基于三螺旋DNA分子開關(guān)檢測(cè)啶蟲脒的方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

啶蟲脒(acetamiprid)屬于氯化煙酰亞胺類高效殺蟲劑，它多用于控制多種農(nóng)產(chǎn)品，如果蔬、茶葉等上的半翅目、鞘翅目及鱗翅目害蟲。啶蟲脒是一種神經(jīng)性殺蟲劑，它通過作用害蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，達(dá)到殺蟲的效果。研究表明低濃度啶蟲脒對(duì)蜜蜂的長(zhǎng)期記憶有損傷并且會(huì)影響蜜蜂對(duì)刺激的靈敏度。同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)啶蟲脒對(duì)人體外周血淋巴細(xì)胞存在基因毒性以及細(xì)胞毒性，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞存在慢性毒性，表明了它可能誘發(fā)DNA損傷。啶蟲脒在日本、南美洲和歐洲等不同國(guó)家和地區(qū)不同作物中官方規(guī)定的最大殘留劑量(MRL)也不同。鑒于啶蟲脒對(duì)于多數(shù)昆蟲以及其人體細(xì)胞的影響，需要對(duì)其使用量進(jìn)行有效的監(jiān)控，控制其使用量和使用方法從而減少或避免濫用致使對(duì)益蟲和人類造成不良影響。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于啶蟲脒的檢測(cè)方法主要有：氣相色譜分析-電子捕獲檢測(cè)器(GC-ECD)的檢測(cè)方法、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，以及基質(zhì)固相分散-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。

高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜分析(GC)能滿足分析要求，但所用儀器通常較為昂貴且復(fù)雜，對(duì)操作人員的儀器操作技能要求比較高，與此同時(shí)樣品準(zhǔn)備耗時(shí)較高、成本高；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雖然較為快速簡(jiǎn)單，但抗干擾能力差；電化學(xué)法具有反應(yīng)快速，成本較低的優(yōu)點(diǎn)，但由于啶蟲脒是一種電化學(xué)惰性分子，故而實(shí)驗(yàn)靈敏度不高。以上所述的GC-ECD和ELISA，雖然這些檢測(cè)方法具有很好的靈敏度，但是它們?nèi)狈^高的實(shí)時(shí)檢測(cè)性能。因此十分有必要進(jìn)一步研究靈敏簡(jiǎn)便、易于操作、選擇性高且適用于實(shí)際樣品快速檢測(cè)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是基于三螺旋DNA分子開關(guān)檢測(cè)啶蟲脒，利用核酸適體的特異性識(shí)別和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的優(yōu)勢(shì)從而提供一種快速檢測(cè)啶蟲脒的方法，達(dá)到快速、簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)啶蟲脒的殘留量。

技術(shù)問題：基于三螺旋DNA分子開關(guān)檢測(cè)啶蟲脒的方法主要為下述原理：

在STP的5’和3’端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)(carboxyfluorescein,FAM)和猝滅基團(tuán)(black hole quencher 1,BHQ1)。在自然狀態(tài)下,STP序列折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，標(biāo)記熒光基團(tuán)的5’端和標(biāo)記猝滅基團(tuán)的3’端靠近，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移FAM的熒光會(huì)被猝滅；由于核酸適配體(核酸適配體)的兩端延長(zhǎng)部分可以與STP環(huán)部的堿基序列通過Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對(duì)結(jié)合，形成一個(gè)能特異性結(jié)合目標(biāo)物的三螺旋分子開關(guān)，STP探針部分修飾的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，從而使FAM的熒光恢復(fù)；當(dāng)加入目標(biāo)物之后，核酸適配體能夠特異性的識(shí)別目標(biāo)物并與目標(biāo)物作用形成特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這個(gè)三螺旋DNA將會(huì)解開，STP將從中脫離，恢復(fù)為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由于標(biāo)記熒光基團(tuán)的5’端與標(biāo)記猝滅基團(tuán)的3’端靠近，F(xiàn)AM的熒光因被猝滅而減弱。本研究所建立的基于三螺旋DNA分子開關(guān)的傳感方法，通過目標(biāo)物與識(shí)別元件的作用，調(diào)控三螺旋DNA以及信號(hào)探針的構(gòu)型來控制FAM與BHQ1的距離，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物啶蟲脒的檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

包括以下步驟：STP的解旋；三螺旋DNA分子開關(guān)的組裝；通過測(cè)定熒光光譜圖觀察STP、核酸適配體、三螺旋DNA分子開關(guān)和目標(biāo)物啶蟲脒體系的反應(yīng)；利用目標(biāo)物對(duì)三螺旋DNA分子開關(guān)的熒光作用效果檢測(cè)啶蟲脒并進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)。

(1)STP的解旋

將合成好的引物STP用純凈水溶解成濃度為1μM的溶液，取50μL，在60℃的水浴鍋里水浴10min，取出后冷卻到室溫條件下，待用。

(2)三螺旋DNA分子開關(guān)(THMS)的組裝

離心管中加入1μM解旋的STP溶液50μL、6μM核酸適配體50μL以及10mM的磷酸鹽緩沖溶液400μL(磷酸鹽緩沖溶液中含有300mM NaCl,2.5mM MgCl₂和0.1mM EDTA)，該混合體系放置在30℃的水浴鍋中水浴20min，取出后冷卻至室溫。

利用RF-5301熒光分光光度儀測(cè)定未解旋的STP以及THMS的熒光信號(hào)強(qiáng)度，熒光信號(hào)分別為F₀和F₁

(3)通過測(cè)定熒光光譜圖觀察適配體、三螺旋分子開關(guān)和啶蟲脒體系的反應(yīng)

取3個(gè)2.0mL的離心管，編號(hào)為a,b,c，分別依次加入，a管(1μM STP 50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液450μL),b管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液400μL),c管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM啶蟲脒50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL),在480nm的激發(fā)波長(zhǎng)條件下測(cè)定熒光吸收光譜。(注：a管為未解旋的STP，b管為組裝的THMS)

(4)利用目標(biāo)物對(duì)三螺旋DNA分子開關(guān)的熒光作用效果檢測(cè)啶蟲脒所用體系的制備

向含有1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL的混合體系中，分別加入不同濃度的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫條件下反應(yīng)12min后，測(cè)定該體系的熒光信號(hào)強(qiáng)度，THMS的熒光信號(hào)強(qiáng)度將隨著啶蟲脒濃度的不同而發(fā)生變化。根據(jù)F₁-F₂與啶蟲脒的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。(F₁和F₂分別為加入啶蟲脒之前和之后的熒光信號(hào)強(qiáng)度)

所用的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：1,2,4,6,8,10,12μM(終濃度分別為100,200,400,600,800,1000,1200nM)。本發(fā)明中，啶蟲脒的檢出限為9.12nM，線性范圍為1-12nM。

(5)選擇性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定：

取9個(gè)2.0mL的離心管，編號(hào)為a～i，分別依次加入，a～i管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM待測(cè)物質(zhì)50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL，待測(cè)物質(zhì)依次為吡蟲啉、毒死蜱、2,4-D，草銨膦，甲胺磷，西維因，莠去津，尼古丁和啶蟲脒),在480nM的激發(fā)波長(zhǎng)條件下測(cè)定熒光吸收光譜。

(6)干擾性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定：

取10個(gè)2.0mL的離心管，編號(hào)為1-10，分別依次加入，1管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM啶蟲脒50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL),2～10管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM啶蟲脒50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL，除此之外分別加入抗壞血酸(0.18mol·L^-1)；Na⁺(0.26mol·L^-1)；Mg²⁺(0.08mol·L^-1)；Ca²⁺(0.42mol·L^-1)；Fe³⁺(3.20mol·L^-1)；K⁺(0.44mol·L^-1)；4-羥基苯甲酸(0.20mol·L^-1)；龍膽酸(0.18mol·L^-1)；沒食子酸(0.26mol·L^-1)),在480nm的激發(fā)波長(zhǎng)條件下測(cè)定熒光吸收光譜。

(7)實(shí)際樣品的檢測(cè)：取大白菜進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)

稱取5g(精確到0.01g)大白菜勻漿，置于30mL具塞離心管中，加入5mL乙酸-乙腈溶液，搖勻，超聲提取15min，加入5g氯化鈉，蓋上塞子，震蕩5min，4000r/min離心5min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶解在2mL娃哈哈純凈水中，水溶液用于實(shí)際樣品的分析；分析中，將提取的水溶液稀釋20倍，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如權(quán)利要求4所述的方法，加入不同濃度的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明組裝了三螺旋NDA分子開關(guān)，并建立了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速、靈敏的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的方法，能夠快速檢測(cè)啶蟲脒，為今后的監(jiān)管提供了方便。

附圖說明

圖1不同體系的熒光光譜圖：a,STP；b,STP-核酸適配體；c,STP-核酸適配體-啶蟲脒；STP 1μM 50μL，核酸適配體6μM 50μL,啶蟲脒2μM 50μL；

圖2含有不同濃度的啶蟲脒(1,2,4,6,8,10,12μM)的三螺旋DNA分子開關(guān)體系的熒光光譜圖以及以該體系為參照的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖3三螺旋DNA分子開關(guān)體系對(duì)不同種農(nóng)藥的熒光信號(hào)強(qiáng)度響應(yīng)圖譜：a～i管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM待測(cè)物質(zhì)50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL，待測(cè)物質(zhì)依次為吡蟲啉、毒死蜱、2,4-D，草銨膦，甲胺磷，西維因，莠去津，尼古丁和啶蟲脒)

圖4三螺旋DNA分子開關(guān)體系對(duì)白菜提取液中干擾物質(zhì)的熒光信號(hào)強(qiáng)度響應(yīng)圖譜：1管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM啶蟲脒50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL),2～10管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM啶蟲脒50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL，除此之外分別加入抗壞血酸(0.18mol·L^-1)；Na⁺(0.26mol·L^-1)；Mg²⁺(0.08mol·L^-1)；Ca²⁺(0.42mol·L^-1)；Fe³⁺(3.20mol·L^-1)；K⁺(0.44mol·L^-1)；4-羥基苯甲酸(0.20mol·L^-1)；龍膽酸(0.18mol·L^-1)；沒食子酸(0.26mol·L^-1))

圖5實(shí)際樣品白菜提取液中含有不同濃度的啶蟲脒(1,2,4,6,8,10μM)的三螺旋DNA分子開關(guān)體系的熒光光譜圖以及以該體系為參照的實(shí)際樣品工作曲線圖。

具體實(shí)施方式

STP的解旋

材料/試劑：STP由生工生物(上海)試劑公司合成

方法：將合成好的引物STP用純凈水溶解成濃度為1μM的溶液，取50μL，在60℃的水浴鍋里水浴10min，取出后冷卻到室溫條件下，待用。

結(jié)果：發(fā)夾結(jié)構(gòu)的STP打開后，具有一定強(qiáng)度的熒光信號(hào)

三螺旋DNA分子開關(guān)(THMS)的組裝

材料/試劑：STP、啶蟲脒核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成；NaCl,MgCl₂：購(gòu)買于生工生物(上海)試劑公司；EDTA：購(gòu)買于西格瑪奧德里奇試劑公司

方法：離心管中加入1μM解旋的STP溶液50μL、6μM的啶蟲脒適配體50μL以及10mM的磷酸鹽緩沖溶液400μL(磷酸鹽緩沖溶液中含有300mM NaCl,2.5mM MgCl₂和0.1mM EDTA)，該混合體系放置在30℃的水浴鍋中水浴20min，取出后冷卻至室溫。

結(jié)果：經(jīng)測(cè)定未解旋的STP和組裝好的THMS的熒光信號(hào)強(qiáng)度F₀和F₁可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)₁遠(yuǎn)大于F₀，由此說明，核酸適配體與STP環(huán)部堿基配對(duì)結(jié)合，形成一個(gè)能特異性結(jié)合目標(biāo)物的三螺旋分子開關(guān)，STP探針部分修飾的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，從而使FAM的熒光恢復(fù)。

由于實(shí)驗(yàn)所用的體系受到啶蟲脒適配體鏈長(zhǎng)度的影響，所以需要研究適配體鏈長(zhǎng)度對(duì)反應(yīng)體系的影響。材料/試劑：不同鏈長(zhǎng)度的啶蟲脒核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成

方法：取7個(gè)2.0mL的離心管，編號(hào)為a～g，分別加入：a管(1μM STP 50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液450μL),b管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體1 50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液400μL),c管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體2 50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液400μL),d管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體3 50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液400μL),e管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體4 50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液400μL),f管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體3 50μL,2μM啶蟲脒50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL),g管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體4 50μL,2μM啶蟲脒50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL)，b～g管中需要先將STP在60℃的水浴鍋里水浴10min，取出后冷卻到室溫，再加入核酸適配體和磷酸鹽緩沖溶液，混合體系放置在30℃的水浴鍋中水浴20min，取出后冷卻至室溫，測(cè)定七支管的熒光信號(hào)強(qiáng)度。

結(jié)果：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，啶蟲脒核酸適配體4可以作為最優(yōu)的適配體

除核酸適配體鏈長(zhǎng)度外，核酸適配體的濃度同樣會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)體系產(chǎn)生一定的影響，因此需要研究適配體的濃度的作用效果。

材料/試劑：啶蟲脒核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成

方法：取7個(gè)2.0mL的離心管，標(biāo)號(hào)為a～g，分別加入：a管(1μM STP 50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液450μL),b～g管(1μM STP 50μL,核酸適配體4 50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液400μL，核酸適配體4的濃度分別為1,2,4,6,8和10μM)，b～g管中需要先將STP在60℃的水浴鍋里水浴10min，取出后冷卻到室溫條件下，再加入不同濃度的核酸適配體溶液和緩沖溶液，混合體系放置在30℃的水浴鍋中水浴20min，取出后冷卻至室溫，測(cè)定七支管的熒光信號(hào)強(qiáng)度。

結(jié)果：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，核酸適配體4的濃度為6μM(終濃度為600nM)為最優(yōu)的適配體濃度

除此之外，緩沖溶液的pH也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生作用效果，因此需要對(duì)pH條件進(jìn)行優(yōu)化與選擇

材料/試劑：磷酸一氫鈉，磷酸氫二鈉，NaCl,MgCl₂：購(gòu)買于生工生物(上海)試劑公司；EDTA：購(gòu)買于西格瑪奧德里奇試劑公司

方法：取14個(gè)2.0mL的離心管，均分為兩組，分別標(biāo)號(hào)為a₁～g₁和a₂～g₂，先在a₁～g₁管中分別加入1μM STP50μL和pH為5.5～8.5的磷酸鹽緩沖溶液450μL(pH間隔為0.5)；在a₂～g₂管中先分別加入1μM STP 50μL，于60℃的水浴鍋里水浴10min后，再分別加入6μM核酸適配體4 50μL和pH為5.5～8.5的磷酸鹽緩沖溶液400μL，混合體系放置在30℃的水浴鍋中水浴20min，取出后冷卻至室溫，測(cè)定兩組的熒光信號(hào)強(qiáng)度，F(xiàn)₀和F₁分別為加入適配體之前和之后的熒光信號(hào)強(qiáng)度值。

結(jié)果：通過計(jì)算F₁/F₀可以發(fā)現(xiàn)，pH為6.5的磷酸鹽緩沖溶液為最優(yōu)的pH實(shí)驗(yàn)條件

該方法用于啶蟲脒檢測(cè)：

材料/試劑：三螺旋DNA分子開關(guān)；啶蟲脒購(gòu)自西格瑪奧德里奇試劑公司；大白菜購(gòu)自于當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)

方法：

(1)利用三螺旋DNA分子開關(guān)檢測(cè)啶蟲脒：向含有1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL的混合體系中，分別加入不同濃度的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫條件下反應(yīng)12min后，測(cè)定該體系的熒光信號(hào)強(qiáng)度，THMS的熒光信號(hào)強(qiáng)度將隨著啶蟲脒濃度的不同而發(fā)生變化。

(2)所用的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：1,2,4,6,8,10,12μM，通過測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度F₁和F₂，根據(jù)F₁-F₂與啶蟲脒的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。F₁為加入目標(biāo)物啶蟲脒之前的熒光信號(hào)值，F(xiàn)₂為加入目標(biāo)物啶蟲脒之后的熒光信號(hào)值。

(3)實(shí)際樣品的檢測(cè)：取大白菜進(jìn)行實(shí)際樣品的檢測(cè)

稱取5g(精確到0.01g)大白菜勻漿，置于30mL具塞離心管中，加入5mL乙酸-乙腈溶液，搖勻，超聲提取15min，加入5g氯化鈉，蓋上塞子，震蕩5min，4000r/min離心5min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶解在2mL娃哈哈純凈水中，水溶液用于實(shí)際樣品的分析；分析中，將提取的水溶液稀釋20倍，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如權(quán)利要求4所述的方法，加入不同濃度的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，將本實(shí)驗(yàn)方法與國(guó)標(biāo)中的啶蟲脒檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)照。

(4)實(shí)驗(yàn)體系的驗(yàn)證：

(a).選擇性實(shí)驗(yàn)：

取9個(gè)2.0mL的離心管，編號(hào)為a～i，分別依次加入，a～i管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM待測(cè)物質(zhì)50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL，待測(cè)物質(zhì)依次為吡蟲啉、毒死蜱、2,4-D，草銨膦，甲胺磷，西維因，莠去津，尼古丁和啶蟲脒),在480nm的激發(fā)波長(zhǎng)條件下測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度F₁和F₂，F(xiàn)₁和F₂分別為加入待測(cè)物質(zhì)之前和之后的熒光信號(hào)值。

(b).干擾性實(shí)驗(yàn)：

取10個(gè)2.0mL的離心管，編號(hào)為1-10，分別依次加入，1管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM啶蟲脒50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL),2～10管(1μM STP 50μL,6μM核酸適配體50μL,2μM啶蟲脒50μL,pH 6.5的磷酸鹽緩沖液350μL，除此之外分別加入抗壞血酸(0.18mol·L^-1)；Na⁺(0.26mol·L^-1)；Mg²⁺(0.08mol·L^-1)；Ca²⁺(0.42mol·L^-1)；Fe³⁺(3.20mol·L^-1)；K⁺(0.44mol·L^-1)；4-羥基苯甲酸(0.20mol·L^-1)；龍膽酸(0.18mol·L^-1)；沒食子酸(0.26mol·L^-1)),在480nm的激發(fā)波長(zhǎng)條件下測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度F₁和F₂，F(xiàn)₁和F₂分別為加入啶蟲脒之前和之后的熒光信號(hào)值。

結(jié)果：根據(jù)F₁-F₂與啶蟲脒的濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，啶蟲脒的檢出限為9.12nM，線性范圍為1-12nM。

本實(shí)驗(yàn)方法和國(guó)標(biāo)液質(zhì)方法檢測(cè)啶蟲脒的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見下表