本發(fā)明涉及一種鹽酸克倫特羅化學(xué)發(fā)光法定量測定試劑盒，尤其涉及一種用于檢測牛、羊、禽、豬等畜禽的肝、腎、肌肉等組織樣本、尿液樣本中的鹽酸克倫特羅含量的化學(xué)發(fā)光法定量測定試劑盒；屬于免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鹽酸克倫特羅(Clenbuterol，CLB)又稱“瘦肉精”，是一種人工合成的腎上腺素受體選擇性激動劑，用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病。CLB能降低胴體脂肪沉積和增加肌肉的合成，曾被用作牛、羊、禽、豬等畜禽的促生長劑，使得瘦肉率提高，帶來更多經(jīng)濟(jì)價值。但是CLB會對人體造成毒副作用，故被列為禁用藥品。但是，由于養(yǎng)殖戶的非法使用或不遵守休藥期，是造成CLB超標(biāo)的主要原因。

目前最為常用的CLB檢測方法包括色譜法和免疫分析法。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等色譜方法操作步驟繁瑣，需要貴重儀器，所以一般在對陽性結(jié)果做出準(zhǔn)確判斷時使用。而免疫檢測法成本低、操作簡單，更適合大規(guī)模的普遍檢測，但是存在靈敏度低的問題。本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(CLEIA)將化學(xué)發(fā)光和酶聯(lián)免疫技術(shù)相結(jié)合，具有靈敏度高、線性范圍寬、分析方法更簡便快速、穩(wěn)定性強(qiáng)特點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種將化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫分析法結(jié)合，因此同時具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏性和免疫分析法的高特異性的鹽酸克倫特羅化學(xué)發(fā)光法定量測定試劑盒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種鹽酸克倫特羅化學(xué)發(fā)光法定量測定試劑盒，包括盒體，所述盒體內(nèi)設(shè)置有預(yù)包被化學(xué)發(fā)光板和試劑，所述試劑包括CLB系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液、CLB系列質(zhì)控品、HRP-抗CLB抗體、發(fā)光液A、發(fā)光液B和濃縮洗滌液。

所述預(yù)包被化學(xué)發(fā)光板的制備方法包括以下步驟：取乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學(xué)發(fā)光板，將CLB-HSA交聯(lián)復(fù)合物置于包被溶液中，混合均勻后吸取適量加入至化學(xué)發(fā)光板的微孔中，在37℃恒溫箱中放置2-2.5小時，完成包被過程，形成固相抗原；用稀釋過的所述濃縮洗滌液多次洗滌化學(xué)發(fā)光板；包被好的化學(xué)發(fā)光板再用封閉溶液封閉，在37℃恒溫箱中放置2-2.5小時，完成封閉過程。

所述包被溶液包括pH9.4-9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；所述包被溶液的濃度為0.95-1.05μg/mL；所述封閉溶液包括其中含BSA、4.8-5.2‰的P300的磷酸鹽緩沖液)，所述BSA溶液的濃度為9.8-10.2g/L。

所述濃縮洗滌液為20×洗滌液，所述20×洗滌液為含有0.99-1.01％吐溫-20的pH7.3-7.5，0.19-0.21mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮洗滌液使用時稀釋成1×洗滌液，所述1×洗滌液為含有0.045-0.055％吐溫-20的pH7.3-7.5，0.009-0.011mol/L的磷酸鹽緩沖液。

所述HRP-抗CLB抗體的制備方法包括以下步驟：取適量HRP溶解于蒸餾水中，加入適量新配的0.09-0.11M NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌18-22分鐘后裝入透析袋中，將透析袋置于1mM pH4.3-4.5的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；將透析袋中的HRP轉(zhuǎn)移至離心管中，取適量HRP加入適量標(biāo)記液和待標(biāo)記CLB抗體；標(biāo)記過程如下：在室溫避光條件下輕輕攪拌1.9-2.1小時后加適量新配的3.9-4.1mg/mLNaBH₄液，混勻，再3.8-4.2℃條件下放置1.9-2.1小時，而后轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的透析袋中，置于透析液中，并置在磁力攪拌器上進(jìn)行透析，透析液需4～6h更換一次，更換5次后即可收HRP-抗CLB抗體。

所述標(biāo)記液包括pH9.4-9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；所述透析液包括pH7.3-7.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉-氯化鈉-氯化鉀溶液。

所述發(fā)光液A為魯米諾含量為0.009-0.011M、對甲苯酚含量為0.0009-0.0011M，pH8.7-8.9的三(羥甲基)氨基甲烷溶液。

所述發(fā)光液B為每100mL溶液含檸檬酸2.05-2.15g，無水Na₂HPO₄ 2.81-2.83g，0.75％的過氧化氫脲0.63-0.65mL的水溶液。

CLEIA采用了競爭法，主要原理是將CLB-人血清白蛋白(CLB-HSA)交聯(lián)復(fù)合物包被于微孔板中形成固相抗原，在包被后的微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、樣品和HRP-抗CLB抗體反應(yīng)后，棄上清洗滌，最終形成固相抗原-抗CLB抗體復(fù)合物-HRP，加入發(fā)光液A、發(fā)光液B，立刻讀數(shù)獲得RLU值。在整個反應(yīng)過程中，樣品中CLB含量越高，反應(yīng)體系中發(fā)光強(qiáng)度越低；反之，樣品中CLB含量越少，發(fā)光強(qiáng)度越高。

本發(fā)明提供的CLB的CLEIA檢測試劑盒適用于用于檢測牛、羊、禽、豬等畜禽的肝、腎、肌肉等組織樣本、尿液樣本中的CLB含量，以及CLB中毒小鼠模型的肝、腎、肌肉等組織樣本中的CLB含量。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(CLEIA)將化學(xué)發(fā)光和酶聯(lián)免疫技術(shù)相結(jié)合，具有靈敏度高、線性范圍寬、分析方法更簡便快速、穩(wěn)定性強(qiáng)、高特異性、準(zhǔn)確度高等特點，與傳統(tǒng)的ELISA法比較，操作時間大幅度減少。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的原理圖；

圖2為本發(fā)明的工藝流程圖；

圖3為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。

實施例1

如圖1～圖3所示，一種鹽酸克倫特羅化學(xué)發(fā)光法定量測定試劑盒，包括盒體，所述盒體內(nèi)設(shè)置有預(yù)包被化學(xué)發(fā)光板和試劑，所述試劑包括CLB系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液、CLB系列質(zhì)控品、HRP-抗CLB抗體、發(fā)光液A、發(fā)光液B和濃縮洗滌液。

CLB的CLEIA檢測試劑盒的性能考察：用0、0.1、1、5、10、25、50μg/L的CLB標(biāo)準(zhǔn)品溶液建立起標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線考察該試劑盒性能，檢測限是指IC₁₀所對應(yīng)的濃度值。檢測范圍是指IC₁₅～I(xiàn)C₉₀所對應(yīng)的濃度值范圍。指靈敏度是指抑制率為50％時(IC50)的濃度。

該CLB的CLEIA檢測試劑盒的檢測范圍為0.2145～40.3928μg/L，理論最低檢測限為0.2145μg/L，靈敏度IC₅₀為2.1377μg/L。

CLB的CLEIA檢測試劑盒的交叉反應(yīng)性考察：分別用系列濃度梯度的鹽酸克倫特羅，萊克多巴胺，沙丁胺醇作為樣本，用本試劑盒檢測，獲得抑制率為50％時(IC₅₀)的濃度。交叉反應(yīng)率％＝IC₅₀(鹽酸克倫特羅)/IC₅₀(其他藥物)×100。

CLB的CLEIA檢測試劑盒的交叉反應(yīng)性如表1所示，與鹽酸克倫特羅，萊克多巴胺，沙丁胺醇幾乎無交叉反應(yīng)性。

表1CLB的化學(xué)發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的交叉反應(yīng)性

CLB的CLEIA檢測試劑盒的準(zhǔn)確度考察：根據(jù)CLB的CLEIA測定方法的檢測步驟，取定值樣本進(jìn)行檢測。重復(fù)測量3次后，其平均結(jié)果記為M，根據(jù)公式(1)計算測量濃度的相對偏差。

B＝(M-T)/T×100％ 式(1)

式(1)中：B代表相對偏差；M代表測量濃度3次結(jié)果的平均值；T代表定值樣本的濃度。

準(zhǔn)確度結(jié)果如表2所示，其相對偏差為5.67％，小于10％，顯示該試劑盒在檢測樣本時具有較好的準(zhǔn)確度：

表2：CLB的化學(xué)發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的準(zhǔn)確度

CLB的CLEIA檢測試劑盒的重復(fù)性考察：用兩個濃度水平的樣本各重復(fù)檢測10次，計算10次測量濃度結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)公式(2)得出變異系數(shù)CV。

CV＝SD/M×100％ 式(2)

式(2)中：CV代表變異系數(shù)；SD代表10次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差；M代表10次測量結(jié)果的平均值。

重復(fù)性結(jié)果如表3所示，變異系數(shù)CV均小于10％，顯示該試劑盒在檢測樣本時具有較好的重復(fù)性：表3：CLB的化學(xué)發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的重復(fù)性

CLB中毒小鼠模型的建立：隨機(jī)取6只小鼠雌雄各半作為陰性對照組，腹腔注射生理鹽水200μl。6只小鼠為高劑量模型組，每天1mg/kg腹腔注射，6只小鼠為低劑量模型組，每天0.5mg/kg腹腔注射，給藥3周，停止給藥后，20％烏拉坦，0.5ml腹腔注射麻醉，仰臥于解剖盤上，取肝、腎、肌肉。

取樣組織(0.5g)，加1mL 0.1mol/L高氯酸溶液勻漿振蕩提取5分鐘，再加入1mL PBS混勻，4℃、5000rpm離心30分鐘取全部上清用2M NaOH調(diào)pH為7.4。小鼠各組織的CLB檢測結(jié)果如表4所示。

表4化學(xué)發(fā)光酶免疫法(CLEIA)檢測CLB中毒小鼠組織中CLB濃度(n＝6)

本發(fā)明的CLB的CLEIA檢測試劑盒，包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的預(yù)包被化學(xué)發(fā)光板和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑，具體包括以下組成：

1.包被有CLB-HSA交聯(lián)復(fù)合物的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化學(xué)發(fā)光板，抗體包被濃度為1.0μg/mL。

2.CLB系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。濃度分別為：0、0.1、1、5、10、25、50μg/L。

3.CLB系列質(zhì)控品溶液。濃度分別為：25±5μg/L、1±0.2μg/L。

4.HRP-抗CLB抗體：是由CLB抗體與HRP偶合制成的偶聯(lián)物作為檢測抗體。

5.發(fā)光底物液。發(fā)光底物液分為發(fā)光液A和發(fā)光液B。發(fā)光液A液為化學(xué)發(fā)光底物(魯米諾)和發(fā)光增強(qiáng)劑(對甲苯酚溶液)，發(fā)光液B液為過氧化氫脲溶液。

6.濃縮洗滌液：濃縮洗滌溶液具體為含有吐溫-20(Tween-20)沖液的20倍濃縮磷酸鹽緩沖液，使用前用雙蒸水稀釋至工作濃度后使用，用于實驗過程中洗滌化學(xué)發(fā)光板。

本發(fā)明提供的CLB的CLEIA檢測試劑盒的制備過程，對本發(fā)明試劑盒檢測的靈敏度以及相關(guān)性能影響很大，其制備關(guān)鍵步驟如下：

1.預(yù)包被化學(xué)發(fā)光板的制備：用將CLB-HSA置于設(shè)定的包被溶液中，以設(shè)定的濃度，在37℃恒溫箱中反應(yīng)2小時包被。采用的抗體包被濃度為1.0μg/mL，采用的是pH＝9.5的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。微孔板中所包被的抗CLB抗體在堿性環(huán)境下可以很好的結(jié)合在微孔板塑料表面上，可以經(jīng)受多次洗板。包被好的微孔板可以用封閉溶液封閉，在37℃恒溫箱中反應(yīng)2小時封閉。

2.CLB系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：CLB抗原溶液濃度標(biāo)定是決定本發(fā)明中CLB測定范圍及靈敏度的重要因素。將CLB抗原溶液可以用抗原稀釋液稀釋成1:1000的工作濃度，而后按照倍比稀釋的方法稀釋抗原至終濃度為0、0.1、1、5、10、25、50μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3.CLB系列質(zhì)控溶液的制備：CLB質(zhì)控溶液濃度是本發(fā)明中檢測試劑盒實驗操作質(zhì)控的重要因素。將CLB抗原純品溶液用抗原稀釋液稀釋成1:1000的工作濃度，而后稀釋至終濃度為25μg/L、1μg/L的質(zhì)控溶液。

HRP-抗CLB抗體的制備：是由CLB抗體與HRP偶聯(lián)制成的偶聯(lián)復(fù)合物作為檢測抗體，適量5mg HRP溶解于1ml蒸餾水中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，裝入透析袋中，置于1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。取10μl HRP和80μl標(biāo)記液和10μl標(biāo)記抗體和室溫避光輕輕攪拌2小時，加0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄液，混勻，再置4℃2小時，而后轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的透析袋中，置于透析液中，置在磁力攪拌器上進(jìn)行透析，透析液需4～6h更換一次，更換5次后即可收抗體。

本發(fā)明提供的CLB的CLEIA檢測試劑盒中涉及的CLB標(biāo)準(zhǔn)品溶液、HRP-抗CLB抗體、化學(xué)發(fā)光溶液及洗滌溶液及其配方對本發(fā)明試劑盒檢測的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：

1、CLB標(biāo)準(zhǔn)品溶液：以既定方法將CLB純品用抗原稀釋液配制成濃度分別為0、0.1、1、5、10、25、50μg/L的CLB標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2、CLB系列質(zhì)控品溶液：以既定方法將CLB純品用抗原稀釋液配制成濃度分別為：25μg/L、1μg/L。

3、HRP-抗CLB抗體：是由CLB抗體與HRP偶合制成的偶聯(lián)物，所得HRP-抗CLB抗體用抗體稀釋液稀釋成1:1000的工作濃度作為檢測抗體。

4、抗原稀釋液：為含有BSA，蔗糖的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4，是每升含有20g BSA，50g蔗糖，16g NaCl，0.4g KCl，0.4g KH₂PO₄，5.8g Na₂HPO₄的水溶液。

5、抗體稀釋液：為含有BSA的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4，是每升含有20g BSA，16g NaCl，0.4g KCl，0.4g KH₂PO₄，5.8g Na₂HPO₄的水溶液。

6、化學(xué)發(fā)光溶液：A液為魯米諾含量為0.01M、對甲苯酚含量為0.001M，pH＝8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液，B液為每100mL溶液含檸檬酸2.1g，無水Na₂HPO₄ 2.82g，0.75％的過氧化氫脲0.64mL的水溶液。

7、濃縮洗滌液：20×洗滌液：0.99～1.01％吐溫-20的pH7.3～7.5，0.19～0.21mol/L的磷酸鹽緩沖液，此處的濃縮洗液就是20倍濃縮的洗滌液。

8、包被溶液：1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調(diào)節(jié)pH＝9.5。

9、封閉溶液：10g BSA溶于1L洗滌溶液中，再加入重量比為5‰的P300。

10、0.1M NaIO4溶液：稱取241mg高碘酸鈉溶于蒸餾水10ml中。

11、1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液：0.2M NaAc(1.361g溶于50ml蒸餾水)3.7ml，0.2M HAc(0.601ml溶于50ml蒸餾水)6.3ml加蒸餾水至2000ml。

12、NaBH₄溶液：臨用時稱取NaBH₄4mg溶于1ml蒸餾水中。

13、標(biāo)記液：1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調(diào)節(jié)pH＝9.5

14、透析液：0.24g磷酸二氫鈉、1.44g磷酸氫二鈉、8g氯化鈉、0.2g氯化鉀溶于1L水中，調(diào)節(jié)PH＝7.4。

本發(fā)明提供的CLB的CLEIA檢測試劑盒的測定方法的檢測步驟如下：

1、使用前，將試劑盒所有組分于室溫下放置20分鐘，濃縮洗滌液(20×)在使用前必須用純化水稀釋20倍，作為清洗液備用。

2、化學(xué)發(fā)光板使用前每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干)。重復(fù)此操作2次。

3、將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品或樣本各100μl分別加入化學(xué)發(fā)光板微孔中，再加入HRP-抗CLB抗體100μl，震蕩混勻后，用封板膜封板，37℃水浴30分鐘。

4、甩去化學(xué)發(fā)光板孔內(nèi)液體，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干)。重復(fù)此操作5次。

5、加入100μl發(fā)光液A和發(fā)光液B混合液(稀釋比為1:1)立刻置于化學(xué)發(fā)光儀上讀數(shù)，獲得RLU值。

6、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的RLU值和濃度為坐標(biāo)軸，選擇合適的數(shù)學(xué)模型建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本的RLU值，代入上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得出樣本濃度。

實施例2

如圖1～圖3所示，一種鹽酸克倫特羅化學(xué)發(fā)光法定量測定試劑盒，其特征在于：包括盒體，所述盒體內(nèi)設(shè)置有預(yù)包被化學(xué)發(fā)光板和試劑，所述試劑包括CLB系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液、CLB系列質(zhì)控品、HRP-抗CLB抗體、發(fā)光液A、發(fā)光液B和濃縮洗滌液。

所述預(yù)包被化學(xué)發(fā)光板的制備方法包括以下步驟：取乳白色不透明聚苯乙烯可拆卸96孔化學(xué)發(fā)光板，將CLB-HSA交聯(lián)復(fù)合物置于包被溶液中，混合均勻后吸取適量加入至化學(xué)發(fā)光板的微孔中，在37℃恒溫箱中放置2小時，完成包被過程，形成固相抗原；用稀釋過的濃縮洗滌液多次洗滌化學(xué)發(fā)光板；包被好的化學(xué)發(fā)光板再用封閉溶液封閉，在37℃恒溫箱中放置2小時，完成封閉過程。

所述包被溶液包括pH9.4的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；所述包被溶液的濃度為0.95μg/mL；所述封閉溶液包括其中含BSA、4.8‰的P300的磷酸鹽緩沖液)，所述BSA溶液的濃度為9.8g/L。

所述濃縮洗滌液為20×洗滌液，所述20×洗滌液為含有0.99％吐溫-20的pH7.3，0.19mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮洗滌液使用時稀釋成1×洗滌液，所述1×洗滌液為含有0.045％吐溫-20的pH7.3，0.009mol/L的磷酸鹽緩沖液。

所述HRP-抗CLB抗體的制備方法包括以下步驟：取適量HRP溶解于蒸餾水中，加入適量新配的0.09M NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌18分鐘后裝入透析袋中，將透析袋置于1mM pH4.3的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；將透析袋中的HRP轉(zhuǎn)移至離心管中，取適量HRP加入適量標(biāo)記液和待標(biāo)記CLB抗體；標(biāo)記過程如下：在室溫避光條件下輕輕攪拌1.9小時后加適量新配的3.9mg/mLNaBH₄液，混勻，再3.8℃條件下放置1.9小時，而后轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的透析袋中，置于透析液中，并置在磁力攪拌器上進(jìn)行透析，透析液需4h更換一次，更換5次后即可收HRP-抗CLB抗體。

所述標(biāo)記液包括pH9.4的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；所述透析液包括pH7.3的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉-氯化鈉-氯化鉀溶液。

所述發(fā)光液A為魯米諾含量為0.009M、對甲苯酚含量為0.0009M，pH8.7的三(羥甲基)氨基甲烷溶液。

所述發(fā)光液B為每100mL溶液含檸檬酸2.05g，無水Na₂HPO₄ 2.81g，0.75％的過氧化氫脲0.63mL的水溶液。

實施例3

如圖1～圖3所示，一種鹽酸克倫特羅化學(xué)發(fā)光法定量測定試劑盒，其特征在于：包括盒體，所述盒體內(nèi)設(shè)置有預(yù)包被化學(xué)發(fā)光板和試劑，所述試劑包括CLB系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液、CLB系列質(zhì)控品、HRP-抗CLB抗體、發(fā)光液A、發(fā)光液B和濃縮洗滌液。

所述預(yù)包被化學(xué)發(fā)光板的制備方法包括以下步驟：取乳白色不透明聚苯乙烯可拆卸96孔化學(xué)發(fā)光板，將CLB-HSA交聯(lián)復(fù)合物置于包被溶液中，混合均勻后吸取適量加入至化學(xué)發(fā)光板的微孔中，在37℃恒溫箱中放置2.5小時，完成包被過程，形成固相抗原；用稀釋過的濃縮洗滌液多次洗滌化學(xué)發(fā)光板；包被好的化學(xué)發(fā)光板再用封閉溶液封閉，在37℃恒溫箱中放置2.5小時，完成封閉過程。

所述包被溶液包括pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；所述包被溶液的濃度為1.05μg/mL；所述封閉溶液包括其中含BSA、5.2‰的P300的磷酸鹽緩沖液)，所述BSA溶液的濃度為10.2g/L。

所述濃縮洗滌液為20×洗滌液，所述20×洗滌液為含有1.01％吐溫-20的pH7.5，0.21mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮洗滌液使用時稀釋成1×洗滌液，所述1×洗滌液為含有0.055％吐溫-20的7.5，0.011mol/L的磷酸鹽緩沖液。

所述HRP-抗CLB抗體的制備方法包括以下步驟：取適量HRP溶解于蒸餾水中，加入適量新配的0.11M NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌22分鐘后裝入透析袋中，將透析袋置于1mM pH4.5的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；將透析袋中的HRP轉(zhuǎn)移至離心管中，取適量HRP加入適量標(biāo)記液和待標(biāo)記CLB抗體；標(biāo)記過程如下：在室溫避光條件下輕輕攪拌2.1小時后加適量新配的4.1mg/mLNaBH₄液，混勻，再4.2℃條件下放置2.1小時，而后轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的透析袋中，置于透析液中，并置在磁力攪拌器上進(jìn)行透析，透析液需6h更換一次，更換5次后即可收HRP-抗CLB抗體。

所述標(biāo)記液包括pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；所述透析液包括pH7.5的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉-氯化鈉-氯化鉀溶液。

所述發(fā)光液A為魯米諾含量為0.011M、對甲苯酚含量為0.0011M，pH8.9的三(羥甲基)氨基甲烷溶液。

所述發(fā)光液B為每100mL溶液含檸檬酸2.15g，無水Na₂HPO₄ 2.83g，0.75％的過氧化氫脲0.65mL的水溶液。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。