本發(fā)明涉及一種人類IgG濃度的檢測方法，尤其涉及一種一抗—IgG—(二抗—MSN—酶復合物)三層夾心式結(jié)構(gòu)的構(gòu)建及其用于人類免疫球蛋白IgG濃度的檢測方法；屬于生物傳感技術領域。

背景技術：

IgG是一種免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)，是血清主要的抗體成分，約占血清Ig的75％。IgG的功能作用主要在機體免疫中起保護作用，大多數(shù)抗菌、抗病毒，能有效地預防相應的感染性疾病。其指標對于診斷某些疾病具有較大意義。

由于IgG較其他類Ig更易擴散到血管外的間隙內(nèi)，因而在結(jié)合補體、增強免疫細胞吞噬病原微生物和中和細菌毒素的能力方具有重要作用，能有效地抗感染。傳統(tǒng)的測定IgG的方法有熒光免疫分析、放射免疫法，電化學檢測法等。這些檢測方法雖然在一定程度上靈敏有效，但對技術要求高，耗時耗力，且對儀器有一定的要求，各自具有一定的局限性。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有的傳統(tǒng)檢測人類IgG的方法存在的不足，本發(fā)明的目的是在于提供一種選擇性好、靈敏度高、檢測限低、檢測范圍寬的檢測人類免疫球蛋白IgG濃度的方法。

為了實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明提供了一種人類IgG濃度的檢測方法，該方法包括以下步驟：

1)在介孔NH₂—二氧化硅納米粒子(MSN)載體上同時修飾葡萄糖氧化酶和二抗Ab₂，得到二抗—MSN—酶復合物；

2)將一抗Ab₁修飾在酶標板的各孔內(nèi)，再以乙醇胺溶液對酶標板進行封閉，得到一抗Ab₁修飾的酶標板；

3)取一系列不同濃度的標準IgG溶液分別加入至所述一抗Ab₁修飾的酶標板的各孔內(nèi)進行IgG與一抗Ab₁之間的特異性結(jié)合反應，得到結(jié)合了IgG的酶標板；

4)將所述二抗—MSN—酶復合物加入至結(jié)合了IgG的酶標板的各孔內(nèi)進行IgG與二抗Ab₁之間的特異性結(jié)合反應，得到含一抗—IgG—(二抗—MSN—酶復合物)三層夾心式結(jié)構(gòu)的酶標板；

5)向含一抗—IgG—(二抗—MSN—酶復合物)三層夾心式結(jié)構(gòu)的酶標板的各孔內(nèi)加入葡萄糖/Fe²⁺混合溶液進行反應后，再加入鄰二氮菲顯色劑，并檢測各孔內(nèi)溶液的吸光度值；

6)根據(jù)檢測得到的各孔內(nèi)溶液吸光度值與對應的標準IgG溶液濃度建立標準曲線；

7)取待測IgG溶液替換標準IgG溶液按3)、4)和5)的步驟進行操作，檢測得到吸光度值，依據(jù)標準曲線，即得待測IgG溶液的濃度。

優(yōu)選的方案，在介孔NH₂—二氧化硅納米粒子載體溶液中加入戊二醛溶液在室溫下反應，再加入葡萄糖氧化酶和二抗Ab₂，在3～5℃溫度下進行反應，即得二抗—MSN—酶復合物。戊二醛的作用是將葡萄糖氧化酶和二抗Ab₂固定在介孔NH₂—二氧化硅納米粒子載體上。

優(yōu)選的方案，先將一抗Ab₁溶液加入至酶標板的各孔內(nèi)在3～5℃溫度下過夜，再將乙醇胺溶液加入至酶標板的各孔內(nèi)在室溫下進行封閉，即得一抗Ab₁修飾的酶標板。更優(yōu)選的方案，將100μL、10μg/mL的一抗Ab₁溶液加入孔板4℃下過夜，用PBST作為洗滌液洗板2次，每孔加入150μL、1M乙醇胺溶液進行封閉，2～3h后洗板2次。

較優(yōu)選的方案，二抗Ab₂為山羊抗人IgG抗體。

較優(yōu)選的方案，一抗Ab₁為小鼠抗人IgG抗體。

較優(yōu)選的方案，所述介孔NH₂—二氧化硅納米粒子通過如下方法制備得到：將十六烷基三甲基溴化銨溶于氫氧化鈉溶液中后，加入正硅酸乙酯進行水解反應，得到二氧化硅納米粒子沉淀；將所述二氧化硅納米粒子沉淀懸浮于甲苯中后，與氨丙基三乙氧基硅烷在氮氣保護下，于75～80℃溫度下反應11～12h，反應所得產(chǎn)物與NH₄NO₃的乙醇溶液在55～60℃溫度下反應2～3h，即得。

優(yōu)選的方案，3)或4)中的特異性結(jié)合反應的條件為：溫度為36～37℃，時間為3～5h。

優(yōu)選的方案，將濃度分別為1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL和10μg/mL的一系列標準IgG溶液分別加入一抗Ab₁修飾的酶標板的各孔內(nèi)，進行特異性結(jié)合反應。

優(yōu)選的方案，葡萄糖/Fe²⁺混合溶液中亞鐵離子濃度為0.15～0.16mM、葡萄糖濃度為16～17mg/mL。

優(yōu)選的方案，吸光度值的檢測波長為490nm。

優(yōu)選的方案，酶標板為96孔聚苯乙烯酶標板。

優(yōu)選的方案，葡萄糖/Fe²⁺混合溶液為包含葡萄糖和Fe²⁺的醋酸緩沖溶液，醋酸溶液濃度為10mM。葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化作用下進行分解，產(chǎn)生H₂O₂與溶液中的Fe²⁺進行氧化還原反應，F(xiàn)e²⁺被氧化成Fe³⁺。

本發(fā)明的方案中，鄰二氮菲顯色劑與未被過氧化氫氧化的Fe²⁺反應形成橙紅色絡合物，使溶液顯色，有利于通過酶標儀對吸光度進行測定。

優(yōu)選的方案，2)中，將一抗Ab₁加入至酶標板的各孔內(nèi)修飾，一抗Ab₁以溶液形式加入，含一抗Ab₁溶液的體積為100μL，濃度為10μg/mL。

優(yōu)選的方案，5)中的反應條件為：在37℃溫度下反應3～5h。

本發(fā)明的檢測人類IgG濃度的方法以氨基介孔硅球納米粒子為載體構(gòu)建一抗—IgG—(二抗—MSN—酶復合物)三層夾心式結(jié)構(gòu)，將其用于檢測人類IgG濃度，具有選擇性好、靈敏度高、檢測限低，且檢測范圍寬等優(yōu)點。本發(fā)明的技術方案，首先進行氨基介孔硅球的合成，合成的硅球納米粒子由于帶-NH₂基團，能用于結(jié)合抗體和酶；將酶標板用一抗進行鋪板，用乙醇胺對孔板表面進行封閉，防止在孔板表面發(fā)生非特異性吸附；然后在板孔中加入IgG進行反應，鋪板一抗能與IgG進行特異性識別并結(jié)合；向孔板中加入二抗-MSN-酶復合物，被一抗捕獲的IgG能與MSN中二抗發(fā)生特異性結(jié)合；加入葡萄糖/Fe²⁺溶液，使MSN上的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖分解，產(chǎn)生H₂O₂將溶液中的Fe²⁺氧化成Fe³⁺，鄰二氮菲與剩余Fe²⁺形成橙紅色絡合物(Fe(phen)₃)²⁺；設置酶標儀檢測波長為490nm，對酶標板各孔吸光度進行檢測，吸光度與IgG的濃度呈反比，從而實現(xiàn)IgG溶液濃度的檢測。而在傳統(tǒng)的ELISA方法中，由于信號分子中酶鏈接數(shù)量不夠，通常致使檢測靈敏度和檢測限受限。而在本發(fā)明中合成的介孔硅球表面有豐富的-NH₂，作為載體能夠與上百個酶分子共價鏈接從而提高MSN表面酶和抗體數(shù)量，進而將信號放大、提高靈敏度、降低檢測限。通過加入不同濃度IgG經(jīng)酶標儀測量處理后得到標準曲線，該標準曲線為一條直線(如圖4)，IgG濃度越大酶標儀測得OD值越小；再加入未知濃度IgG形成夾心式結(jié)構(gòu)測量OD值，將該OD值與標準曲線進行比較得到未知濃度IgG的濃度。本發(fā)明的技術方案利用介孔NH₂—二氧化硅納米粒子含有的大量-NH₂，能結(jié)合大量酶以及抗體分子，促進信號放大，增強了靈敏度，降低了檢測限。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明技術方案的優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明的技術方案以氨基介孔硅球納米粒子為載體構(gòu)建一抗—IgG—(二抗—MSN—酶復合物)三層夾心式結(jié)構(gòu)，大大增加了抗體和酶載量，且與IgG之間通過特異性結(jié)合，促進信號放大，進而提高檢測靈敏度，降低檢測限，檢測范圍廣。

(2)本發(fā)明的技術方案可測濃度為1pg/mL-10μg/mL的IgG，而人類正常細胞中IgG的濃度為9.5～12.5mg/mL，當患變態(tài)反應性疾病、自身免疫性疾病、各種感染以及多發(fā)性骨髓瘤等時，免疫球蛋白可異常增高?；极@得性免疫缺陷綜合征等免疫缺損病時免疫球蛋白可異常降低，通過本發(fā)明的技術方案對經(jīng)過稀釋后患者血清具有足夠的檢測靈敏度。

(3)本發(fā)明的技術方法檢測范圍寬，無需借助精密儀器設備，并且可推廣至其他傳感器，用于對不同蛋白或小分子的濃度進行檢測。

附圖說明

【圖1】為本發(fā)明的檢測方法的原理示意圖；

【圖2】為介孔NH₂—二氧化硅納米粒子的TEM示圖；

【圖3】為實施例1中不同濃度IgG產(chǎn)生信號的顯色圖；

【圖4】為實施例1中不同濃度IgG對應OD值的標準曲線圖。

具體實施方式

為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合說明書附圖和較佳的實施例對本發(fā)明作更全面、細致地描述，但本發(fā)明的保護范圍并不限于以下具體的實施例。

除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術語與本領域技術人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護范圍。

除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設備等均可通過市場購買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。

實施例1

本發(fā)明人IgG的檢測方法的一種實施例，其原理示意圖如圖1所示。該檢測方法具體包括以下步驟：

(1)介孔NH₂—二氧化硅納米粒子(MSN)的合成：先將1g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶于480mL水和NaOH(2.00mol/L,3.5mL)混合液中，在80℃條件下攪拌30min使CTAB溶解，快速加入正硅酸乙酯(TEOS)(4.75g，22.83mmol)，反應2h后得到的沉淀懸浮于200mL無水甲苯中，與0.17mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)在氮氣保護下80℃回流攪拌12h，所得產(chǎn)物與NH₄NO₃0.6％的乙醇溶液60℃回流2h，得到載體NH₂—MSN。

(2)對NH₂—MSN進行修飾二抗和酶：50μL NH₂—MSN溶液加入2950μL、25％戊二醛中室溫下反應3h，離心洗滌去掉未反應的戊二醛，再將葡萄糖氧化酶(GOX)與二抗同時加入，(其中m二抗：m GOX＝1:75,)在4℃下反應過夜，次日離心去掉未反應的酶和抗體，得到二抗—MSN—酶。

(3)鋪板一抗及封閉：將100μL、10μg/mL的一抗溶液加入孔板4℃下過夜，用PBST作為洗滌液洗板2次，每孔加入150μL、1M乙醇胺溶液進行封閉，2h后洗板2次，得到修飾過一抗的酶標板。

(4)不同濃度人IgG特異性結(jié)合：將濃度為1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1μg/mL、10μg/mL的人IgG溶液分別加入酶標板板孔中，37℃水浴反應4h，PBST洗板3次除去未結(jié)合上的IgG，得到結(jié)合了不同濃度IgG的酶標板孔。

(5)IgG與MSN特異性結(jié)合：將100μL稀釋4倍的二抗-MSN-酶溶液加入酶標板中，在37℃水浴條件下反應4h，用10mM的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液洗板3次，除去未反應掉的二抗-MSN-酶，得到一抗—IgG—(二抗—MSN—酶)三層夾心式結(jié)構(gòu)。

(6)葡萄糖/Fe²⁺溶液與MSN反應：向形成三層夾心式結(jié)構(gòu)的酶標板孔中加入含有Fe²⁺的葡萄糖溶液進行反應，其中溶液亞鐵離子濃度為0.15mM、葡萄糖濃度為16.8mg/mL，37℃水浴反應10min。

(7)鄰二氮菲顯色：酶標板中加入20μL、15mM鄰二氮菲溶液顯色，與剩余Fe²⁺形成橙紅色絡合物，在490nm波長處用酶標儀測吸光度得到各孔的OD值，然后將各孔的OD值與對應的IgG濃度作標準曲線，得到測量IgG濃度的標準曲線。

(8)實際樣品的測量：取5pg/mL、500pg/mL、5ng/mL、50ng/mL人類IgG的血清溶液，加入修飾有一抗的酶標板中，反應完洗板，然后將100μL稀釋4倍的二抗-MSN-酶溶液加入酶標板中，在37℃水浴條件下反應4h，用10mM的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液洗板3次，除去未反應掉的MSN，得到一抗—IgG—(二抗—MSN—酶)三層夾心式結(jié)構(gòu)。加入葡萄糖/Fe²⁺溶液，37℃條件下反應10min，酶標板中加入20μL、15mM鄰二氮菲溶液顯色，與剩余Fe²⁺形成橙紅色絡合物，在490nm波長處用酶標儀測吸光度得到OD值，與標準曲線比對得到測量濃度值，測量濃度值與加標濃度值對比得到回收率為96％～103％。

(9)葡萄糖/Fe²⁺溶液與MSN反應:向形成三層夾心式結(jié)構(gòu)的酶標板孔中加入含有Fe²⁺的葡萄糖溶液進行反應，其中溶液亞鐵離子濃度為0.15mM、葡萄糖濃度為16.8mg/mL，37℃水浴反應10min。

(10)鄰二氮菲顯色：酶標板孔中加入20μL、15mM鄰二氮菲溶液顯色，與剩余Fe²⁺形成橙紅色絡合物，在490nm波長處測吸光度得到各孔的OD值，然后將該OD值與標準曲線進行對照，即測得所述未知濃度的人類IgG的濃度，該待測IgG的濃度即為標準曲線中測得的OD對應的橫坐標濃度值。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。