本發(fā)明屬于微生物機(jī)理研究領(lǐng)域，尤其是涉及出芽短梗霉的GC-MS代謝組學(xué)研究的樣品處理方法。
背景技術(shù)：
聚蘋果酸是以蘋果酸為唯一單體合成的均聚高分子聚合物，具有優(yōu)良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等獨(dú)特性質(zhì)，其次，它作為一種水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、可化學(xué)衍生性。聚蘋果酸的這些性質(zhì)，使其在醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理以及香精香料等許多方面有著廣闊的應(yīng)用前景。生物法合成聚蘋果酸具有成本低、合成條件溫和、產(chǎn)物的分子量相對較高等優(yōu)點(diǎn)，因此生物法合成聚蘋果酸具有很好的開發(fā)前景。
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)又名“茁霉”、“芽生側(cè)茁霉”。出芽短梗霉形態(tài)特異，在發(fā)酵特點(diǎn)上與酵母菌細(xì)胞相似，又俗稱“黑酵母”。出芽短梗霉在發(fā)酵過程中能合成胞外多聚糖、PMLA、酶、抗菌素、單細(xì)胞蛋白等多種產(chǎn)物。目前國內(nèi)外有關(guān)出芽短梗霉合成聚蘋果酸的研究越來越多，但多數(shù)集中在菌株篩選以及發(fā)酵條件的優(yōu)化，目的是提高產(chǎn)量。有關(guān)發(fā)酵工藝的研究已經(jīng)比較成熟且進(jìn)入到瓶頸期，要想有所突破，還需從根本上解決問題。因此，對出芽短梗霉合成聚蘋果酸的代謝過程以及合成機(jī)理進(jìn)行研究具有深遠(yuǎn)的研究意義。本發(fā)明就是為這一工作做前期準(zhǔn)備，通過對樣品前處理的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，建立一種適用出芽短梗霉的獨(dú)特處理方法，為后期進(jìn)行GC-MS研究提供理論依據(jù)。
代謝物組學(xué)是無目的性、整體性地分析細(xì)胞對外界環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)變化做出響應(yīng)機(jī)制的過程，主要針對單一細(xì)胞或生物在一定的生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)低分子量代謝物。代謝物組學(xué)結(jié)合高通量的代謝物檢測與分離技術(shù)，對代謝物進(jìn)行定性和定量分析。目前，代謝物組學(xué)分析技術(shù)主要采用色譜法、質(zhì)譜法、紅外光譜法、核磁共振等分離分析手段及其組合。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）由于其檢測靈敏度高，精準(zhǔn)度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于代謝物組學(xué)的研究。目前，有許多研究是采用GC-MS方法進(jìn)行酵母菌、三孢布拉氏霉菌等菌株的代謝物分析，但在出芽短梗霉研究領(lǐng)域沒有相關(guān)的報(bào)道，由于不同的微生物在進(jìn)行GC-MS研究時(shí)菌體結(jié)構(gòu)不同，胞內(nèi)物質(zhì)也有差別，因此在進(jìn)行細(xì)胞破壁、代謝物提取等環(huán)節(jié)不能均一化，所以建立一種適合出芽短梗霉代謝組學(xué)研究的特有處理方法對機(jī)理研究是至關(guān)重要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明為解決以上問題，對這一方向進(jìn)行了相關(guān)研究并建立了完整的方法。本發(fā)明的目的是提供一種出芽短梗霉的GC-MS代謝組學(xué)研究的樣品處理方法，通過對菌體處理、樣品提取、衍生化等幾個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，建立一種適合出芽短梗霉代謝組學(xué)研究的特有處理方法。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室已成熟的完整發(fā)酵工藝，在發(fā)酵進(jìn)入到穩(wěn)定期時(shí)進(jìn)行取樣、菌體處理、代謝物提取和衍生等處理過程，為GC-MS檢測制作樣品。該方法為后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行出芽短梗霉代謝組學(xué)研究以及聚蘋果酸合成機(jī)理的研究提供了理論依據(jù)和前期工作。
本發(fā)明公開了一種基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS) 研究聚蘋果酸生產(chǎn)菌株出芽短梗霉代謝組學(xué)的樣品處理方法，通過發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵對數(shù)生長穩(wěn)定期的菌體，先離心（7000r/min，30s），除去發(fā)酵液中的CaCO3 ，再次離心（15000r/min，10min），棄上清液獲得菌體。然后用預(yù)冷的0.9%NaCl 洗菌體2次，經(jīng)過淬滅劑淬滅，液氮研磨，預(yù)冷的70%甲醇提取，冷凍干燥，衍生化等處理過程。將處理好的樣品進(jìn)行GC-MS檢測。本發(fā)明針對各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究，建立了一種適用于出芽短梗霉GC-MS研究中樣品處理部分的特有方法。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案具體如下：
一種出芽短梗霉的GC-MS代謝組學(xué)研究的樣品處理方法，包括以下步驟：
（1）通過發(fā)酵培養(yǎng)獲得出芽短梗霉菌體
1.1種子培養(yǎng)
將出芽短梗霉菌株活化2-3h，然后用無菌生理鹽水洗斜面菌株的孢子，制備孢子懸浮液。按照10%的接種量將孢子懸液轉(zhuǎn)接到含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml的擋板瓶中進(jìn)行培養(yǎng)；
1.2發(fā)酵培養(yǎng)
接種口在火焰保護(hù)下，將所得種子液以10%(v/v)的量接于裝有3L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
在發(fā)酵穩(wěn)定期即96h、120h、144h的任一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，獲得發(fā)酵液立即進(jìn)行處理；（由于進(jìn)行篩選方法的研究不是機(jī)理研究實(shí)驗(yàn)，因此，任選一點(diǎn)進(jìn)行取樣即可）；
（2）樣品制備
2.1樣品前處理
對不同時(shí)間點(diǎn)取得的發(fā)酵液進(jìn)行處理，首先離心（7000r/min，30s），除去發(fā)酵液中的CaCO3 ，再次離心（15000r/min，10min），棄上清液獲得菌體。然后用預(yù)冷的0.9%NaCl 洗菌體兩次，將菌體放入液氮中淬滅5-15min即可進(jìn)行破壁處理；經(jīng)過反復(fù)多次添加液氮進(jìn)行研磨，研磨20-30min，稱取研磨后的粉末150mg于1.5mL離心管中用于小分子代謝物的提取，提取時(shí)向液氮研磨后的樣品加入1mL預(yù)冷的70%甲醇，反復(fù)凍融三次，冷凍離心（10000r/min，10min），取200μL上清液加入20μL 1mg/mL 的丁二酸作為內(nèi)標(biāo)，然后進(jìn)行冷凍干燥；
2.2衍生化
將真空冷凍干燥后的樣品，加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解樣品，置于40℃水浴中，反應(yīng)90min；
加80 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），混合均勻，置于40℃水浴中，反應(yīng)90 min；
將衍生后的樣品10000 r/min冷凍離心10 min；取上清液200 μL加入進(jìn)樣瓶中，于室溫放置2 h，用于GC-MS檢測；
為了取得更好的技術(shù)效果，步驟（1）所述種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖 140g/L，酵母膏 3g/L，硫酸銨 1g/L，丁二酸 2g/L，玉米漿 0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO41g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余為蒸餾水。
為了取得更好的技術(shù)效果，步驟（1）所述種子培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為40h。
為了取得更好的技術(shù)效果，步驟（1）所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖 180g/L，蛋白胨 35g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaNO3 2g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KCl 0.5g/L， MnSO4 0.05g/L，CaCO3 20g/L，其余為蒸餾水。
為了取得更好的技術(shù)效果，步驟（1）所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速300r/min，通風(fēng)比1:2，罐壓0.1Mpa，發(fā)酵周期為144h。
本發(fā)明所用菌種來源：天津北洋百川生物技術(shù)有限公司申請專利名稱為一種惰性載體吸附固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)β-聚蘋果酸的方法，申請?zhí)?200910071171.2。該專利中公開了本發(fā)明所用菌種為出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號CGMCC3337。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：本發(fā)明針對出芽短梗霉GC-MS樣品處理的收集菌體、破壁提取胞內(nèi)物質(zhì)、提取物質(zhì)、衍生化等環(huán)節(jié)進(jìn)行了大量單因素實(shí)驗(yàn)，通過優(yōu)化建立了一種適用于出芽短梗霉氣相質(zhì)譜研究的方法。采用已建立方法進(jìn)行GC-MS檢測和分析時(shí)發(fā)現(xiàn)：首先，該方法分析后可以檢測到300多個(gè)物質(zhì)，包括氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸等不同類別的物質(zhì)；其次，該方法提取得到的樣品進(jìn)行GC-MS檢測時(shí)峰形比較穩(wěn)定，基線很平，峰的數(shù)量較多。因此綜合考慮譜圖的峰形、峰數(shù)、檢索結(jié)果的匹配度等多方面因素，該方法是用于出芽短梗霉GC-MS研究的最適方法。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種出芽短梗霉的GC-MS代謝組學(xué)研究的樣品處理方法，包括以下步驟：
（1）通過發(fā)酵培養(yǎng)獲得出芽短梗霉菌體
A、種子培養(yǎng)
將出芽短梗霉菌株活化2～3h，然后用無菌生理鹽水洗下斜面菌株的孢子，制備孢子懸浮液。按照10%的接種量將孢子懸液轉(zhuǎn)接到含有100ml種子培養(yǎng)基的500ml的擋板瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為40h。
種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖 140g/L，酵母膏 3g/L，硫酸銨 1g/L，丁二酸 2g/L，玉米漿 0.1v/v，K2CO3 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，KH2PO4 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，其余為蒸餾水。
B、發(fā)酵培養(yǎng)
接種口在火焰保護(hù)下，將所得種子液以10%(v/v)的量接于裝有3L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速300r/min，通風(fēng)比1:2，罐壓0.1Mpa，發(fā)酵周期為144h。
發(fā)酵培養(yǎng)基為：蔗糖 180g/L，蛋白胨 35g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaNO3 2g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KCl 0.5g/L， MnSO4 0.05g/L，CaCO3 20g/L，其余為蒸餾水。
在96h時(shí)進(jìn)行取樣，獲得發(fā)酵液立即進(jìn)行處理。
（2）樣品制備
A、樣品前處理
對不同時(shí)間點(diǎn)取得的發(fā)酵液進(jìn)行處理，首先離心（7000r/min，30s），除去發(fā)酵液中的CaCO3 ，再次離心（15000r/min，10min），棄上清液獲得菌體。然后用預(yù)冷的0.9%NaCl 洗菌體兩次，將菌體放入液氮中淬滅5min即可進(jìn)行破壁處理。經(jīng)過反復(fù)多次添加液氮進(jìn)行研磨，研磨20min，稱取研磨后的粉末150mg于1.5mL離心管中用于小分子代謝物的提取，提取時(shí)向液氮研磨后的樣品加入1mL預(yù)冷的70%乙醇，反復(fù)凍融三次，冷凍離心（10000r/min，10min），將取200μL上清液加入20μL 1mg/mL 的丁二酸作為內(nèi)標(biāo)。然后進(jìn)行冷凍干燥。
B、衍生化
將真空冷凍干燥后的樣品，加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解樣品，置于40℃水浴中，反應(yīng)60min；
加80 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），混合均勻，置于40℃水浴中，反應(yīng)60 min；
將衍生后的樣品10000 r/min冷凍離心10 min；取上清液200 μL加入進(jìn)樣瓶中，于室溫放置2 h，準(zhǔn)備進(jìn)行GC-MS檢測。
實(shí)施例2
一種出芽短梗霉的GC-MS代謝組學(xué)研究的樣品處理方法，包括以下步驟：
（1）通過發(fā)酵培養(yǎng)獲得出芽短梗霉菌體
發(fā)酵培養(yǎng)采用案例一的方法進(jìn)行即可。
（2）樣品制備
A、樣品前處理
對不同時(shí)間點(diǎn)取得的發(fā)酵液進(jìn)行處理，首先離心（7000r/min，30s），除去發(fā)酵液中的CaCO3 ，再次離心（15000r/min，10min），棄上清液獲得菌體。然后用預(yù)冷的0.9%NaCl 洗菌體兩次，將菌體放入液氮中淬滅10min即可進(jìn)行破壁處理。經(jīng)過反復(fù)多次添加液氮進(jìn)行研磨，研磨25min，稱取研磨后的粉末150mg于1.5mL離心管中用于小分子代謝物的提取，提取時(shí)向液氮研磨后的樣品加入1mL預(yù)冷的70%甲醇，反復(fù)凍融三次，冷凍離心（10000r/min，10min），將取200μL上清液加入20μL 1mg/mL 的丁二酸作為內(nèi)標(biāo)。然后進(jìn)行冷凍干燥。
B、衍生化
將真空冷凍干燥后的樣品，加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解樣品，置于40℃水浴中，反應(yīng)90min；
加80 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），混合均勻，置于40℃水浴中，反應(yīng)90 min；
將衍生后的樣品10000 r/min冷凍離心10 min；取上清液200 μL加入進(jìn)樣瓶中，于室溫放置2 h，準(zhǔn)備進(jìn)行GC-MS檢測。
實(shí)施例3
（1）通過發(fā)酵培養(yǎng)獲得出芽短梗霉菌體
發(fā)酵培養(yǎng)采用案例一的方法進(jìn)行即可。
（2）樣品制備
A、樣品前處理
對不同時(shí)間點(diǎn)取得的發(fā)酵液進(jìn)行處理，首先離心（7000r/min，30s），除去發(fā)酵液中的CaCO3 ，再次離心（15000r/min，10min），棄上清液獲得菌體。然后用預(yù)冷的0.9%NaCl 洗菌體兩次，將菌體放入液氮中淬滅15min即可進(jìn)行破壁處理。經(jīng)過反復(fù)多次添加液氮進(jìn)行研磨，研磨30min，稱取研磨后的粉末150mg于1.5mL離心管中用于小分子代謝物的提取，提取時(shí)向液氮研磨后的樣品加入1mL預(yù)冷的70%甲醇，反復(fù)凍融三次，冷凍離心（10000r/min，10min），將取200μL上清液加入20μL 1mg/mL 的丁二酸作為內(nèi)標(biāo)。然后進(jìn)行冷凍干燥。
B、衍生化
將真空冷凍干燥后的樣品，加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解樣品，置于40℃水浴中，反應(yīng)120min；
加80 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），混合均勻，置于40℃水浴中，反應(yīng)120 min；
將衍生后的樣品10000 r/min冷凍離心10 min；取上清液200 μL加入進(jìn)樣瓶中，于室溫放置2 h，準(zhǔn)備進(jìn)行GC-MS檢測。
實(shí)施例4
（1）通過發(fā)酵培養(yǎng)獲得出芽短梗霉菌體
發(fā)酵培養(yǎng)采用案例一的方法進(jìn)行即可。
（2）樣品制備
A、樣品前處理
對不同時(shí)間點(diǎn)取得的發(fā)酵液進(jìn)行處理，首先離心（7000r/min，30s），除去發(fā)酵液中的CaCO3 ，再次離心（15000r/min，10min），棄上清液獲得菌體。然后用預(yù)冷的0.9%NaCl 洗菌體兩次，將菌體放入液氮中淬滅10min即可進(jìn)行破壁處理。經(jīng)過反復(fù)多次添加液氮進(jìn)行研磨，研磨25min，稱取研磨后的粉末150mg于1.5mL離心管中用于小分子代謝物的提取，提取時(shí)向液氮研磨后的樣品加入1mL預(yù)冷的100%甲醇，反復(fù)凍融三次，冷凍離心（10000r/min，10min），將取200μL上清液加入20μL 1mg/mL 的丁二酸作為內(nèi)標(biāo)。然后進(jìn)行冷凍干燥。
B、衍生化
將真空冷凍干燥后的樣品，加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解樣品，置于40℃水浴中，反應(yīng)90min；
加80 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），混合均勻，置于40℃水浴中，反應(yīng)90 min；
將衍生后的樣品10000 r/min冷凍離心10 min；取上清液200 μL加入進(jìn)樣瓶中，于室溫放置2 h，準(zhǔn)備進(jìn)行GC-MS檢測。
本發(fā)明實(shí)施例結(jié)果：
本專利列舉的四個(gè)案例獲得的樣品，進(jìn)行相同的GC-MS檢測和分析的方法，從譜圖的譜圖的峰形、峰數(shù)、檢索結(jié)果的匹配度等多方面因素，得出結(jié)論：目前用于出芽短梗霉GC-MS研究的最適的樣品處理方法：以下為最優(yōu)實(shí)施例：
A、樣品前處理
對不同時(shí)間點(diǎn)取得的發(fā)酵液進(jìn)行處理，首先離心（7000r/min，30s），除去發(fā)酵液中的CaCO3 ，再次離心（15000r/min，10min），棄上清液獲得菌體。然后用預(yù)冷的0.9%NaCl 洗菌體兩次，將菌體放入液氮中淬滅10min即可進(jìn)行破壁處理。經(jīng)過反復(fù)多次添加液氮進(jìn)行研磨，研磨25min，稱取研磨后的粉末150mg于1.5mL離心管中用于小分子代謝物的提取，提取時(shí)向液氮研磨后的樣品加入1mL預(yù)冷的70%甲醇，反復(fù)凍融三次，冷凍離心（10000r/min，10min），將取200μL上清液加入20μL 1mg/mL 的丁二酸作為內(nèi)標(biāo)。然后進(jìn)行冷凍干燥。
B、衍生化
將真空冷凍干燥后的樣品，加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液（20 mg/mL），充分溶解樣品，置于40℃水浴中，反應(yīng)90min；
加80 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），混合均勻，置于40℃水浴中，反應(yīng)90 min；
將衍生后的樣品10000 r/min冷凍離心10 min；取上清液200 μL加入進(jìn)樣瓶中，于室溫放置2 h，準(zhǔn)備進(jìn)行GC-MS檢測。
以上對本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。