，親水性工作區(qū)域?yàn)槭侵睆綖? mm的圓形。

本發(fā)明所述的對紙芯片的親水區(qū)域功能化的步驟為：

合成金納米種子：量取100 mL二次水置于單口燒瓶中，加熱到96℃，隨后加入1 mL 1wt% 氯金酸溶液，反應(yīng)1min后，加入3.5 mL 1wt% 檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌12-18 min至溶液變?yōu)榫萍t色；

配置生長溶液：稱取0.0139g鹽酸羥溶于1 mL 水后放置于4 oC下待用；量取667 μL 1wt% 氯金酸溶液放置于4 oC下待用；

功能化紙芯片親水區(qū)域：移液槍量取100 μL 合成的金納米種子滴于親水區(qū)域，自然干燥，重復(fù)5次，二次水洗凈后將配置好的生長溶液迅速混合，隨后將混合后的溶液加到滴有金納米種子的親水工作區(qū)域，反應(yīng)10 min后二次水清洗，備用。

本發(fā)明的有益效果

（1）利用便攜式血糖儀，能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)物的準(zhǔn)確，快速測量。

（2）利用適配體技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對凝血酶的特異性識別。

（2）利用酶標(biāo)探針，可以實(shí)現(xiàn)將傳統(tǒng)的便攜式血糖儀用于非糖檢測。

（3）本發(fā)明所述方法檢測成本低、靈敏度高。

附圖說明

附圖1：紙芯片的疏水蠟打印圖案。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施。

實(shí)施例1：基于便攜式血糖儀的紙分析器件在凝血酶檢測中的應(yīng)用，其特征是包括以下步驟：

（1）在計(jì)算機(jī)上利用Adobe illustrator CS4軟件設(shè)計(jì)微流控紙芯片的疏水蠟打印圖案；

（2）將步驟（1）中設(shè)計(jì)的打印圖案通過蠟打印機(jī)打印在色譜紙上，隨后將打印過的A4色譜紙放置到平板加熱器或烘箱中，在100 oC下加熱100 s，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻；

（3）對步驟（2）中獲得的紙芯片的親水區(qū)域功能化：合成金納米種子，量取100 mL二次水置于單口燒瓶中，加熱到96℃，隨后加入1 mL 1wt% 氯金酸溶液，反應(yīng)1min后，加入3.5 mL 1wt% 檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌12-18 min至溶液變?yōu)榫萍t色，配置生長溶液：稱取0.0139g鹽酸羥溶于1 mL 水后放置于4 oC下待用；量取667 μL 1wt% 氯金酸溶液放置于4 oC下待用；功能化紙芯片親水區(qū)域，移液槍量取100 μL 合成的金納米種子滴于親水區(qū)域，自然干燥，重復(fù)5次，二次水洗凈后將配置好的生長溶液迅速混合，隨后將混合后的溶液加到滴有金納米種子的親水工作區(qū)域，反應(yīng)10 min后二次水清洗，備用；

（4）在步驟（3）中所得到金納米粒子修飾的工作區(qū)域上固定5′端帶有巰基的適配體鏈，隨后采用牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，使用濃度為0.01 M、pH 7.4的磷酸緩沖溶液清洗，備用；滴加20 μL 待檢測的凝血酶溶液，孵育35 min 后用磷酸緩沖溶液清洗；滴加20 μL蔗糖酶標(biāo)探針孵育45 min后用磷酸緩沖溶液清洗；滴加60 μL 濃度為1 M的蔗糖溶液，反應(yīng)1 h, 備用；

（5）用便攜式血糖儀相匹配的試紙條置于步驟（4）所得的溶液上，吸收至血糖儀要求刻度，插入便攜式血糖儀進(jìn)行檢測。

SEQUENCE LISTING

<110> 濟(jì)南大學(xué)

<120> 一種基于便攜式血糖儀檢測凝血酶的紙分析器件的構(gòu)建

<130> 2016

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工合成

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