人類免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體。(Barre-SinoussiF,ChermannJC,ReyF等，從面臨獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)風(fēng)險的患者分離T-親淋巴逆轉(zhuǎn)錄病毒(IsolationofaT-lymphotropicretrovirusfromapatientatriskforacquiredimmunedeficiencysyndrome(AIDS)).Science1983,220:868-71;PopovicM,SarngadharanMG,ReadE等，來自AIDS和前-AIDS患者的細胞病變的逆轉(zhuǎn)錄病毒(HTLV-I)的檢測、分離和連續(xù)生產(chǎn)(Detection,isolationandcontinuousproductionofcytopathicretroviruses(HTLV-I)frompatientswithAIDSandpre-AIDS).Science1984,224:497-500;GalloRC,SalahuddinSZ,PopovicM等，從AIDS和面臨AIDS風(fēng)險的患者頻繁檢測和分離細胞病變的逆轉(zhuǎn)錄病毒(HTLV-I)(Frequentdetectionandisolationofcytopathicretroviruses(HTLV-I)frompatientswithAIDSandatriskforAIDS).Science1984,224:500-3)。它可以通過性接觸、暴露于受感染的血液或血液制品，或從被感染的母親到胎兒傳播。(CurranJW,JaffeHW,HardyAM等，HIV感染和AIDS在美國的流行病學(xué)(EpidemiologyofHIVinfectionandAIDSintheUnitedStates).Science1988,239:610-16)。急性HIV綜合征，以流感樣癥狀為特征，在開始感染后發(fā)展3-5周并與高水平的病毒血癥相關(guān)。(DaarES,MoudgilT,MeyerRD,HoDD.原發(fā)性人類免疫缺陷病毒1型感染患者中短暫的高水平病毒血癥(Transienthighlevelsofviremiainpatientswithprimaryhumanimmunodeficiencyvirustype1infection).NewEnglJMed1991,324:961-4;ClarkSJ,SaagMS,DeckerWD.有癥狀的原發(fā)性HIV-1感染患者血漿中高滴度的細胞病變的病毒(HightitersofcytopathicvirusinplasmaofpatientswithsymptomaticprimaryHIV-1infection).NewEnglJMed1991,324:954-60)。在癥狀發(fā)作的4-6周內(nèi)，HIV特異性免疫應(yīng)答是可檢測的。(AlbertJ,AbrahamssonB,NagyK等，在原發(fā)性HIV-1感染和隨后的抗自體血清中和的病毒變種出現(xiàn)后，分離株-特異性中和抗體的快速發(fā)展(Rapiddevelopmentofisolate-specificneutralizingantibodiesafterprimaryHIV-1infectionandconsequentemergenceofvirusvariantswhichresistneutralizationbyautologoussera).AIDS1990,4:107-12;HorsburghCRJr,OuCY,JasonJ等，在抗體檢測前，人類免疫缺陷病毒感染的持續(xù)時間(Durationofhumanimmunodeficiencyvirusinfectionbeforedetectionofantibody).Lancet1989,334:637-40)。在血清轉(zhuǎn)化后，在外周血中的病毒載量下降并且大多數(shù)患者進入可持續(xù)數(shù)年的無癥狀階段。(PantaleoG,GraziosiC,FauciAS.人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的免疫發(fā)病機理的新概念(Newconceptsintheimmunopathogenesisofhumanimmunodeficiencyvirus(HIV)infection).NewEnglJMed1993,328:327-35)。外周血中HIV水平的定量測量大大有助于對HIV感染的發(fā)病機理的理解(HoDD,NeumannAU,PerelsonAS等，HIV-1感染中血漿病毒體和CD4淋巴細胞的快速周轉(zhuǎn)(RapidturnoverofplasmavirionsandCD4lymphocytesinHIV-1infection).Nature1995,373:123-6;WeiX,GhoshSK,TaylorME等，人類免疫缺陷病毒1型感染的病毒動力學(xué)(Viraldynamicsinhumanimmunodeficiencyvirustype1infection).Nature1995,373:117-22)并且已被證明是HIV感染個體的預(yù)后與管理中的一個重要參數(shù)。(MellorsJW,RinaldoCRJR,GuptaP等，通過血漿中病毒的量預(yù)測的HIV-1感染的預(yù)后(PrognosisinHIV-1infectionpredictedbythequantityofvirusinplasma).Science1996,272:1167-70;MellorsJW,MunozA,GiorgiJV等，作為HIV-1感染的預(yù)后標記物的血漿病毒載量和CD4+淋巴細胞(PlasmaviralloadandCD4+lymphocytesasprognosticmarkersofHIV-1infection).AnnInternMed1997,126(12):946-54;CheneG,SterneJA,MayM等，在開始有效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的HIV-1感染患者中初始應(yīng)答的預(yù)后意義：前瞻性研究的分析(PrognosticimportanceofinitialresponseinHIV-1infectedpatientsstartingpotentantiretroviraltherapy:analysisofprospectivestudies).Lancet2003,362:679-86;EggerM,MayM,CheneG等，開始高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物療法的HIV-1感染患者的預(yù)后：一項前瞻性研究的合作分析(PrognosisofHIV-1infecteddrugpatientsstartinghighlyactiveantiretroviraltherapy:acollaborativeanalysisofprospectivestudies).Lancet2002,360:119-29;WoodE,HoggRS,YipB等，血漿人類免疫缺陷病毒1型RNA的較高基線水平與在三聯(lián)藥抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法開始后死亡率增加有關(guān)(Higherbaselinelevelsofplasmahumanimmunodeficiencyvirustype1RNAareassociatedwithincreasedmortalityafterinitiationoftriple-drugantiretroviraltherapy).JInfectDis2003,188:1421-5;美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部(USDepartmentofHealthandHumanServices).2004年HIV-1感染的成人和青少年中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的使用指南(2004guidelinesfortheuseofantiretroviralagentsinHIV-1infectedadultsandadolescents).在：AIDSinfo.nih.gov/guidelines在線獲得)。關(guān)于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的開始或變化的決定通過監(jiān)測血漿HIVRNA水平(病毒載量)、CD4+T細胞計數(shù)，和患者的臨床病癥來指導(dǎo)。美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部(USDepartmentofHealthandHumanServices).2004年HIV-1感染的成人和青少年中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的使用指南(2004guidelinesfortheuseofantiretroviralagentsinHIV-1infectedadultsandadolescents).在：AIDSinfo.nih.gov/guidelines在線獲得;YeniPG,HammerSM,HirschMS等，成人HIV感染的治療(TreatmentforAdultHIVInfection).2004年國際AIDS協(xié)會-美國小組的建議(2004RecommendationsoftheInternationalAIDSSociety-USAPanel).JAMA2004,292:251-65)?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒療法的目的是減少血漿中的HIV病毒至低于可利用的病毒載量試驗的可檢測水平。(美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部(USDepartmentofHealthandHumanServices).2004年HIV-1感染的成人和青少年中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的使用指南(2004guidelinesfortheuseofantiretroviralagentsinHIV-1infectedadultsandadolescents).在：AIDSinfo.nih.gov/guidelines在線獲得;AS,EssungerP,CaoY等，在組合療法期間HIV-1感染的隔室的衰減特性(DecaycharacteristicsofHIV-1infectedcompartmentsduringcombinationtherapy).Nature1997,387(6629):188-91)。血漿中的HIVRNA水平可通過現(xiàn)有技術(shù)程序，用核酸擴增或信號擴增技術(shù)量化。(MulderJ,McKinneyN,ChristopherC等，用于血漿中人類免疫缺陷病毒1型RNA的定量的快速和簡單的PCR測定：急性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的應(yīng)用(RapidandsimplePCRassayforquantitationofhumanimmunodeficiencyvirustype1RNAinplasma:applicationtoacuteretroviralinfection).JClinMicrobiol1994,32:292-300;DewarRL,HighbargerHC,SarmientoMD等，分支DNA信號擴增以監(jiān)測人血漿中的人類免疫缺陷病毒1型負擔(dān)的應(yīng)用(ApplicationofbranchedDNAsignalamplificationtomonitorhumanimmunodeficiencyvirustype1burdeninhumanplasma).JInfDiseases1994,170:1172-9;VanGemenB,KievitsT,SchukkinkR等，在HIV-1原發(fā)性感染期間，使用NASBA?量化血漿中的HIV-1RNA(QuantificationofHIV-1RNAinplasmausingNASBA?duringHIV-1primaryinfection).JVirolMethods1993,43:177-87)。發(fā)明概述外周血中的HIV-1水平的定量測量是確定受感染患者的疾病預(yù)后和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療療程的基本參數(shù)。由于有限的病毒RNA穩(wěn)定性，自血漿進行的常規(guī)的HIV-1病毒載量(VL)測試對樣品采集、處理和裝運施加了限制性要求，其在資源有限的環(huán)境中可能阻礙VL測試的進一步擴展。包括干血斑(DBS)的干斑(DS)代表一個繞過這些后勤和技術(shù)限制的可行的選擇。并非DBS的DS可以是，例如，血漿、唾液、血清等。本發(fā)明提供新的HIV-1DS/DBSVL測定的新的和不顯而易見的方法和程序。用于HIIV-1RNA和前病毒DNA(摻入宿主細胞的DNA的病毒基因組或其部分)定量的DBS測定的開發(fā)尚處于初始階段。迄今本領(lǐng)域開發(fā)的測定法深受與成本和效率相關(guān)的幾個缺點的困擾。例如，目前許多程序需要手動轉(zhuǎn)移DS或DBS洗脫液，用于進一步的核酸提取程序，這提供了誤差和污染進入測定的機會。如果DNase處理在現(xiàn)有技術(shù)測定中是理想的或需要的，程序經(jīng)常涉及使用額外的試劑(特異性DNase反應(yīng)緩沖液和去活化緩沖液)、設(shè)備(加熱裝置)、時間(用于完成DNase程序步驟)和額外的手動操作。本發(fā)明的程序減少和消除了現(xiàn)有技術(shù)的這些缺點。本發(fā)明的DS/DBSHIV-1VL測定利用新的工作流程和創(chuàng)新的洗脫/反應(yīng)緩沖系統(tǒng)。超過現(xiàn)有技術(shù)的這些改進導(dǎo)致可以是幾乎完全自動化的，伴有超過現(xiàn)有技術(shù)的增加的精度和效率的測定。此外，超過現(xiàn)有技術(shù)的這些改進允許使用DNase，而沒有使用DNase的現(xiàn)有技術(shù)程序固有的額外時間和不便。本發(fā)明期望一種檢測血液樣品中的HIV-1核酸的自動化方法，該方法包括：a)提供：i)在固體載體上干燥的疑似感染HIV的血液樣品，ii)洗脫緩沖液，iii)自動化的、可編程樣品制備儀器，iv)自動化的、可編程PCR儀器，v)DNase和vi)適合于檢測HIV-1核酸的PCR試劑；b)用洗脫緩沖液從固體載體洗脫血液樣品以創(chuàng)建洗脫的樣品；c)將洗脫的樣品裝入自動化的、可編程樣品制備儀器中，供進一步的核酸提取和純化，以創(chuàng)建處理過的樣品；d)將PCR試劑裝入自動化的、可編程PCR儀器中；e)啟動自動化程序以將PCR試劑的等分量分配到處理過的樣品中；f)用自動化的、可編程PCR儀器對處理過的樣品中提取的核酸進行PCR；g)分析用自動化的、可編程PCR儀器生成的PCR結(jié)果，以確定是否任何樣品包含HIV-1核酸；h)其中，所述洗脫緩沖液包含約3.5MGITC、約5%Tween?20(聚山梨醇酯20的商品名；也稱為聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇單月桂酸酯)、約50mMKOAc(乙酸鉀)(約pH6.0)；i)其中，任選地，在PCR試劑加入到處理過的樣品中后，將DNase加入到處理過的樣品、PCR試劑或完全的PCR反應(yīng)物的一種或多種中。本發(fā)明還期望所述方法另外包括陰性對照和陽性對照。本發(fā)明還期望步驟b)于室溫下以溫和的間歇混合進行約20分鐘，或于55℃以溫和的間歇混合進行30分鐘。本發(fā)明還期望通過軟件命令編程自動化程序。本發(fā)明還期望進行步驟i)，并且所述DNase不需要特定的DNase反應(yīng)緩沖液，于室溫或在PCR循環(huán)階段期間采用的溫度下是有效的，在30分鐘的時間段內(nèi)有效地降解DNA，有效地降解DNA后不需要滅活并且對RNA序列的檢測沒有負面的影響。本發(fā)明還期望固體載體是濾紙。本發(fā)明還期望核酸是RNA。本發(fā)明還期望核酸是前病毒DNA。附圖簡述圖1顯示有效地除去DNA并且對RNA信號沒有負面的影響的DNase(AmbionDNase1(無RNase)(Cat#AM2222)或等效物)。DNase在進行PCR反應(yīng)之前被用來直接處理提取的核酸。圖2顯示不能有效地除去DNA并且對RNA信號沒有負面的影響的DNase(NewEnglandBiolabsDNaseI(無RNase)(Cat#MO303S)或等效物)。DNase在進行PCR反應(yīng)之前被用來直接處理提取的核酸。圖3顯示有效地除去DNA并且負面地影響RNA信號的DNase(Sigma-AldrichDNase1(擴增級)(Cat#AMPD1)或等效物)。DNase在進行PCR反應(yīng)之前被用來直接處理提取的核酸。圖4顯示有效地除去DNA并且對RNA信號沒有負面的影響的DNase(PromegaRQ1無RNase的DNase(Cat#M6101)或等效物)。DNase在進行PCR反應(yīng)之前被用來直接處理提取的核酸。圖5顯示在1000拷貝/mL的HIV-1下，于55℃30分鐘對比室溫20分鐘的DBS洗脫條件的比較。每種條件使用71次重復(fù)。于55℃30min的循環(huán)閾值(Ct)早于在室溫下20分鐘的Ct。于55℃30分鐘的最大比例(MR；信號強度的量度)高于在室溫下20分鐘的MR。圖6顯示在范圍從52至65℃的溫度下，從25至45分鐘的DBS洗脫。雖然Ct值在各條件之間是可比較的，但具有最高MR值的條件是55℃30分鐘。圖7顯示于55℃10、20和30分鐘的DBS洗脫。不斷增加的洗脫時間顯示了改善Ct和增加MR的趨勢，雖然各個時間點之間的差別并不明顯。于55℃溫育30分鐘后，于室溫下進一步溫育至多24小時不影響PCR結(jié)果。發(fā)明詳述到目前為止，血漿樣品的測試是HIV-感染的個體對于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(ART)的病毒載量(VL)評價的金標準。在資源有限的環(huán)境下，干血斑(DBS)的使用是一種用于VL測試和基因分型二者的很有前途的替代樣品類型。DBS與基于自動化樣品處理和實時PCR的系統(tǒng)組合將允許在中心實驗室中的VL測量或基因分型試驗。為使HIV病毒載量測定適合于DBS，最重要的技術(shù)問題是測定靈敏性和特異性。DBS病毒載量測定的臨床靈敏性和特異性在世界衛(wèi)生組織(WHO)2013年抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療指南中通過使用1000拷貝/mL的閾值定義。在ART啟動后，具有血漿VL<1000拷貝/mL12個月或更長時間的患者的比例是作為獲得性耐藥調(diào)查的一部分測定的一個重要結(jié)果。具有低于這個水平的VL的患者被分類為具有成功的藥物療法(Parkin,2014AIDSRev)。測定特異性與相對于細胞-相關(guān)的DNA或RNA的無細胞RNA的分離/擴增相關(guān)。如果一種測定獲得無細胞RNA和細胞-相關(guān)的DNA或RNA二者，一種在低血漿VL濃度下的顯著的過度量化(over-quantification)將被觀察到，因為細胞DNA是干血斑中非-血漿病毒-衍生的核酸的主要來源。(Parkin,2014AIDSRev.)。Abbott實時HIV-1m2000系統(tǒng)結(jié)合對RNA為特異性或至少選擇性的試劑和方法(Parkin,2014AIDSRev.)。報告也要求使用Abbott實時HIV-1測定的在血漿和DBS樣品中病毒載量之間的可接受的相關(guān)性(Marconi,A.等,2009ClinMicrobiolInfect;Arredondo等,2012JClinMicro)。測定靈敏性通常由測定檢測限度(LOD)表示。DBS靈敏性的主要挑戰(zhàn)是體積限制限定輸入拷貝數(shù)(由NellT.Parkin評述,2014)。Abbott實時HIV-1DBS測定的改良版本(Abbott實時HIV-1DBS測定開放模式)被開發(fā)，其涉及使用一個不需要切除的穿孔的70μlDBS斑點。此外，不需要各管之間的樣品傳輸。DBS在1300μl緩沖液中洗脫，其中1000μl用作輸入處理。因此，為提取而轉(zhuǎn)移的全血的實際量是約53.8μl。采用當(dāng)前室溫洗脫條件(概述于初始DBS開放模式方案中)，實驗-確定的DBS洗脫回收率(與血漿比較)范圍從24%至43%(與血漿比較)，平均為35%，這導(dǎo)致1080拷貝/mL-1934拷貝/mL的計算LOD范圍。(在這些實驗中，全血和血漿二者中摻入相同濃度的HIV；血細胞比容的影響不包括)。因為WHO提出了確定成功的ART療法的閾值是VL≤1000拷貝/mL(WHO實施HIV病毒載量測試的技術(shù)和操作考慮，2014年7月)，HIVDBSVL測定需要具有≤1000拷貝/mL的檢測限(LOD)。為獲得這種靈敏性，使用一個70μLDBS，DBS洗脫效率需要提高10%或以上，以降低LOD至少于1000cp/mL。本發(fā)明的DS/DBSHIV-1VL測定被設(shè)計在可對本發(fā)明的核酸提取和擴增參數(shù)進行編程的自動化裝置上運行。Abbott實時m2000sp和m2000rt儀器(裝置；AbbottMolecular,AbbottPark,IL)是用于本發(fā)明的DBSHIV-1VL測定的合適的自動化和可編程裝置的實例。用于Abbott實時m2000sp和m2000rt儀器(和從其它來源可獲得的合適的儀器)的操作指令/參數(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的并通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明不限于該裝置的使用，而在本發(fā)明的時候的其它類似裝置是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的HIV-1測定優(yōu)選地使用帶有同質(zhì)實時熒光檢測的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)。部分雙鏈熒光探針設(shè)計允許不同的HIV-1變種包括M、O和N群的檢測。測定可針對來自AIDS臨床試驗組的病毒學(xué)質(zhì)量保證(VQA)實驗室的病毒標準或其它標準(Yen-LiebermanB,BrambillaD,JacksonB等，評價AIDS臨床試驗組病毒學(xué)實驗室的血漿中人類免疫缺陷病毒1型RNA的定量的質(zhì)量保證程序(Evaluationofaqualityassuranceprogramforquantitationofhumanimmunodeficiencyvirustype1RNAinplasmabytheAIDSclinicaltrialsgroupvirologylaboratories),JClinMicrobiol,1996,34:2695-701)，和針對世界衛(wèi)生組織WHO)對于HIV-1RNA的國際標準(NIBSC;HolmesH,DavisC,HeathA等，一項建立用于基于核酸的技術(shù)的HIV-1RNA的第一個國際標準的國際合作研究(Aninternationalcollaborativestudytoestablishthe1stinternationalstandardforHIV-1RNAforuseinnucleicacid-basedtechniques),JVirolMethods,2001,92:141-50；DavisC,HeathA,BestS等，針對HIV-1RNA的第一個國際標準的核酸擴增技術(shù)的HIV-1工作試劑的標定(CalibrationofHIV-1workingreagentsfornucleicacidamplificationtechniquesagainstthe1stinternationalstandardforHIV-1RNA),JVirolMeth,2003,107:37-44)進行標準化。測定結(jié)果可以拷貝/mL、Log拷貝/mL、國際單位/mL(IU/mL)或LogIU/mL報告。如WHO的早期嬰兒HIV診斷–全球HIVWeb研究(depts.washington.edu/ghivaids/reslimited/case7/discussion.html)所指出的，干血斑測試是一種可接受的采集樣品以供分析的方法并引起比液體樣品更小的生物危害風(fēng)險。此外，同行評述的文章已表明，對于靈敏性和可靠性，當(dāng)與血漿樣品比較時，DBS樣品的使用是可行的(J.ClinMicrobiol,2011,50(3):569-572)。自動化樣品制備和分析系統(tǒng)例如Abbott樣品制備系統(tǒng)(m2000sp)和Abbott實時PCR分析儀(m2000rt)的效率、功效和準確性已在同行評述的期刊文章中得到證實(Marconi等,用干血斑標本評價Abbott實時HIV-1定量測定(EvaluationoftheAbbottReal-TimeHIV-1quantitativeassaywithdriedbloodspotspecimens),Clin.Microbiol.Infect,2009,15:93-97)。更進一步地，用于DBS收集的各種紙的比較已經(jīng)公開(Rottinghaus等,J.Clin.Microbiol.,2012,51(1):55-60)。雖然大量的工作已經(jīng)研究了在自動化制備和測定系統(tǒng)中DBS的使用，仍然需要在工作流程和試劑化學(xué)中的改進以提供增加的可用性和增加的靈敏度。本發(fā)明使用自動化系統(tǒng)，提供超過現(xiàn)有技術(shù)DBSHIV-1VL測定程序的改進的效率、工作流程和性能。DBS樣品采集的優(yōu)點DBS收集超過液體血液樣品的優(yōu)點很多。DBS容易采集；僅僅需要手指刺(fingerprick)或醫(yī)治刺(healprick)，繞開了對靜脈穿刺的需要。放血的技能是不必要的。采集設(shè)備是最小的。樣品卡片通常有斑點大小(直徑)的指示，以確保足夠的樣品大小。約70μl的樣品體積通常是足夠的。樣品在環(huán)境條件下風(fēng)干。DBS不需要冷凍貯存。DBS可以在密閉容器(例如TupperWear?或密封封套)中貯存或傳送。樣品容易傳送且在環(huán)境條件下在長的時間段(數(shù)周至數(shù)月)內(nèi)是穩(wěn)定的。因此，樣品可在外部場所收集并傳送到一個中心測試設(shè)施中。由于DS/DBS樣品提供的較低的生物危害，適當(dāng)包裝的樣品可以郵寄到測試設(shè)施(干血斑標本的運輸指南(ShippingGuidelinesforDried-BloodSpotSpecimens)，CDC,www.cdc.gov/labstandards/pdf/nsqap/Bloodspot_Transportation_Guidelines.pdf，和其中包含的參考文獻；臨床實驗室和標準研究所.在濾紙上的血液收集用于新生兒篩查計劃(ClinicalLaboratoryandStandardsInstitute.Bloodcollectiononfilterpaperfornewbornscreeningprograms)；批準的標準–第5版.CLSI文件LA4-A6.Wayne,PA：臨床和實驗室標準研究所;2012)。一旦在測試設(shè)施中，樣品可使用自動化系統(tǒng)或者手動程序(如果需要的話)提取。定義以下定義與本公開內(nèi)容相關(guān)：術(shù)語“約"或“大約”，除非另外指明，指偏離所述值的+/-10%變化。要理解，這樣的變化總是包括在本文提供的任何給定值內(nèi)，無論是否特別地提及它。此外，所有敘述的范圍包括在該范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的所有值，無論是否實際上敘述了具體的值。因此，1-10的范圍包括，例如，2、3.6、9.015等值。術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)"指制備DNA序列的拷貝的方法。該方法采用熱循環(huán)(即，加熱和冷卻循環(huán)，分別用于DNA的變性(或熔化)和復(fù)制)。引物(其為含有與要拷貝的DNA序列互補的序列的短DNA片段)和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶例如來自水生棲熱菌(Thermusaquaticus)的DNA聚合酶(其被稱為Taq聚合酶)被用來選擇DNA序列并拷貝它(見例如，美國專利號4,683,195；4,800,195，和4,965,188，其全部通過引用將其關(guān)于相同內(nèi)容的講述結(jié)合到本文中)。以重復(fù)循環(huán)，將所制得拷貝用作生成更多拷貝的模板(即，鏈反應(yīng))。PCR技術(shù)包括，但不限于，標準PCR、等位基因-特異性PCR、裝配PCR、不對稱PCR、數(shù)字PCR、熱啟動PCR、序列間(intersequence)-特異性PCR、反向PCR、連接-介導(dǎo)的PCR、甲基化-特異性PCR、小-引物PCR、巢式PCR、重疊-延伸PCR、實時PCR、逆轉(zhuǎn)錄-PCR、固相PCR、熱不對稱交錯PCR，和降落(Touchdown)PCR。術(shù)語逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)指通過從RNA創(chuàng)建互補的DNA(cDNA)轉(zhuǎn)錄物，定性檢測基因表達的方法。術(shù)語“實時聚合酶鏈反應(yīng)”、“實時PCR”和定性PCR”(qPCR)指使用熒光探針定量測量DNA的擴增的方法。如本文所用的術(shù)語“引物"指啟動模板-依賴性核酸合成的寡核苷酸。在核酸模板、三磷酸核苷前體、聚合酶和輔因子的存在下，在合適的溫度和pH的條件下，引物可通過聚合酶在其3'末端加入核苷酸而延長，得到引物延長產(chǎn)物。引物的長度可以變化，這取決于所用的具體條件和擴增的目的。例如，用于診斷目的的擴增的引物的長度通常從約15至約35個核苷酸。引物必須對所需模板具有足夠的互補性，以引發(fā)所需延長產(chǎn)物的合成。換言之，引物必須能夠以足以在用于通過聚合酶在合成起始的適當(dāng)?shù)牟⒘形恢锰峁┮锏?'羥基部分的方式與所需模板鏈退火。引物不必是所需模板的精確互補體。例如，非互補核苷酸序列可以存在于在他處互補的引物的5'末端。或者，非互補堿基可以穿插在寡核苷酸引物內(nèi)，條件是引物序列與所需模板鏈的序列具有充分的互補性，以提供用于延長產(chǎn)物合成的模板-引物復(fù)合物。PCR目標序列用本領(lǐng)域已知的技術(shù)擴增。選擇的技術(shù)是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。PCR擴增可用標準PCR技術(shù)，遵循制造商的指示進行。Abbottm2000系統(tǒng)包括基于從用戶輸入使樣品制備和PCR反應(yīng)自動化的裝置。擴增反應(yīng)可以并且優(yōu)選地應(yīng)包括內(nèi)部對照(IC)核酸和一對用于擴增IC核酸的引物。當(dāng)擴增反應(yīng)包含IC核酸時，促進擴增的條件也促進IC核酸的擴增。任何合適的序列可用作IC。IC目標序列的實例包括用于下面實驗部分的那些。雖然組織或體液的任何合適的樣品可用作本發(fā)明的核酸，即DNA或RNA樣品的來源，樣品從DBS洗脫。如果必要或需要的話，可將蛋白酶，例如蛋白酶K，加入到樣品中以消化不需要的蛋白?？墒褂萌绫绢I(lǐng)域已知的任何合適的方法，制備用于測定的樣品。理想地，所述方法提取和濃縮核酸。所述方法也合乎需要地使目標序列容易擴增，并從提取物中除去擴增的潛在抑制劑。在本發(fā)明中，核酸用本發(fā)明的洗脫緩沖液從DBS中洗脫。一旦樣品被洗脫，RNA可經(jīng)分離，逆轉(zhuǎn)錄和可擴增生成的cDNA(如，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，例如如在美國專利號5,310,652；5,322,770；5,561,058；5,641,864;和5,693,517中所述)。此外，DNA可不使用逆轉(zhuǎn)錄酶而直接擴增。前病毒DNA可以這種方式擴增。如果目標序列存在于樣品中，目標核酸可以與導(dǎo)致目標序列的特異性擴增的引物接觸。"特異性擴增"意指引物擴增特異性目標序列而不是其它序列。見例如，PCR技術(shù)：DNA擴增的原理和應(yīng)用(PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification)(Erlich編輯,FreemanPress,NY(1992))；PCR方案：方法和應(yīng)用指南(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications)(Innis等編輯,AcademicPress,SanDiego,CA(1990))；分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(Ausubel,1994-1999,包括直至2004年4月的最新增刊)；和分子克?。簩嶒炇沂謨?MolecularCloning:ALaboratoryManual)(Sambrook&Russell,第3版,2001)以及在國際專利申請公布號WO93/22456和美國專利號4,851,331；5,137,806；5,595,890；和5,639,611中描述的方法，其全部通過引用將其關(guān)于相同內(nèi)容的講述特別地結(jié)合到本文中。引物可用可以被例如光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)方法檢測到的標記物可檢測地標記(見例如，Sambrook等)。有用的標記物包括染料，例如熒光染料、放射性標記物例如32P、電子致密試劑(electron-densereagent)、酶例如過氧化物酶或堿性磷酸酶、生物素，或可獲得抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白。在本發(fā)明中，熒光染料是優(yōu)選的。在這方面，可檢測的寡核苷酸可以被標記，如用熒光素。如果引物用染料標記，而可檢測的寡核苷酸用熒光素標記，并且被設(shè)計結(jié)合到與染料相對的新生鏈，DNA螺旋間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)可以發(fā)生。其它可檢測的寡核苷酸包括分子探針、TAQMAN?探針、單鏈DNA探針、雙鏈DNA探針等。核酸擴增試劑(PCR試劑)包括具有聚合酶活性的酶(如，AmpliTaqGold?)、一種或多種酶輔助因子(如，MgCl2)，和三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs；如，dATP、dGTP、dCTP，和dUTP或dTTP)。促進擴增的條件是促進引物的退火和核酸序列的延伸的那些。退火依賴于各種參數(shù)，例如溫度、離子強度、要擴增的序列的長度、互補性，和要擴增的序列的G:C含量。例如，降低溫度促進互補的核酸序列的退火。高G:C含量和較長的長度穩(wěn)定雙鏈形成。一般來說，約30bp或更少且具有高G:C含量的引物和可檢測的寡核苷酸功能良好。優(yōu)選的擴增條件、引物和可檢測的寡核苷酸在此是示例性的。擴增可通過使反應(yīng)混合物熱循環(huán)約10和約100次之間，例如約20和約75次之間，例如約25和約50次之間，重復(fù)任何合適的次數(shù)。一旦擴增反應(yīng)完成，擴增產(chǎn)物的存在可使用任何合適的方法檢測。這樣的方法包括，但不限于，本領(lǐng)域已知的那些，例如用或不用熒光染料的凝膠電泳(取決于產(chǎn)物是否用染料-標記的引物擴增)，使用嵌入染料的解鏈曲線圖(見例如，用于DNA擴增的PCR技術(shù)、原理和應(yīng)用(PCRTechnology,Principles,andApplicationsforDNAAmplification),Erlich編輯,W.H.FreemanandCo.,NewYork,1992,第7章)，和與內(nèi)部可檢測的寡核苷酸雜交。方法的其它實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、電化學(xué)發(fā)光、反向斑點雜交(reversedotblots)、高壓液相色譜(HPLC)(見例如，Lazar,GenomeRes.4:S1-S14(1994))，和單鏈PCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析也可采用(見例如，Orita等,PNASUSA86:2766-2770(1989))。在本發(fā)明中，熒光標記物用自動化PCR反應(yīng)裝置自動地檢測。擴增的核酸可通過監(jiān)測反應(yīng)混合物中雙鏈DNA(dsDNA)的總量的增加來檢測(見例如，美國專利號5,994,056和歐洲專利公布號487,218和512,334)。使用DNA-結(jié)合染料，例如SYBRGreen。染料當(dāng)結(jié)合于dsDNA時會發(fā)熒光，而熒光的增加被用來確定dsDNA的增加。作為選擇并且優(yōu)選地，擴增和檢測可在實時PCR測定中結(jié)合。當(dāng)使用實時PCR時，混合物還可包含核酸檢測試劑。實例包括嵌入任何雙鏈DNA或序列-特異性DNA可檢測的寡核苷酸的非-特異性熒光染料，其允許僅僅在可檢測的寡核苷酸與其互補DNA目標雜交后檢測，從而能夠同時擴增和檢測。當(dāng)在擴增期間，可檢測的寡核苷酸存在于混合物時，可檢測的寡核苷酸在促進擴增的條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，應(yīng)該不干擾擴增，在擴增條件下應(yīng)結(jié)合于其目標序列，并且僅在結(jié)合其目標序列時發(fā)出信號。特別適合于這方面的可檢測的寡核苷酸的實例包括分子信標可檢測的寡核苷酸、TAQMAN?可檢測的寡核苷酸，和線性可檢測的寡核苷酸，例如由Abravaya等(美國專利申請公布號2005/0227257)描述的那些?？蓹z測的寡核苷酸可與分子信標結(jié)合形成環(huán)和莖排列。可檢測的寡核苷酸也可用作線性可檢測的寡核苷酸，其在一端具有熒光團(如，F(xiàn)AM)和在另一端具有高效猝滅劑，例如黑洞猝滅劑(BlackHoleQuencher)(BHQ?；BioSearchTechnologies,Inc.,Novato,CA)。已采用的術(shù)語和措辭被用作描述而不是限制的術(shù)語。在這一方面，當(dāng)某些術(shù)語在此被定義、描述或討論時，所有這樣的定義、描述或討論意欲歸屬于這樣的術(shù)語。也不意欲使用排除所顯示和描述的特征的任何等效物或其部分的此類術(shù)語和措辭。要認識到在要求的本發(fā)明范圍內(nèi)的各種修飾是可能的。因此，應(yīng)該理解，雖然本發(fā)明已在優(yōu)選的實施方案和任選的特征的情況下具體地公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員可采取在此公開的概念的修飾和變化。這樣的修飾和變化被認為是在由所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明范圍內(nèi)。本說明書中提及的所有專利、專利申請公布、雜志文章、教科書，和其它出版物是本公開所述領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)水平的指示。所有這樣的出版物均通過引用結(jié)合到本文中，如同各個獨立的出版物特別地和單獨地指明通過引用結(jié)合到本文中的程度一樣。在此示例性描述的本發(fā)明在本文并沒有具體地公開的任何要素或限制不存在的情況下，可以適當(dāng)?shù)貙嵭小Ｒ虼?，例如，任何術(shù)語"包含"、"基本由…組成"和"由…組成"在本文的每種情況下，可用另外兩個術(shù)語的任何一個替代。同樣，單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文中另外清楚地指明。因此，例如，提及"方法"時包括一種或多種方法和/或步驟類型，其在本文中被描述和/或其在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員閱讀本公開內(nèi)容后將變得顯而易見。范例實施例1本發(fā)明優(yōu)選地在自動化的、可編程PCR裝置上進行，幾種裝置是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的并適用于本發(fā)明的任何程序性改變，所述程序性改變對于使用特定系統(tǒng)可能是必要的，同時不背離本發(fā)明的發(fā)明概念。在其它情況下，本發(fā)明可手動進行。然而，本發(fā)明的手動執(zhí)行導(dǎo)致增加的時間投入并可能由于操作誤差降低準確度。本范例利用包括m2000sp(樣品制備)和m2000rt(實時核酸擴增)儀器和Abbott實時HIV-1試劑的Abbottm2000系統(tǒng)。用于與Abbottm2000儀器(或類似的)和Abbott實時HIV-1試劑(或類似的)聯(lián)合的干血斑標本的HIV-1病毒載量測試以下描述的程序應(yīng)用于干血斑(DBS)標本的HIV-1病毒載量測試。以下描述的該程序被用于與Abbottm2000sp和m2000rt儀器和Abbott實時HIV-1試劑聯(lián)合。其它系統(tǒng)和裝置是本領(lǐng)域可獲得的，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可基于本說明書的教導(dǎo)修改以下公開的程序用于其它可獲得的系統(tǒng)和裝置，而不偏離本說明書的發(fā)明概念。設(shè)備程序用于HIV-1DBS病毒載量測試的應(yīng)用程序文件(即，軟件)在進行測定之前，必須安裝在Abbottm2000sp和Abbottm2000rt系統(tǒng)上。標本收集和操作說明DBS可在MunktellTFN(Sweden)紙卡片(或等效紙卡片，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的)上，通過以下的這些步驟制備：●將全血點樣在MunktellTFN紙卡片(或等效物)的半英寸(12-毫米)圓圈上，確保整個圓圈被覆蓋。建議每個圓圈使用至少70μI血液(~3-5滴；不要壓迫或擠壓手指)，以確保完全覆蓋。如果全血已被收集在血液收集管中，新鮮抽出的血可在點樣前于從2-8℃(冰箱溫度)至15-30℃(環(huán)境溫度)保持至多24小時。此外，在點樣前，應(yīng)使用吸液管混合血液?！裼谑覝叵嘛L(fēng)干卡片?！駷檫\輸或儲存，將每個卡片包裝在具有干燥劑包的袋或其它可密封容器中。卡片可在環(huán)境條件下貯存至多12周。或者，卡片可于2-8℃或-10℃或更冷的溫度下貯存至多24周?！袢绻匾蛐枰?，根據(jù)以上列出的建議的貯存溫度和時間裝運標本。對于國內(nèi)和國際貨運，標本的包裝和標記應(yīng)符合覆蓋臨床、診斷或生物標本的運輸?shù)倪m用的州、聯(lián)邦和國際法規(guī)。測定方案1.這個示例性方案采用Abbott實時系統(tǒng)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠使該方案適應(yīng)其它類似的裝置和系統(tǒng)，而無需過度的實驗。每次運行可以處理總共96份樣品。在每次運行中包括陰性對照、低陽性對照，和高陽性對照，因此當(dāng)校準品不包括在內(nèi)時，允許每次運行處理最多93份DBS標本。這些步驟不適用于Abbott的對照和校準品，其應(yīng)直接作為液體樣品被處理。通過以下這些步驟處理DBS標本：●準備裝有1.3mlDS/DBS洗脫緩沖液(洗脫緩沖液包含約3.5MGITC(硫氰酸胍)、約5%Tween?20、約50mMKOAc(乙酸鉀)，約pH6.0)的Abbott輸送管(AbbottTransportTubes)。Tween?是ICIAmericas,Inc.,Bridgewater,NewJersey的注冊商標。Tween?20是聚山梨醇酯20的商品名。其它商標的聚山梨醇酯20也將有用于本發(fā)明的方法中。[GITC的用量可以是1.0-5.5M、2.0-4.5M、3.0-4.0M和約3.5M；Tween20的用量可以是0-20%、2%-8%、4%-6%和約5%；乙酸鉀的用量可以是10-500mM、20mM-300mM、30mM-200mM、40mM-100mM和約50mM；和pH可以是從5-10、5.2-8、5.6-7、5.8-6.5和約6.5]?！駥γ糠輼吮緩腗unktellTFN紙卡片(或等效物)分離一個(1)完整的DBS。每個DBS的直徑應(yīng)該是約半英寸(12毫米)。注意：如果適用，避免切割表面與DBS標本的直接接觸。如果必要，根據(jù)良好實驗室實踐，在標本之間清潔用來切割DBS的儀器。將DBS置于含有DS/DBS洗脫緩沖液的Abbott輸送管中。確保DBS完全浸沒在DS/DBS洗脫緩沖液中。注意：在該DBS轉(zhuǎn)移步驟期間，穿孔的MunktellTFN紙卡片可置于Abbott輸送管上，其中使用清潔的吸液管尖將DBS推出卡片并進一步直接推入管中?！裨跇悠繁恢糜贏bbottm2000sp儀器或其它機器人系統(tǒng)之前，于室溫下溫育約20分鐘或于55℃溫育30分鐘，伴有間歇的溫和混合(步驟7)。2.于15-30℃或于2-8℃(和之間)解凍適當(dāng)?shù)臏y定對照品和內(nèi)部對照品(IC)。如果僅進行校準運行，于15-30℃或于2-8℃(和之間)解凍校準品?！褚坏┙鈨觯瑴y定對照品、IC和校準品可在使用前于2-8℃貯存至多24小時。●使用前，渦流(即，例如用渦流混合器或等效物極其劇烈地混合)各個測定校準品和各個對照品3次，每次2-3秒。在渦流后通過在工作臺上輕叩小瓶以使液體到達瓶子的底部，確保每個小瓶的內(nèi)容物在瓶底。確保不產(chǎn)生氣泡或泡沫；和如果存在，用無菌吸液管尖除去氣泡，對每管使用一個新的管尖?！癜凑丈a(chǎn)商的指示制備內(nèi)部對照品(IC)，如本領(lǐng)域已知的。3.于15-30℃或于2-8℃(和之間)解凍擴增試劑并于2-8℃貯存，直到需要擴增主混合程序?！褚坏┙鈨?，擴增試劑如果不立即使用，可于2-8℃貯存至多24小時?！癜凑丈a(chǎn)商的指示準備擴增試劑(PCR試劑)，如本領(lǐng)域已知的?！駥⒃贏bbott輸送管中的低和高陽性對照品、陰性對照品、校準品，如果適用的話，以及DBS標本置于Abbottm2000sp樣品架上。注意：確保Abbottm2000sp樣本架已被特別校準用于這種HIV-1DBS病毒載量程序。●仔細裝載樣品架以避免飛濺。如果使用，試管標簽上的條形碼必須面對掃描的正面。確保各管被牢固地放置在樣品架中，以致試管的底部到達樣品架的內(nèi)底?！駥M載的樣本架以連續(xù)的樣品架位置裝載到Abbottm2000sp上，第一樣品架離開工作臺右邊最遠，而任何額外的樣品架逐次排到到第一個樣品架的左邊。5.將5ml反應(yīng)容器置于Abbottm2000sp1ml子系統(tǒng)載體中。6.將AbbottmSample制備系統(tǒng)試劑和Abbott96深孔板裝載到Abbottm2000sp工作臺上。7.從Protocol屏幕，選擇HIV-1DBS病毒載量應(yīng)用文件。啟動樣品提取方案?！裨跇悠诽崛。汗ぷ髋_設(shè)置、校準品和對照品區(qū)域中輸入校準品(如果校準曲線尚未在Abbottm2000rt中存儲則需要)和對照批的具體值。批的具體值在各Abbott實時HIV-1校準品和對照品試劑盒卡片中指定。●Abbottm2000sp主混合加入(Abbottm2000spMasterMixAddition)方案(步驟9)必須在完成樣品制備后1小時內(nèi)啟動。注意：在處理擴增試劑前更換手套。8.在樣品制備完成后，在Abbottm2000sp工作臺上裝載擴增試劑和主混合小瓶。9.選擇匹配相應(yīng)的樣品制備提取的適當(dāng)?shù)纳羁装?。啟動Abbottm2000sp主混合加入(Abbottm2000spMasterMixAddition)方案?！裨跇悠诽崛⊥瓿珊?，當(dāng)在運行中有大于48份處理的樣品時，Abbottm2000sp自動地填滿Abbott96-孔光學(xué)反應(yīng)板(Abbott96-WellOpticalReactionPlate)中的任何空孔。對于含有48份樣品或更少樣品的運行，不進行板填充。10.在擴增區(qū)打開和啟動Abbottm2000rt儀器。11.在Abbottm2000sp儀器已完成添加樣品和主混合后，根據(jù)Abbottm2000sp操作手冊,操作指令(Abbottm2000spOperationsManual,OperatingInstructions)部分，密封Abbott96-孔光學(xué)反應(yīng)板(Abbott96-WellOpticalReactionPlate)。12.將密封的光學(xué)反應(yīng)板放入Abbott無飛濺支持基座(AbbottSplash-FreeSupportBase)中以轉(zhuǎn)移至Abbottm2000rt儀器中。13.將Abbott96-孔光學(xué)反應(yīng)板(Abbott96-WellOpticalReactionPlate)置于Abbottm2000rt儀器中。從Protocol屏幕，選擇HIV-1DBS病毒載量應(yīng)用文件。如在Abbottm2000sp操作手冊,操作指令部分中所述啟動方案。14.在加入PCR試劑至洗脫的樣品后，如果操作員確信有必要，可將DNase加入到洗脫的樣品、PCR試劑和完全的PCR反應(yīng)物的一種或多種中。DNase反應(yīng)試劑/緩沖液和去活化試劑/緩沖液不是必需的。結(jié)果從存儲的校準曲線計算標本或?qū)φ掌分械牟《綡IV-1RNA濃度。Abbottm2000rt儀器在Abbottm2000rt工作臺上自動地報告結(jié)果。測定結(jié)果可以拷貝/ml、log[拷貝/ml]、國際單位(IU)/mL，或log[IU/mL]報告。對于結(jié)果的解釋見下表1。表1結(jié)果的解釋結(jié)果解釋未檢測到目標未檢測到<7.00Log(拷貝/mL)檢測到*>7.00Log(拷貝/mL)>ULQaaULQ=定量上限*對于研究AppSpecFile(v4或更高)，所有檢測的標本將用VL結(jié)果報告。實際LOD將在驗證研究后提供。一旦獲得驗證LOD值，“檢測到的”結(jié)果將分成兩類：1).“檢測到”，2).“檢測到，<LOD值”。實施例2范例顯示能夠使本發(fā)明的自動化DBS測定程序以超過現(xiàn)有技術(shù)方法的提高的效率和靈敏性工作的設(shè)計特征。所述程序包括以下步驟：1.從DBS卡片分離DBS。2.在處理緩沖液中溫育DBS。3.將含有在緩沖液中的DBS的反應(yīng)容器裝載在自動化機器人系統(tǒng)(如，Abbottm2000sp)上。4.機器人系統(tǒng)由一個腳本驅(qū)動以通過核酸提取方法處理DBS樣品，該方法是直接處理其中DBS已被溫育而沒有手動干預(yù)的試管。5.核酸提取后，機器人系統(tǒng)形成PCR主混合物(即，無目標核酸的完全的PCR反應(yīng)物)。或者，如果PCR主混合物已事先形成并被加載在系統(tǒng)上，可繞過這個步驟。6.通過使在步驟4結(jié)束時獲得的提取的核酸與在步驟5結(jié)束時獲得的PCR主混合物合并，機器人系統(tǒng)形成完全的PCR反應(yīng)物。7.在分析儀器(如，實時PCR儀器例如Abbottm2000rt)上執(zhí)行PCR循環(huán)和數(shù)據(jù)整理/結(jié)果報告。8.如果需要特殊的應(yīng)用，在在步驟4獲得的提取的核酸中加入DNase并溫育以消除/減少DNA內(nèi)容物。在這樣一種情況下，DNase處理的核酸將從步驟6開始得到進一步的處理。備選地，在PCR主混合物形成之前或期間，DNase可加入到PCR試劑中。進一步備選地，DNase可在PCR試劑中配制。在這樣一種情況下，含有DNase的PCR主混合物將從步驟6開始得到進一步處理。在步驟6期間，DNase被機器人系統(tǒng)分配到各樣品，繞開了DNase的手動分配。此外，在步驟6之后，步驟7之前可需要DNase處理溫育。注意：其中可需要DNase的使用的特殊應(yīng)用是HIVRNA特異性PCR，其中來自前病毒DNA的干擾可被消除/減少。能夠進行以上測定程序和測定執(zhí)行的技術(shù)包括：1.從DS/DBS高效洗脫核酸的處理緩沖液。本公開內(nèi)容包括使用Abbott的mWash1緩沖液(3.5MGITC；5%Tween20；50mMKOAc,pH6.0)作為DBS處理/洗脫緩沖液。注意：Abbott先前已提供市售的HIVDBSVL方案和市售的CE-IVDHIV定性DBS測定，其使用AbbottmLysis緩沖液作為處理緩沖液(4.66MGITC；10%Tween20；100mMTrizma,pH7.8)。這兩個程序的比較在下文提供并顯示出本發(fā)明程序的意外優(yōu)越性。2.腳本參數(shù)，其能夠使機器人吸液管系統(tǒng)將液體從含有固體DBS材料的試管直接轉(zhuǎn)移，用于以可靠和準確的方式進一步處理，同時在液體轉(zhuǎn)移后，在試管中留下≤300ul的死體積。3.使用DNase，其在提取的核酸中有效地降解DNA，而不包括特異性DNase反應(yīng)緩沖液。4.使用具有如在項目3中所述特性的DNase，其于室溫下有效地降解DNA。5.使用具有如在項目3和4中所述特性的DNase，其在30分鐘的時間段內(nèi)有效地降解DNA。6.使用具有如在項目3-5中所述特性的DNase，其不需要用引入試劑或者升高溫度滅活。7.使用DNase，其在當(dāng)DNase暴露于提取的核酸之前已被引入PCR試劑，或在形成PCR反應(yīng)期間引入時，有效地降解PCR反應(yīng)中的DNA。8.使用具有如在項目7中所述特性的DNase，而不包括特定的DNase反應(yīng)緩沖液。9.使用具有如在項目7和8中所述特性的DNase，其于室溫和在各種PCR循環(huán)階段期間的溫度下有效地降解DNA。10.使用具有如在項目7-9中所述特性的DNase，其在10分鐘的時間段內(nèi)有效地降解DNA。優(yōu)選地，在其中各種PCR循環(huán)階段期間的溫度可支持DNase功能的情況下，DNase處理不需要超出PCR循環(huán)所包括的時間或循環(huán)階段的額外的時間或循環(huán)階段。11.使用具有如在項目7-10中所述特性的DNase，其在PCR之前和PCR期間不需要用引入試劑或者升高溫度滅活。12.使用在項目3-11中的DNase和相關(guān)的DNase處理條件，其對RNA序列的檢測沒有負面的影響。13.“PCR體積”設(shè)置(作為熱循環(huán)參數(shù))至低于實際PCR體積的使用。這種設(shè)置消除了在全PCR板中觀察到的“邊緣”效應(yīng)，其當(dāng)與部分PCR板運行比較時負面影響靈敏性。如采用一些現(xiàn)有技術(shù)實時PCR循環(huán)儀所見的“邊緣”效應(yīng)由溫度控制單元的溫度過高引起。較低的PCR體積設(shè)置導(dǎo)致更慢和更精確的熱控制，從而減輕了大部分的溫度過熱。14.PCR反應(yīng)截止由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)什么是適合于特定的DS/DBS目標樣品來確定。本發(fā)明的技術(shù)范例的細節(jié)1.機器人從含有DBS的試管轉(zhuǎn)移液體由以下步驟組成：●使用“檢測管底(DetectTubeBottom)”算法，用一次性管尖將DBS推入樣品輸入管的底部。●將一次性管尖從樣品輸入管的底部緩慢縮回很小的距離(如，3mm)，并進行小體積的抽吸(如，50μl)以證實DBS不干擾一次性管尖。在小體積抽吸完成后，一次性管尖被縮回到液體表面上方一點點?！袷褂猛瑯拥囊淮涡怨芗?，檢測液體的表面并從該位置進行部分體積跟蹤抽吸(如，450μl以達到1mL)。在第一次部分體積抽吸完成后，將一次性管尖中包含的液體轉(zhuǎn)移至反應(yīng)試管，用于進一步的核酸提取步驟。●重復(fù)這些步驟以獲得總樣品轉(zhuǎn)移體積。2.在特異性DNase反應(yīng)緩沖液的不存在下，當(dāng)用于與本發(fā)明的方法和組合物聯(lián)合時，當(dāng)加入到提取的核酸(對RNA檢測沒有負面影響)中時，有效地降解DNA且不需要用引入試劑或者升高溫度滅活的示例性DNases是：●Promega(Madison,WI)RQ1無RNase的DNase(Cat#M6101)；2U/反應(yīng)；室溫；30分鐘?！馎mbion(GrandIsland,NY)DNaseI(無RNase)(Cat#AM2222)；2U/反應(yīng)；室溫；30分鐘?！馬oche(Basel,Switzerland)DNaseI重組體，(無RNase)(Cat#04716728001)；20U/反應(yīng)；室溫；30分鐘?！衿渌线m的DNases可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的并可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用在此描述的方法，而不用過度的實驗鑒定。本發(fā)明不限于任何特定的DNase，只要它滿足本說明書所列的標準即可。下圖中描述的測定僅僅是示例性的并不用于將本發(fā)明限制至任何特定的DNase或任何特定的篩選方法。對有效地除去DNA并且對RNA信號沒有負面的影響的DNase參考圖1。圖1顯示在與PCR試劑合并前從用DNase處理的HIV陽性干血斑提取的核酸洗脫液(虛線)與對照品(無DNase處理，實線)的比較。然后用針對β球蛋白DNA信號的β球蛋白實時PCR和針對HIV和ICRNA信號的HIV-1實時RT-PCR測定核酸。a)β球蛋白DNA信號，以顯示DNase處理的有效性，b)HIVRNA信號，以顯示DNase處理的影響，c)ICRNA信號，以顯示DNase處理的影響。用于DNase處理的條件：AmbionDNase1(無RNase)(Cat#AM2222)；2U/反應(yīng)；室溫；30分鐘。對不能有效地除去DNA并且對RNA信號沒有負面的影響的DNase參考圖2。圖2顯示在與PCR試劑合并前從用DNase處理的HIV陽性干血斑提取的核酸洗脫液(虛線)與對照品(無DNase處理，實線)的比較。然后用針對β球蛋白DNA信號的β球蛋白實時PCR和針對HIV和ICRNA信號的HIV-1實時RT-PCR測定核酸。a)β球蛋白DNA信號，以顯示DNase處理的有效性，b)HIVRNA信號，以顯示DNase處理的影響，c)ICRNA信號，以顯示DNase處理的影響。用于DNase處理的條件：NewEnglandBiolabsDNaseI(無RNase)(Cat#MO303S)；2U/反應(yīng)；室溫；30分鐘。對有效地除去DNA并且負面地影響RNA信號的DNase參考圖3。圖3顯示在與PCR試劑合并前從用DNase處理的HIV陽性干血斑提取的核酸洗脫液(虛線)與對照品(無DNase處理，實線)的比較。然后用針對β球蛋白DNA信號的β球蛋白實時PCR和針對HIV和ICRNA信號的HIV-1實時RT-PCR測定核酸。a)β球蛋白DNA信號，以顯示DNase處理的有效性，b)HIVRNA信號，以顯示DNase處理的影響，c)ICRNA信號，以顯示DNase處理的影響。用于DNase處理的條件：Sigma-AldrichDNase1(擴增級)(Cat#AMPD1)；2U/反應(yīng)；室溫；30分鐘。3.當(dāng)DNase在暴露于提取的核酸之前已被引入PCR試劑，或在形成PCR反應(yīng)期間引入時，有效地降解PCR反應(yīng)中的DNA(對RNA檢測沒有負面影響)的示例性DNases是：●PromegaRQ1無RNase的DNase(Cat#M6101)；2U/反應(yīng)；室溫；10分鐘●AmbionDNaseI(無RNase)(Cat#AM2222)；2U/反應(yīng)；室溫；30分鐘●其它可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的并可使用在此描述的方法，而不用過度的實驗鑒定。本發(fā)明不限于任何特定的DNase，只要它滿足本說明書中所列的標準即可。下圖中描述的測定僅僅是示例性的并不用于將本發(fā)明限制至任何特定的DNase。對有效地除去DNA并且對RNA信號沒有負面的影響的DNase參考圖4。在圖4中，DNase被加入到PCR試劑，其隨后合并到PCR主混合物中(虛線)。作為對照品，沒有DNase加入到PCR試劑(實線)中。提取的核酸然后通過PCR主混合物測定，其中β球蛋白DNA信號，和HIV和ICRNA信號被檢測。a)β球蛋白DNA信號，以顯示DNase處理的有效性，b)HIVRNA信號，以顯示DNase處理的影響，c)ICRNA信號，以顯示DNase處理的影響。用于DNase處理的條件：PromegaRQ1無RNase的DNase(Cat#M6101)；2U/反應(yīng)；室溫；10分鐘。Abbott先前已提供現(xiàn)有技術(shù)方案。該方案被優(yōu)化到初始HIV-1DBSVL開放模式(見下表)。初始的開放模式方案被進一步優(yōu)化到目前的開放模式并用于CE產(chǎn)物的開發(fā)。下表2顯示現(xiàn)有技術(shù)方案、初始開放模式方案和進一步改進的方案之間的差別。字母"CE"是法語短語"歐共體(ConformitéEuropéene)"的縮寫，其在字面上的意義是"歐洲共同體(EuropeanConformity)"。表2現(xiàn)有技術(shù)方案、初始開放模式方案和進一步改進的方案之間的差別。如在表2中詳述的測定的變化導(dǎo)致超過現(xiàn)有技術(shù)方法的巨大的、意想不到的和令人驚訝的改進。表3顯示通過本發(fā)明的方法達到的增加的靈敏性。與100%檢測相關(guān)的目標水平從現(xiàn)有技術(shù)測定的10,000拷貝/ml下降至當(dāng)使用本發(fā)明的方法時的2,000拷貝/ml。表3對于本發(fā)明的開放模式方案(DBS洗脫條件RT20分鐘)與現(xiàn)有技術(shù)方案在檢測靈敏性的方面的比較見下表實施例3進行靈敏性和測定魯棒性改進的研究關(guān)于初始開放模式測定，約2-3%的內(nèi)部研究樣品和>5%的外部研究樣品具有m2000rt4450或4442的誤差，因而是無效的。已確定剩余胍導(dǎo)致抑制頻率和4450和4442誤差增加。HIV-1DBS應(yīng)用規(guī)范文件被修改以減少胍遺留的數(shù)量和頻率。減少廢物去除過程中的回縮速度降低了從吸液管尖懸掛的任何液滴的擴散。由于DBS樣品以1ml作為樣品輸入存在于Wash1緩沖液(DBS洗脫緩沖液)中，反應(yīng)中的溶胞緩沖液的體積可從2400減少至1600μl，減少每次反應(yīng)存在的GITC的量。通過增加Wash2體積從700至750μl來增加洗滌效力。實施這些變化減少4450和4442誤差的頻率至約0.2%(數(shù)據(jù)未示出)。這種優(yōu)化顯著提高測定的魯棒性。通過增加樣品輸入，使用兩個70μLDBS(干血斑)/每患者，可改進測試的測定靈敏性。評價數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未示出)提示，于室溫下洗脫，兩個DBS與一個DBS比較，改進了HIV低端檢測率。于55℃30分鐘洗脫條件下，兩個DBS與一個DBS比較的低HIV濃度檢測率的提高不是那么明顯。測定靈敏性也可通過增加洗脫效率來提高。進行室溫下20分鐘洗脫和55℃30分鐘洗脫的直接比較。結(jié)果(圖5)提示Ct(循環(huán)閾值)和MR(最大比例)二者通過增加溫度至55℃30分鐘而顯著地改善。55℃溫度和定時被設(shè)置在防護帶(分別在圖6和7)。結(jié)果(圖6)顯示高于60℃的溫度導(dǎo)致較低MR值?？偟膩碚f，最高MR是在55℃。圖7顯示于55℃30分鐘對于更有效的DBS洗脫是需要的。于55℃溫育30分鐘后，進一步于室溫下溫育至多24小時不影響PCR結(jié)果。此外，從DBS回收的RNA材料與直接加入樣品緩沖液的全血的比較在室溫20分鐘和55℃30分鐘之間進行。結(jié)果顯示55℃洗脫條件比室溫洗脫條件增加回收率約10%(表4)。連續(xù)攪動緩沖液中的DBS樣品與55℃洗脫條件相結(jié)合。結(jié)果顯示了從DBS的低HIV回收率有稍微的提高；所述提高沒有統(tǒng)計學(xué)意義(數(shù)據(jù)未示出)。表4.與全血比較的%回收率的計算當(dāng)DBS于55℃洗脫30分鐘對比室溫下20分鐘時，與全血比較的%回收率的提高被觀察到為約10%。一項初步分析的靈敏性評價被進行，以使用病毒學(xué)質(zhì)量保證(VQA)HIV-1稀釋平板(平板批號#2)于55℃30分鐘評估靈敏性。還使用得自SeraCare的滅活HIV-1進行了試驗，所述滅活HIV-1使用3批校準品進行定量。用來定量的校準品使用VQAHIV-1稀釋平板(平板批號#1)進行定量。結(jié)果示于表5中。LOD估計為約800拷貝/mL。表5.靈敏性估計*使用3批校準品進行定量的得自SeraCare的滅活HIV-1，所述校準品從VQA1進行定量。目前有多個商業(yè)可獲得的DBS紙卡片。重要的是顯示性能是否是可比較的。對3個不同的銷售商的DBS紙卡片進行了研究以并行比較。如果可獲得，則使用多批次的紙卡片。結(jié)果概述于表6中?；诘虷IV濃度Ct、MR和檢測率的性能是類似的。差別無統(tǒng)計學(xué)意義。表6.購自不同銷售商的DBS紙的比較。當(dāng)前第1頁1 2 3