本發(fā)明屬于生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，同時(shí)還涉及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：心力衰竭(heartfailure)簡(jiǎn)稱心衰，是指由于心臟的收縮功能和(或)舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動(dòng)脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起心臟循環(huán)障礙癥候群，此種障礙癥候群集中表現(xiàn)為肺淤血、腔靜脈淤血。心力衰竭并不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，而是心臟疾病發(fā)展的終末階段。幾乎所有的心血管疾病最終都會(huì)導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生，心肌梗死、心肌病、血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷過重、炎癥等任何原因引起的心肌損傷，均可造成心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，最后導(dǎo)致心室泵血和(或)充盈功能低下。心衰患者5年的死亡率達(dá)50％，心衰是心血管領(lǐng)域最重要的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)心力衰竭發(fā)生的緩急，臨床可分為急性心力衰竭和慢性心力衰竭。根據(jù)心力衰竭發(fā)生的部位可分為左心、右心和全心衰竭。此外，心力衰竭還有收縮性或舒張性心力衰竭之分。心衰的診斷方式有心電圖、X線檢查、超聲心動(dòng)圖、動(dòng)脈血?dú)夥治?、血常?guī)和血生化檢查，如電解質(zhì)、腎功能、血糖、白蛋白及高敏C反應(yīng)蛋白。診斷心衰的標(biāo)志物指標(biāo)為B型利鈉肽(BNP)和N末端B型利鈉肽原(NT-proBNP)，檢測(cè)心肌受損的標(biāo)示物是心肌肌鈣蛋白T或I(CTnT或CTnI)等。其中B型利鈉肽(BNP)是診斷心衰的最重要指標(biāo)，但BNP作為心衰的標(biāo)志物存在如下不足：BNP會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)而增高，且女性高于男性；急性冠脈綜合征、肺部疾病、慢性腎功能不全等其他疾病也能導(dǎo)致BNP升高；肥胖者比非肥胖者BNP低；還有其他廣泛的生物學(xué)變異等等。人生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白(growthStimulationexpressedgene2),簡(jiǎn)稱ST2，ST2蛋白也是白介素I受體家族的成員，分為可溶性和跨膜型兩種。研究發(fā)現(xiàn)ST2蛋白有心臟組織表達(dá)，同時(shí)ST2蛋白的表達(dá)與損傷后的心臟纖維化反應(yīng)直接關(guān)聯(lián)。相對(duì)于其他心臟標(biāo)志物，ST2具有穩(wěn)定性高、生物變異度低的優(yōu)點(diǎn)，ST2是最新一代的心衰標(biāo)志物，反應(yīng)心肌纖維化，在評(píng)估心衰預(yù)后和危險(xiǎn)分級(jí)方面明顯優(yōu)于其他心衰生物標(biāo)志物。因此，提供一種用于檢測(cè)ST2的試劑盒及檢測(cè)方法，為心衰的預(yù)后和危險(xiǎn)分級(jí)判斷提供可靠的依據(jù)，對(duì)心力衰竭的診治將具有重大意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，采用雙抗體夾心法來實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析ST2指標(biāo)，具有高效、靈敏、高特異性的優(yōu)點(diǎn)，重復(fù)性和可靠性良好，可以為心衰的預(yù)后和危險(xiǎn)分級(jí)判斷提供可靠的依據(jù)。本發(fā)明的目的還在于提供一種用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，包括：包被ST2抗體ab89728的微孔板、ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525、分析緩沖液、發(fā)光底物CSPD、洗滌液、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；所述分析緩沖液為：在0.05M/L、pH值為8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成的混合溶液，混合溶液中BSA的質(zhì)量百分比濃度為1％；所述洗滌液為：在0.05M/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中添加吐溫20形成的混合溶液，混合溶液中吐溫20的質(zhì)量百分比濃度為0.05％；所述質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為重組ST2蛋白ab166883。一種用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的制備方法，包括：包被ST2抗體ab89728的微孔板通過以下步驟制備：把抗ST2抗體ab89728用包被緩沖液稀釋至0.05～3微克/微升，制得抗體包被液，向微孔板的每孔中加入50微升的所述抗體包被液，然后置于37℃包被2小時(shí)，之后用生理鹽水沖洗三次，然后再向所述微孔板的每孔中加入100微升的封板液，之后置于室溫封閉2小時(shí)，再用生理鹽水沖洗兩次，制得包被ST2抗體ab89728的微孔板；ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525通過以下步驟制備：取0.5～3毫克的ALP、1～4毫克的ab196525抗體，加入PBS緩沖液，在磁力攪拌下，再加入0.05毫升戊二醛，得到混合液，混合液的總體積控制為0.5毫升，所述混合液室溫?cái)嚢?5分鐘，之后避光反應(yīng)4小時(shí)，然后向所述混合液中加入0.1M/L的乙醇胺，室溫?cái)嚢?小時(shí)，之后用PBS緩沖液在4℃下透析過夜，得到透析液，所述透析液與等質(zhì)量的甘油混合，然后向透析液與甘油形成的混合物中加入質(zhì)量百分比濃度為0.1％的NaN3溶液，制得ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525；分析緩沖液配制方法：在0.05M/L、pH值為8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的質(zhì)量百分比濃度為1％；洗滌液配制方法：在0.05M/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中添加吐溫20形成混合溶液，混合溶液中吐溫20的質(zhì)量百分比濃度為0.05％；質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品采用重組ST2蛋白ab166883。優(yōu)選的，所述的包被緩沖液為0.05M/L、pH值為9.0的碳酸鹽緩沖液。優(yōu)選的，所述的封板液配制方法為：向0.05M/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的質(zhì)量百分比濃度為1％。一種權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的應(yīng)用，包括以下步驟：S1：用含有BSA的質(zhì)量百分比濃度為0.1％的PBS緩沖液作為稀釋液，將質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品重組ST2蛋白ab166883稀釋制成具有系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；S2：向包被ST2抗體ab89728的微孔板的孔中，分別加入具有系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)樣本溶液，具有系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)樣本溶液的加入量均為50微升，然后再向孔中加入50微升ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525工作溶液，震蕩均勻之后在37℃溫育1小時(shí)，然后用洗滌液沖洗5次，在吸水紙上控干，再加入底物工作液和分析緩沖液各50微升，室溫避光反應(yīng)10分鐘后，在發(fā)光儀上測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度；S3：根據(jù)系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度和測(cè)得的發(fā)光強(qiáng)度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣本溶液的發(fā)光強(qiáng)度值，通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得出待測(cè)樣本溶液的濃度。優(yōu)選的，步驟S1中，所述稀釋液中BSA的質(zhì)量百分比濃度為1％。優(yōu)選的，步驟S2中，ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525工作溶液的配制方法為：將ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525與水按照體積比：ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525:水＝1:2000稀釋制得。優(yōu)選的，步驟S2中，所述底物工作液的配制方法為：將500～800微升的二乙醇胺、100微升1M/L的NaOH溶液、100微升1M/L的MgCl2溶液及100微升質(zhì)量百分比濃度為10％的NaN3溶液混勻，高壓蒸汽滅菌，制得底物緩沖液；取所述底物緩沖液800微升，加入200微升的增強(qiáng)劑和50微升的發(fā)光底物CSPD，滅菌容器內(nèi)混勻，制得底物工作液?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)是將高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)和高選擇性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、蛋白質(zhì)、維生素、藥物等的檢測(cè)分析，是繼酶免、放免、熒光、時(shí)間分辨熒光分析之后發(fā)展起來的一項(xiàng)免疫測(cè)定技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)早在19世紀(jì)八十年代就得到了證實(shí)，即在化學(xué)反應(yīng)中以釋放光子的形式釋放能量，以標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)發(fā)光劑為示蹤物信號(hào)建立起來的非放射免疫分析技術(shù)，也是現(xiàn)在最先進(jìn)的免疫分析技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析(ChemiluminescentEnzymeImmunoassay,CLEIA)屬于酶免疫分析，只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免疫分析完全相同，以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。在酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析中可供標(biāo)記的酶很多，目前較為常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，采用雙抗體夾心法來實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析ST2指標(biāo)，方便快捷，具有高效、靈敏、高特異性的優(yōu)點(diǎn)，重復(fù)性和可靠性良好，可用于心臟衰竭患者的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，通過檢測(cè)患者ST2水平來監(jiān)控患者對(duì)心衰治療效果的反應(yīng)，協(xié)助提供最適合的治療方案，可以為心衰的預(yù)后和危險(xiǎn)分級(jí)判斷提供可靠的依據(jù)。附圖說明圖1是本發(fā)明實(shí)施例2中繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，y＝1.108-1.029/[1+(x/11.4)0.9]。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1一種用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，包括：包被ST2抗體ab89728的微孔板、ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525、分析緩沖液、發(fā)光底物CSPD、洗滌液、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；其中分析緩沖液為：在0.05M/L、pH值為8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成的混合溶液，混合溶液中BSA的質(zhì)量百分比濃度為1％；洗滌液為：在0.05M/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中添加吐溫20形成的混合溶液，混合溶液中吐溫20的質(zhì)量百分比濃度為0.05％；質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為重組ST2蛋白ab166883。ST2抗體ab89728、抗ST2抗體ab196525、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品重組ST2蛋白ab166883均購(gòu)自Abcam公司。該用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒通過以下制備方法進(jìn)行構(gòu)建，具體為：包被ST2抗體ab89728的微孔板通過以下步驟制備：把抗ST2抗體ab89728用包被緩沖液稀釋至0.05～3微克/微升，制得抗體包被液，向微孔板的每孔中加入50微升的抗體包被液，然后置于37℃包被2小時(shí)，之后用生理鹽水沖洗三次，然后再向微孔板的每孔中加入100微升的封板液，之后置于室溫封閉2小時(shí)，再用生理鹽水沖洗兩次，制得包被ST2抗體ab89728的微孔板，冷凍干燥，密封于鋁箔袋中，4℃保存?zhèn)溆?；ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525通過以下步驟制備：取0.5～3毫克的ALP、1～4毫克的ab196525抗體，加入PBS緩沖液，在磁力攪拌下，再加入0.05毫升戊二醛，得到混合液，混合液的總體積控制為0.5毫升，所述混合液室溫?cái)嚢?5分鐘，之后避光反應(yīng)4小時(shí)，然后向混合液中加入0.1M/L的乙醇胺，室溫?cái)嚢?小時(shí)，之后用PBS緩沖液在4℃下透析過夜，得到透析液，透析液與等質(zhì)量的甘油混合，然后向透析液與甘油形成的混合物中加入質(zhì)量百分比濃度為0.1％的NaN3溶液，制得ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525，4℃保存?zhèn)溆茫环治鼍彌_液配制方法：在0.05M/L、pH值為8.0的Tris-Hcl溶液中添加BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的質(zhì)量百分比濃度為1％；洗滌液配制方法：在0.05M/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中添加吐溫20形成混合溶液，混合溶液中吐溫20的質(zhì)量百分比濃度為0.05％；質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品采用重組ST2蛋白ab166883。其中，包被緩沖液為0.05M/L、pH值為9.0的碳酸鹽緩沖液。封板液配制方法為：向0.05M/L、pH值為7.4的PBS緩沖液中加入BSA形成混合溶液，混合溶液中BSA的質(zhì)量百分比濃度為1％。各緩沖液均用0.2％的NaN3溶液防腐。實(shí)施例2本發(fā)明實(shí)施例1提供的用于檢測(cè)ST2的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的應(yīng)用，包括以下步驟：S1：用含有BSA的質(zhì)量百分比濃度為0.1％的PBS緩沖液作為稀釋液，將質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品重組ST2蛋白ab166883稀釋制成具有系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，例如標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為0.1納克/毫升、10納克/毫升……2000納克/毫升；S2：向包被ST2抗體ab89728的微孔板的孔中，分別加入具有系列濃度梯度的各標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)樣本溶液，具有系列濃度梯度的各標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)樣本溶液的加入量均為50微升，然后再向孔中加入50微升ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525工作溶液，震蕩均勻之后在37℃溫育1小時(shí)，然后用洗滌液沖洗5次，在吸水紙上控干，再加入底物工作液和分析緩沖液各50微升，室溫避光反應(yīng)10分鐘后，在發(fā)光儀上測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度；S3：根據(jù)系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度和測(cè)得的發(fā)光強(qiáng)度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖1，然后根據(jù)待測(cè)樣本溶液的發(fā)光強(qiáng)度值，通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得出待測(cè)樣本溶液的濃度。其中，步驟S1中，稀釋液中BSA的質(zhì)量百分比濃度為1％。步驟S2中，ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525工作溶液的配制方法為：將ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525與水按照體積比：ALP標(biāo)記抗ST2抗體ab196525:水＝1:2000稀釋制得。步驟S2中，底物工作液的配制方法為：將600微升的二乙醇胺、100微升1M/L的NaOH溶液、100微升1M/L的MgCl2溶液及100微升質(zhì)量百分比濃度為10％的NaN3溶液混勻，高壓蒸汽滅菌，制得底物緩沖液；取底物緩沖液800微升，加入200微升的增強(qiáng)劑(購(gòu)自BIO-RAD公司)和50微升的發(fā)光底物CSPD，滅菌容器內(nèi)混勻，制得底物工作液。該試劑盒的線性范圍和檢測(cè)限。測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖1，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線可以看出試劑盒有著非常好的線性范圍，10納克/毫升～900納克/毫升。檢測(cè)限為0.1納克/毫升。試劑盒批間差＜14％，批內(nèi)差＜7％。陽性參考值＞35納克/毫升。具體的，用本發(fā)明實(shí)施例1提供的試劑盒分別對(duì)取自河南省鄭大一附院的急性、慢性心衰樣本各20例進(jìn)行ST2蛋白的測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果分別見表1和表2。表1急性心衰樣本實(shí)測(cè)病例表2慢性心衰樣本實(shí)測(cè)病例樣品編號(hào)ST2蛋白測(cè)定結(jié)果(納克/毫升)19823937644355466174886696910541187121191313514921575164317361863198120101以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3