本發(fā)明涉及生物電化學(xué)免疫傳感器
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是導(dǎo)電玻璃電極的生物免疫電化學(xué)阻抗集成芯片傳感器的制作
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：電化學(xué)免疫傳感器是一種研究最早、種類最多的免疫傳感器，它是一種將電化學(xué)檢測技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的一種新型免疫傳感器。這種傳感器是將各種各樣的特異性抗原——抗體固定到電極的表面，通過固定化的分子識別物質(zhì)和分析物（或借助某些標(biāo)記物，如：酶或其他電活性化合物等）之間的免疫反應(yīng)，把抗原和抗體這種特異性結(jié)合的信息轉(zhuǎn)換為可檢測的電化學(xué)信號（電流或電位等）。根據(jù)測量信號的不同，電化學(xué)免疫傳感器大致可以分為電導(dǎo)型、電流型、電位型、電容型和阻抗型等多種類型的免疫傳感器。電化學(xué)阻抗譜分析方法（EIS）是可以用來檢測修飾有生物分子的電極界面的生物學(xué)反應(yīng)特性的電化學(xué)技術(shù)，是一種測量電極界面性質(zhì)的有效工具。阻抗型免疫傳感器的分析原理是基于抗原/抗體之間的特異性結(jié)合而降低了電活性探針分子同電極之間的電子轉(zhuǎn)移速率，即增加了電子轉(zhuǎn)移阻抗。通過測量免疫反應(yīng)前后電子轉(zhuǎn)移阻抗之差（Rct）可以實現(xiàn)高靈敏檢測的目的。電化學(xué)交流電阻抗譜法是電化學(xué)測試技術(shù)中一類重要的方法，該方法具有頻率范圍寬、對體系擾動小的特點，是研究電極過程動力學(xué)、電極界面現(xiàn)象以及測定固體電解質(zhì)電導(dǎo)率的有效工具。近年來，由于電化學(xué)阻抗生物傳感器具有制備簡便、成本低廉、易于封裝、快速實時和小型化監(jiān)測等特點，所以在微生物檢測、醫(yī)療診斷、藥物殘留、工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境檢測、食品分析等領(lǐng)域得到廣泛研究。在生物免疫電化學(xué)阻抗傳感器的制備過程中，選擇何種電極對生物免疫電化學(xué)阻抗傳感器的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、一致性、選擇性、成本高低等都影響其實用性。在傳統(tǒng)的電化學(xué)免疫阻抗傳感器研究中，大多是使用體積較大的固體電極，如金電極、鉑電極、玻碳電極、熱解石墨電極、銀電極等。這些電極不僅價格昂貴，使用前還需要復(fù)雜的預(yù)處理，不但難以保證電極的一致性，而且對目標(biāo)物的檢測結(jié)果重現(xiàn)性較差，是生物免疫電化學(xué)阻抗傳感器制備中的突出問題之一。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提出成本低、測定結(jié)果準(zhǔn)確的生物免疫電化學(xué)阻抗集成芯片傳感器的制作方法。本發(fā)明采用導(dǎo)電層為氧化銦錫的導(dǎo)電玻璃作為基質(zhì)，通過激光刻蝕，去除基質(zhì)上的部分氧化銦錫層，形成工作電極、對電極和參比電極。本發(fā)明制備的導(dǎo)電玻璃電極具有易微型化，集成化，檢測時耗樣量小、操作簡單，實際應(yīng)用性強(qiáng)，一般無需預(yù)處理，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠等諸多優(yōu)點而使生物免疫電化學(xué)阻抗傳感器商品化成為可能。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1、本發(fā)明方法簡單，只需通過電腦控制激光儀器，對導(dǎo)電玻璃進(jìn)行刻蝕，即可制作成三電極體系的導(dǎo)電玻璃電極；2、制成的導(dǎo)電玻璃電極可以根據(jù)需要制作出不同的尺寸；3、用該導(dǎo)電玻璃電極制成的生物免疫電化學(xué)阻抗集成芯片傳感器的檢測方法簡單、操作方便。附圖說明圖1是導(dǎo)電玻璃電極的示意圖。圖2是導(dǎo)電玻璃的阻抗圖。圖3是在導(dǎo)電玻璃上滴加修飾物后的阻抗變化圖。圖4是IgG抗原濃度與阻抗的相對變化值的線性圖。具體實施方式一、生物免疫電化學(xué)阻抗集成芯片傳感器電極的制作1、導(dǎo)電玻璃電極制作的預(yù)處理：將氧化銦錫導(dǎo)電玻璃切割至以下尺寸：長度為30mm、寬度為10mm。將切割好的導(dǎo)電玻璃依次用丙酮、乙醇、去離子水洗滌后，再將導(dǎo)電玻璃浸泡在1mol/L的鹽酸中，浸泡10min后用去離子水清洗。隨后，將導(dǎo)電玻璃浸泡在由體積比為1：1：5的H2O2、NH4OH和H2O組成的混合液中，浸泡時間為60min。最后將導(dǎo)電玻璃置于60℃烘箱中干燥，取得基質(zhì)材料——導(dǎo)電層為氧化銦錫的導(dǎo)電玻璃。2、導(dǎo)電玻璃電極的制作：先在電腦上使用autocad軟件繪制出導(dǎo)電玻璃的示意圖（如圖1所示），再用電腦（根據(jù)示意圖）控制激光儀器，對導(dǎo)電玻璃表面的部分氧化銦錫刻蝕，形成工作電極、對電極和參比電極，取得生物免疫電化學(xué)阻抗集成芯片傳感器電極。二、生物免疫電化學(xué)阻抗集成芯片傳感器電極的性能研究：電化學(xué)阻抗譜（EIS）是研究電極修飾過程中電極界面變化的一種有效的檢測手段。電化學(xué)阻抗譜圖是由半圓和直線兩部分組成，處于高頻的半圓部分對應(yīng)電子轉(zhuǎn)移的過程，即電極表面電子轉(zhuǎn)移的阻抗（Rct）等于半圓的直徑，而處于低頻的直線部分則對應(yīng)于擴(kuò)散過程，故可以用它來描述電極的界面性質(zhì)。將本發(fā)明制成的生物免疫電化學(xué)阻抗集成芯片傳感器電極置于含0.1mol/L氯化鉀的0.005mol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶中，開路電位：0V，取得導(dǎo)電玻璃的阻抗圖，如圖2所示。從圖2中可以看出采用本發(fā)明制成的導(dǎo)電玻璃電極的電化學(xué)阻抗譜圖由半圓和直線兩部分組成，這說明了導(dǎo)電玻璃電極是適合用于電化學(xué)阻抗測定的。三、以人免疫球蛋白（IgG）為例，對本發(fā)明以上工藝制作的生物免疫電化學(xué)阻抗集成芯片傳感器進(jìn)行測定：原料說明：本發(fā)明使用的鐵氰化鉀（AR）、亞鐵氰化鉀（AR）、磷酸氫二鈉（AR）、磷酸二氫鈉（AR）、硝酸鉀（AR）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。鏈霉親和素化的磁珠、生物素化的IgG抗體、IgG抗原購自江蘇省蘇北人民醫(yī)院。實驗中所用的水均為去離子水，autolab電化學(xué)工作站購自荷蘭autolab公司。1、溶液的配制：配制含0.1mol/L氯化鉀的0.005mol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀混合溶液：先將鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀混合，形成鐵氰化鉀含量為0.005mol/L的鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀混合溶液。再將氯化鉀加入鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀混合溶液中，形成氯化鉀含量為0.1mol/L的氯化鉀/鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀混合溶液。配制0.01mol/L磷酸緩沖溶液（PBS）（pH=7）。分別配制不同濃度的IgG（0.741、7.41、14.82、74.1、741、1482、11280ng/mL）。2、選用正面具有氧化銦錫的導(dǎo)電玻璃，先在超聲波中超洗干凈，并干燥，取得潔凈的導(dǎo)電玻璃基體。然后在導(dǎo)電玻璃基體的背面粘上一塊磁鐵，用來吸附磁珠與抗體的復(fù)合物。3、用移液槍分別移取120μL鏈霉親和素化的磁珠和120μL生物素化的IgG抗體到離心管中，在38℃的恒溫水浴槽中，溫浴30min，將鏈霉親和素化的磁珠與生物素化的IgG抗體結(jié)合，取得磁珠與抗體的復(fù)合物。將磁珠與抗體的復(fù)合物滴在導(dǎo)電玻璃基體的正面，用PBS緩沖液清洗電極表面，去除磁珠未吸附的抗體，將上述電極浸于氯化鉀/鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀混合溶液中，開路電位設(shè)為0V，頻率設(shè)為0.01～1000000Hz。用autolab電化學(xué)工作站測量阻抗R0。4、將上述處理的電極放置在1wt%BSA溶液中溫育60min，用于封閉電極上的非特異性活性位點。用PBS緩沖液清洗電極，將上述電極浸于含0.1mol/L氯化鉀的0.005mol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶中，開路電位設(shè)為0V，頻率設(shè)為0.01-1000000HZ，用autolab電化學(xué)工作站測量阻抗R1。5、用移液槍移取10μLIgG（0.741ng/mL）抗原滴在工作電極上，在38℃的恒溫水浴槽中，溫浴60min。用PBS緩沖液清洗電極，將上述電極浸于含0.1mol/L氯化鉀的0.005mol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶中，開路電位設(shè)為0V，頻率設(shè)為0.01-1000000Hz，用autolab電化學(xué)工作站測量其阻抗R2。同理，依次完成對其它濃度（7.41、14.82、74.1、741、1482、11280ng/mL）的電化學(xué)阻抗測定。6、計算加IgG抗原前后阻抗變化的相對值，公式如下：上式中：△：變化值。R1：1wt%BSA滴加在磁珠和IgG抗體復(fù)合物修飾的電極后的電化學(xué)阻抗值。R2：IgG抗原滴加在由1wt%BSA，磁珠－IgG抗體修飾后電極后的電化學(xué)阻抗值。7、在含0.1mol/L氯化鉀的0.005mol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶的阻抗圖,開路電位：0V（a）裸電極的阻抗圖,（b）在電極滴加上磁珠和IgG抗體復(fù)合物后的阻抗圖（c）滴加1%BSA后的阻抗圖（d）滴加IgG抗原后的阻抗圖。取得圖3的在導(dǎo)電玻璃上滴加修飾物后的阻抗變化圖。從圖3的電化學(xué)阻抗圖譜中可以看出電極的逐步修飾過程。裸導(dǎo)電玻璃電極的阻抗譜（曲線a）Rct很小，說明氧化還原探針在裸玻碳電極表面的Rct很小。固定上鏈霉親和素的磁珠和生物素化的IgG抗體復(fù)合物之后，Rct明顯增加（曲線b），這是由于抗體的分子結(jié)構(gòu)阻礙了電子的傳遞，它同時也證明鏈霉親和素的磁珠和生物素化的IgG抗體復(fù)合物成功地固定到了電極上。當(dāng)封閉了牛血清蛋白后，Rct變大（曲線c）。隨后，當(dāng)IgG抗原結(jié)合到單克隆抗體的修飾電極表面時，與曲線c相比，電化學(xué)反應(yīng)阻抗Rct（曲線d）明顯增大。這個結(jié)果可以說明IgG抗原與導(dǎo)電玻璃電極表面的單克隆抗體成功結(jié)合，形成了無活性電子和傳質(zhì)封閉層，極大地阻礙了鐵氰化物在玻碳電極表面的擴(kuò)散過程。8、圖4是使用original軟件，以IgG抗原濃度為橫坐標(biāo)，阻抗的相對變化值為縱坐標(biāo)作圖而得，通過線性擬合，得出下表。方程y=a+b*x權(quán)重不作權(quán)重殘差平方和43.34719校正的相關(guān)系數(shù)平方0.99976數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)誤差截距（b）43.823911.01804斜率（a）0.041452.26903×10-4用該導(dǎo)電玻璃電極制作的電化學(xué)阻抗免疫傳感器檢測IgG的線性范圍是0.0741~11280ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)0.99976，方程為y=43.82391+0.04145x。當(dāng)前第1頁1 2 3