本發(fā)明屬于小球藻功能成分CPE篩選、制備提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種小球藻功能成分CPE的高通量篩選系統(tǒng)、篩選方法，以及基于高壓破壁法制備小球藻功能成分CPE的方法。

背景技術(shù)：

微藻由于具有生長周期短、生物質(zhì)產(chǎn)率高、二氧化碳固定能力強(qiáng)、單位土地生產(chǎn)效率高且不與糧爭地等優(yōu)勢，正逐漸超越傳統(tǒng)能源作物，成為第三代新一代生物能源。雖然目前微藻能源的產(chǎn)業(yè)化研究已經(jīng)進(jìn)入中試階段，但仍困難重重，其中最主要的問題是成本高。

小球藻(Chlorella)，俗稱綠藻，是國內(nèi)外大力發(fā)展和培育的微藻能源與微藻固碳這一戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)的主要藻種之一。小球藻本身是一種營養(yǎng)豐富又安全的食物，在免疫調(diào)節(jié)等許多方面具有功效。因此，若從提取油脂后的藻渣中能提取到具有免疫調(diào)節(jié)等多種功效的高附加值產(chǎn)品，則會大幅降低以小球藻為藻種的微藻能源的生產(chǎn)成本，進(jìn)一步推動微藻能源產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。

小球藻中含有多種活性物質(zhì)，如多糖、糖蛋白、氨基酸和多肽等，具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、促進(jìn)有益菌生長、增強(qiáng)免疫、解毒、降血壓等。國內(nèi)外關(guān)于小球藻熱水提取物的應(yīng)用研究較多，研究主要集中在免疫活性的研究及通過免疫活性介導(dǎo)的抗腫瘤活性。蛋白核小球藻熱水提取物(Hot water extract of Chlorella pyrenoidosa，CPE)主要是水溶性物質(zhì)的混合物，包括核酸、多糖、多肽、蛋白、水溶性維生素等。由于CPE在小球藻中含量豐富，對于開發(fā)免疫類保健品更有價值。

Hidaka發(fā)現(xiàn)CPE可以提高營養(yǎng)不良小鼠的免疫能力，建議把小球藻作為功能食品。Yamagishi等發(fā)現(xiàn)小球藻可以治療糖代謝失調(diào)的疾病，具有治療糖尿病等人類疾病的潛在價值。但在CPE的眾多成分中究竟哪些成分具有促進(jìn)動物生長和提高免疫力功能的研究方面至今仍然是一個空白，因此進(jìn)一步研究確定CPE中的有效成分組成、結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理不僅具有基礎(chǔ)研究意義，而且具有廣泛的應(yīng)用價值。

目前，小球藻與螺旋藻、鹽藻等微藻的開發(fā)利用構(gòu)成了我國食品領(lǐng)域的一個重要分支，具有廣闊的前景。小球藻粉蛋白質(zhì)含量很高，是優(yōu)良的單細(xì)胞蛋白源，其中含有的小球藻糖蛋白大量存在于藻粉蛋白生產(chǎn)的廢水之中，若采用適當(dāng)?shù)氖侄螌⑵浞蛛x提取，將產(chǎn)生顯 著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

目前CPE提取方法種類繁多，造成了產(chǎn)物活性差異大，難以確定主組分等情況。因此在開發(fā)小球藻高附加值產(chǎn)品前，必須對眾多CPE提取方法進(jìn)行比較，從中篩選出一種適于工業(yè)化生產(chǎn)的方法。例如，由于堅韌細(xì)胞壁的存在，從小球藻中提取有效成分存在著是否破壁的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種小球藻功能成分CPE的高通量篩選系統(tǒng)、篩選方法及其制備方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種小球藻功能成分CPE的高通量篩選系統(tǒng)，包括：

1)抗氧化測試：采用Griess試劑進(jìn)行測試，通過分光光度法檢測樣品的總抗氧化能力和對自由基的清除作用；

2)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)測試：

a.四噻唑藍(lán)MTT法檢測組分對小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1存活率的影響；

b.中性紅NR染色法檢測組分對Ana-1吞噬功能的影響；

c.熒光探針法檢測樣品對Ana-1細(xì)胞內(nèi)NO分泌的改變；

3)氧化還原金屬離子螯合測試：

a.采用菲洛嗪作為Fe²⁺螯合試劑，通過分光光度法檢測樣品的Fe²⁺螯合能力；

b.采用鄰苯二酚紫作為Cu²⁺螯合試劑，通過分光光度法檢測樣品的Cu²⁺螯合能力；

4)抑制糖基化終產(chǎn)物AGEs測試：

非酶糖基化反應(yīng)體系：將10mg/mL的牛血清白蛋白BSA和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液PBS中，得非酶糖基化反應(yīng)體系；

通過熒光光譜法，分析樣品在美拉德反應(yīng)的不同階段對AGEs和pentosidine的影響。

本發(fā)明的小球藻功能成分CPE的高通量篩選系統(tǒng)，通過對現(xiàn)有的篩選平臺的改進(jìn)以及結(jié)合，提出了一種抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及糖尿病等生理功能的高通量篩選方法，活性譜范圍廣，功能活性高，便于CPE的分離提取以及小球藻功能產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種小球藻功能成分CPE的高通量篩選方法，包括：

1)抗氧化測試：取濃度為0、100、200、500、1000μg/mL樣品，加入Griess試劑，37℃反應(yīng)1min后終止反應(yīng)，以630nm為參考波長，測定反應(yīng)物在550nm處的OD值， 根據(jù)如下公式計算樣品的自由基清除能力，以樣品對˙OH的百分清除率表示；

2)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)測試：

a.四噻唑藍(lán)MTT法檢測組分對小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1存活率的影響；

具體操作如下：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以2×10⁴個/孔的密度均勻加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃、飽和濕度、含5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁并生長至適合密度(約24h)后，每孔加入不同濃度的CPE等藥物。繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，每孔加入20μL0.5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h。孵育完成后，每孔加入100μL三聯(lián)液(10％SDS，5％異丁醇，12mmol/L HCl)，37℃孵育過夜，以溶解細(xì)胞與MTT反應(yīng)所形成的紫色formazan結(jié)晶。接著震蕩混勻5min，以630nm波長為參考，檢測各孔在492nm波長處的OD值，并根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率。

b.中性紅NR染色法檢測組分對Ana-1吞噬功能的影響；

具體操作如下：Ana-1細(xì)胞經(jīng)CPE等樣品處理一定時間后，每孔加新鮮配制的0.1％NR懸濁液20μL，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3h。之后小心吸棄含有NR的培養(yǎng)液，用生理PBS輕柔洗去未被吞噬的NR。每孔加150μL細(xì)胞裂解液(無水乙醇:乙酸＝1:1(v/v))，靜置2h，使細(xì)胞溶解，震蕩混勻后測定540nm處OD值。細(xì)胞對NR的吞噬率計算方式同上述公式c.熒光探針法檢測樣品對Ana-1細(xì)胞內(nèi)NO分泌的改變；

具體操作如下：用DAF-FM DA稀釋液將熒光探針DAF-FM DA稀釋至終濃度5μmol/L。取足量對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化并吹散，離心收集后用pH 7.4的生理PBS洗滌一次。以稀釋好的DAF-FM DA工作液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁶個/mL，37℃孵育20min。期間每隔3-5min將混合物顛倒混勻，使探針和細(xì)胞充分接觸。PBS洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。將裝載好的細(xì)胞均勻鋪入96孔黑色細(xì)胞培養(yǎng)板中，并加入不同濃度的CPE樣品。37℃溫浴一定時間后，檢測各孔在495/515nm激發(fā)/發(fā)射波長下的熒光值，并計算各樣品作用下Ana-1細(xì)胞NO水平的改變。

3)氧化還原金屬離子螯合測試：

a.Fe²⁺螯合測試

在pH 4.9的HAc-NaAc緩沖液中加入5mmol/L的相應(yīng)金屬離子溶液，使其終濃度為1.25mmol/L；

以濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品；

各反應(yīng)管內(nèi)用蒸餾水補(bǔ)足，使每個體系體積達(dá)到240μL，室溫反應(yīng)30min；

反應(yīng)結(jié)束后，加入50mmol/L的菲洛嗪溶液顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)下述公式計算樣品對Fe²⁺的螯合率；

b.Cu²⁺螯合測試

在pH 6.0的HAc-NaAc緩沖液中加入5mmol/L的相應(yīng)金屬離子溶液，使其終濃度為1.25mmol/L；

以濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品；

各反應(yīng)管內(nèi)用蒸餾水補(bǔ)足，使每個體系體積達(dá)到240μL，室溫反應(yīng)30min；

反應(yīng)結(jié)束后，加入20mmol/L的鄰苯二酚紫溶液顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)下述公式計算樣品對Cu²⁺的螯合率；

4)抑制糖基化終產(chǎn)物AGEs測試：

將10mg/mL的牛血清白蛋白BSA和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液PBS中，非酶糖基化反應(yīng)體系；

將樣品加入到上述反應(yīng)體系中孵育，使其終濃度分別為10，100，和1000μg/mL，同時以單獨孵育在PBS中的10mg/mL BSA為空白對照；

所有樣品經(jīng)直徑0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌，在37℃避光孵育1、3、7、14、28、42d后，將孵育產(chǎn)物稀釋至1mg/mL，分別檢測孵育產(chǎn)物在370/440nm和335/385nm處的熒光值；

以1mg/mL BSA的熒光值為一個熒光單位，根據(jù)下述公式計算CPE作用下孵育產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度FI；

本發(fā)明的小球藻功能成分CPE的高通量篩選方法，通過對現(xiàn)有的篩選平臺的改進(jìn)以及結(jié)合，提出了一種抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及糖尿病等生理功能的高通量篩選方法，活性譜范圍廣，功能活性高，便于CPE的分離提取以及小球藻功能產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種小球藻功能成分CPE的制備方法，包括：

1)將蛋白核小球藻藻粉加入蒸餾水中，于壓強(qiáng)0.05-0.25MPa，溫度110-130℃下，加熱30-60min，進(jìn)行萃?。?/p>

2)取出樣品，室溫下冷卻后，10000rpm離心30min，上清液經(jīng)減壓抽濾后，4℃保存?zhèn)溆茫?

3)將步驟2)離心后的藻泥，加入與1)等體積蒸餾水重懸，于壓強(qiáng)0.1MPa，溫度110-130℃下，加熱30-60min，再次萃??；

4)取出樣品，室溫下冷卻后，10000rpm離心30min，取上清液，減壓抽濾，合并兩次濾液，冷凍干燥，制得小球藻CPE提取物粉末。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的壓強(qiáng)為0.05-0.25MPa。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的溫度為110-130℃。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的加熱時間為30-60min。

所述步驟1)中的蛋白核小球藻藻粉均勻懸浮于蒸餾水中，蛋白核小球藻藻粉與蒸餾水的配比為1g:10ml。

優(yōu)選的，所述步驟3)中的壓強(qiáng)為0.05-0.25MPa。

優(yōu)選的，所述步驟3)中的溫度為110-130℃。

優(yōu)選的，所述步驟3)中的加熱時間為30-60min。

所述的萃取是用高壓熱水法進(jìn)行萃取。

本發(fā)明的基于高壓破壁法制備小球藻CPE的方法，該方法僅需水和常見設(shè)備高壓釜，破壁和提取同步進(jìn)行，破壁充分，操作步驟少，所需時間顯著縮短，具有成本低、無污染又快速簡便等多方面的優(yōu)點。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果如下：

本發(fā)明通過引入高壓破壁技術(shù)，實現(xiàn)了小球藻CPE的高效制備。經(jīng)本發(fā)明方法提取的小球藻CPE，得率高達(dá)251.67mg/g藻粉，且提取物中的核酸和蛋白質(zhì)含量豐富，CPE活性高，非常適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，為小球藻高附加值生物活性物質(zhì)的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)，以 降低微藻能源的開發(fā)成本，提高微藻能源的綜合利用度。

附圖說明

圖1為兩種CPE對˙OH的清除率；

圖2為兩種CPE對Ana-1存活率的影響；

圖3為CPE1對Ana-1存活率以及Ana-1對NR的細(xì)胞吞噬率的影響；

圖4為CPE1對Fe²⁺的螯合作用；

圖5為CPE1對Cu²⁺的螯合作用；

圖6為CPE1對總AGEs和penosidine形成的影響；

圖7不同提取方法所制備的CPE得率；

圖8為四種CPE粗品對˙OH的清除率；

圖9為四種CPE對巨噬細(xì)胞Ana-1存活率的影響；

圖10為四種CPE粗提物對Fe²⁺和Cu²⁺的螯合率。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

小球藻功能成分CPE的高通量活性篩選系統(tǒng)

1)抗氧化測試：采用Griess試劑進(jìn)行測試，通過分光光度法檢測樣品的總抗氧化能力和對自由基的清除作用；

2)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)測試：

a.四噻唑藍(lán)MTT法檢測組分對小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1存活率的影響；

b.中性紅NR染色法檢測組分對Ana-1吞噬功能的影響；

c.熒光探針法檢測樣品對Ana-1細(xì)胞內(nèi)NO分泌的改變；

3)氧化還原金屬離子螯合測試：

a.采用菲洛嗪作為Fe²⁺螯合試劑，通過分光光度法檢測樣品的Fe²⁺螯合能力；

b.采用鄰苯二酚紫作為Cu²⁺螯合試劑，通過分光光度法檢測樣品的Cu²⁺螯合能力；

4)抑制糖基化終產(chǎn)物AGEs測試：

非酶糖基化反應(yīng)體系：將10mg/mL的牛血清白蛋白BSA和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液PBS中，得非酶糖基化反應(yīng)體系；

通過熒光光譜法，分析樣品在美拉德反應(yīng)的不同階段對AGEs和pentosidine的影響。

實施例2

本實施例中CPE1和CPE2選取的是通過超聲酶解法制得，具體方法為：10g蛋白核小球藻粉均勻懸浮于100mL蒸餾水中。超聲破壁30min后，于95℃水浴中提取30min。待提取液冷卻后，加入纖維素酶(80mg/g藻粉)、果膠酶(10mg/g藻粉)。50℃水浴2h，對多糖進(jìn)行降解。沸水浴30min使酶滅活，10000rpm離心30min。收集上清液，按4倍體積濃縮，并冷凍干燥，得到CPE超聲酶解產(chǎn)物，其中CPE1酶解了4h，CPE2則酶解了16h。

小球藻功能成分CPE的高通量活性篩選方法

1)抗氧化能力測試，即清除羥自由基(˙OH)能力測試

測試方法：取0、100、200、500、1000μg/mL濃度樣品，加入Griess試劑，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)1min后終止反應(yīng)，以630nm為參考波長，測定反應(yīng)物在550nm處的OD值。

樣品的自由基清除能力，根據(jù)公式進(jìn)行計算，以樣品對˙OH的百分清除率表示，公式如下：

結(jié)果分析：如圖1所示(兩種CPE對˙OH的清除率，n＝6；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01)，兩種CPE對體系中的˙OH均有一定的清除能力，且這種清除能力與濃度正相關(guān)，隨著參試濃度的提高，清除率增加。尤其是在濃度達(dá)到1000μg/mL時，CPE1對˙OH的清除率達(dá)到29.46％(p<0.01)，而CPE2對˙OH具有更高的清除能力，其清除率達(dá)到34.05％(p<0.01)。

2)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能測試

a.Ana-1的細(xì)胞存活率測試

具體操作如下：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以2×10⁴個/孔的密度均勻加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃、飽和濕度、含5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁并生長至適合密度(約24h)后，每孔加入不同濃度的CPE等藥物。繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后，每孔加入20μL0.5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h。孵育完成后，每孔加入100μL三聯(lián)液(10％SDS，5％異丁醇，12mmol/L HCl)，37℃孵育過夜，以溶解細(xì)胞與MTT反應(yīng)所形成的紫色formazan結(jié)晶。接著震蕩混勻5min，以630nm波長為參考，檢測各孔在492nm波長處的OD值，并根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率。

結(jié)果分析：如圖2所示(兩種CPE對Ana-1存活率的影響n＝5；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01)，在0-500μg/mL的濃度范圍內(nèi)，兩種CPE對Ana-1無明顯細(xì)胞毒性作用，反而促進(jìn)細(xì)胞增殖，但細(xì)胞的增殖率基本低于10％。

如圖3所示(CPE1對Ana-1存活率的影響，n＝6；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01)將CPE1的最高參試濃度提高到1000μg/mL后發(fā)現(xiàn)，CPE1雖在低濃度時對Ana-1細(xì)胞的生長無顯著影響，但當(dāng)其參試濃度高于600μg/mL時，可使巨噬細(xì)胞的存活率顯著提高到對照組的120％左右。上述研究結(jié)果表明，CPE無明顯細(xì)胞毒作用，反而有利于巨噬細(xì)胞的增殖。

b.Ana-1細(xì)胞吞噬功能測試

具體操作如下：Ana-1細(xì)胞經(jīng)CPE等樣品處理一定時間后，每孔加新鮮配制的0.1％NR懸濁液20μL，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3h。之后小心吸棄含有NR的培養(yǎng)液，用生理PBS輕柔洗去未被吞噬的NR。每孔加150μL細(xì)胞裂解液(無水乙醇:乙酸＝1:1(v/v))，靜置2h，使細(xì)胞溶解，震蕩混勻后測定540nm處OD值。細(xì)胞對NR的吞噬率計算方式同上述公式。

結(jié)果分析：如圖3所示(Ana-1對NR的細(xì)胞吞噬率的影響，n＝6；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01)在CPE1作用下，細(xì)胞對NR的吞噬活性顯著增強(qiáng)。在CPE1濃度為200μg/mL時，Ana-1對NR的細(xì)胞吞噬率增加到對照組的156.00％(p<0.05)；當(dāng)CPE1濃度提高到600μg/mL時，細(xì)胞吞噬率可達(dá)到對照組的211.72％(圖3，p<0.01)。與相同條件下的細(xì)胞存活率的遞增相比，Ana-1的細(xì)胞吞噬率增加幅度明顯高于前者。

3)氧化還原金屬離子螯合測試

a.CPE的Fe²⁺螯合能力測試

在200μL pH 4.9的HAc-NaAc緩沖液中加入10μL 5mmol/L的FeSO₄(終濃度為1.25mmol/L)。以20μL濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品20μL。各反應(yīng)管內(nèi)用蒸餾水補(bǔ)足，使每個體系體積達(dá)到240μL。室溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，加入20μL 50mmol/L的FZ(菲洛嗪)溶液，顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)下述公式計算樣品對Fe²⁺的螯合率：

結(jié)果分析：如圖4所示(CPE1對Fe²⁺的螯合作用)，金屬離子螯合陽性對照物EDTA，能夠呈濃度依賴性地螯合體系內(nèi)的Fe²⁺；當(dāng)其濃度達(dá)到7.5mmol/L時，EDTA對Fe²⁺的螯合率達(dá)到99.72％。但CPE1對Fe²⁺基本沒有螯合作用。

b.CPE的Cu²⁺螯合能力測試

在200μL pH 6.0的HAc-NaAc緩沖液中加入10μL 5mmol/L的CuSO₄(終濃度為1.25mmol/L)。以20μL濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品20μL。各反應(yīng)管內(nèi)用蒸餾水補(bǔ)足，使每個體系體積達(dá)到240μL。室溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，加入5μL 20mmol/L的PV(鄰苯二酚紫)溶液，顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)下述公式計算樣品對Cu²⁺的螯合率：

結(jié)果分析：如圖5所示(CPE1對Cu²⁺的螯合作用)，陽性對照物EDTA在5mmol/L時，對Cu²⁺的螯合能力達(dá)到83.80％，且CPE1對Cu²⁺也有螯合作用，且隨著CPE1濃度的增加，螯合作用增強(qiáng)。

4)抑制糖基化終產(chǎn)物(AGEs)能力測試

將10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)中，成為蛋白質(zhì)非酶糖基化的體外反應(yīng)體系。將CPE加入到非酶糖基化孵育體系中，使其終濃度為10，100，和1000μg/mL，同時以單獨孵育在PBS中的10mg/mL BSA為空白對照。所有樣品經(jīng)直徑0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌，在37℃避光孵育1、3、7、14、28、42d后，將孵育產(chǎn)物稀釋至1mg/mL，分別檢測孵育產(chǎn)物在370/440nm和335/385nm 處的熒光值。以1mg/mL BSA的熒光值為一個熒光單位，根據(jù)下述公式計算CPE作用下孵育產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度(FI)。

結(jié)果分析：335/385nm和370/440nm分別是AGEs組分之一的pentosidine和總AGEs的特征性的熒光激發(fā)和發(fā)射波長。通過定期檢測335/385nm和370/440nm處FI的改變，研究CPE在美拉德反應(yīng)的不同階段對AGEs和pentosidine水平的影響。美拉德反應(yīng)共持續(xù)進(jìn)行了4周，CPE對AGEs形成的動態(tài)影響如圖6所示(CPE1對總AGEs和penosidine形成的影響，n＝4；A為CPE1對總AGEs形成的影響，B為CPE1對AGEs前體物penosidine形成的影響；與AGEs組相比，#p<0.05，##p<0.01)，兩種CPE在美拉德反應(yīng)的前期，尤其是第1天和第3天，對總AGEs和penosidine的形成均具有促進(jìn)作用，且參試物的濃度越高，其促進(jìn)作用越大(p<0.05)；但隨著孵育時間的不斷延長，尤其是從第3周開始，CPE對AGEs形成的促進(jìn)作用逐漸消失，并抑制總AGEs的形成，而penosidine水平的增加也得到緩解。

上述結(jié)果提示，CPE在防治糖尿病慢性并發(fā)癥方面具有一定的潛力。

以下實施例說明了小球藻功能成分CPE的4種不同制備方法，并對提取產(chǎn)物采用上述篩選系統(tǒng)進(jìn)行測試，具體說明如下：

實施例3

基于高壓破壁法制備小球藻功能成分CPE的方法

取10g蛋白核小球藻藻粉，均勻懸浮于100mL蒸餾水。置于高壓鍋中，在0.15MPa，120℃下加熱40min。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，上清液經(jīng)減壓抽濾后，于4℃保存?zhèn)溆?。離心后的藻泥，加入100mL蒸餾水重懸，置于高壓鍋中，在0.15MPa，120℃下加熱40min，再次萃取。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，取上清液，減壓抽濾。合并兩次濾液，冷凍干燥，得CPE提取物粉末，標(biāo)記為CPE-a。

實施例4

基于高壓破壁法制備小球藻CPE的方法

取10g蛋白核小球藻藻粉，均勻懸浮于100mL蒸餾水。置于高壓鍋中，在0.05MPa，110℃下加熱60min。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，上清液經(jīng)減壓 抽濾后，于4℃保存?zhèn)溆谩ｋx心后的藻泥，加入100mL蒸餾水重懸，置于高壓鍋中，在0.05MPa，110℃下加熱60min，再次萃取。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，取上清液，減壓抽濾。合并兩次濾液，冷凍干燥，得CPE提取物粉末。

實施例5

基于高壓破壁法制備小球藻CPE的方法

取10g蛋白核小球藻藻粉，均勻懸浮于100mL蒸餾水。置于高壓鍋中，在0.25MPa，130℃下加熱30min。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，上清液經(jīng)減壓抽濾后，于4℃保存?zhèn)溆?。離心后的藻泥，加入100mL蒸餾水重懸，置于高壓鍋中，在0.25MPa，130℃下加熱30min，再次萃取。取出樣品，于室溫下冷卻。10000rpm離心30min，取上清液，減壓抽濾。合并兩次濾液，冷凍干燥，得CPE提取物粉末。

對比實施例1

超聲破壁法提取

10g蛋白核小球藻粉均勻懸浮于100mL蒸餾水中。超聲破壁30min后，于95℃水浴中提取30min。待提取液冷卻后，將懸液于10000rpm離心30min，上清液按4倍體積濃縮后4℃保存?zhèn)溆?。藻泥重懸于等量蒸餾水，并再次超聲提取和離心。合并兩次上清液，按4倍體積濃縮，并冷凍干燥，得到CPE粗提物，標(biāo)記為CPE-b。

對比實施例2

超聲酶解法提取

10g蛋白核小球藻粉均勻懸浮于100mL蒸餾水中。超聲破壁30min后，于95℃水浴中提取30min。待提取液冷卻后，加入纖維素酶(80mg/g藻粉)、果膠酶(10mg/g藻粉)。50℃水浴2h，對多糖進(jìn)行降解。沸水浴30min使酶滅活，10000rpm離心30min。收集上清液，按4倍體積濃縮，并冷凍干燥，得到CPE超聲酶解產(chǎn)物，標(biāo)記為CPE-c。

對比實施例3

酶解法提取

10g蛋白核小球藻藻粉均勻懸浮于100mL蒸餾水中。藻粉懸液置于70℃水浴中浸泡10h。浸泡后的小球藻粉懸浮液中，按80mg/g藻粉及10mg/g藻粉的比例，加入果膠酶及 纖維素酶，于50℃水浴酶解12h，形成破壁藻泥。果膠酶及纖維素酶酶解結(jié)束后，以100mg/L和30mg/L的濃度加入蛋白酶K和核糖核酸酶A(RNase A)，50℃水浴酶解2h。RNase等酶解結(jié)束后，小球藻酶解產(chǎn)物于100℃水浴滅酶活30min。10000rpm離心30min，取上清液。上清液按4倍體積濃縮后冷凍干燥，得CPE提取物粉末，標(biāo)記為CPE-d。

提取物評價測試：

將上述各實施例的提取產(chǎn)物：高壓破壁法(產(chǎn)物為CPE-a)、超聲破壁法(產(chǎn)物為CPE-b)、超聲破壁-酶解法(產(chǎn)物為CPE-c)，以及酶解法(產(chǎn)物為CPE-d)，分別進(jìn)行得率、熱水提取物指標(biāo)值(OD₂₆₀)、蛋白質(zhì)和糖含量，以及生物活性等評價測試。

1、得率及成分分析

從圖1可以看出(CPE-e為經(jīng)典溫?zé)岱ǖ玫降腃PE提取物)，本發(fā)明中，CPE-b的得率明顯低于其他三種產(chǎn)物，表明超聲破壁和常規(guī)熱水提取的效率非常低。當(dāng)超聲破壁得到酶解破壁輔助后，產(chǎn)物得率顯著提高，從CPE-b的148.36mg/g藻粉迅速上升至CPE-c的279.25mg/g藻粉。CPE-a，CPE-c，和CPE-d三種產(chǎn)物的得率均較高，分別為251.67，279.25，和258.85mg/g藻粉(圖7)。

CPE-a的得率高，為251.67mg/g藻粉的產(chǎn)物。上述結(jié)果表明，在高壓破壁提取法中，適當(dāng)延長提取時間、增加提取次數(shù)有助于提取效率的提升。

由于酶本身價格昂貴，反應(yīng)后難以徹底去除，且酶解反應(yīng)操作步驟復(fù)雜，耗時過長，以酶解方法制備CPE并不可取。

而高壓破壁法僅需水和常見設(shè)備高壓釜，破壁和提取同步進(jìn)行，操作步驟少，所需時間也較酶解法顯著縮短，具有低成本、無污染又快速簡便等多方面的優(yōu)點。因此，從產(chǎn)物得率考慮，高壓破壁法是制備CPE高效方法。

2、蛋白質(zhì)和含糖量分析

通過對四種產(chǎn)物進(jìn)行紫外吸收分析，結(jié)果顯示四種產(chǎn)物均具有豐富的蛋白質(zhì)和核酸，其中CPE-a是四種提取物中核酸和蛋白質(zhì)含量最豐富的物質(zhì)。

后期通過苯酚-硫酸法檢測總糖含量、DNS法檢測還原糖含量以及考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如表1所示。

表1 CPE產(chǎn)物的蛋白質(zhì)和糖含量分析(n＝3)

注：OD1200、OD5000為市售“CGF”商品

與OD1200相比，**p<0.01；與OD5000相比，##p<0.01；

與CPE-a相比，+p<0.05，++p<0.01。n未檢出

與紫外吸收比較結(jié)果相似，四種產(chǎn)物中CPE-a的蛋白質(zhì)含量最高。采用考馬斯亮藍(lán)法，CPE-a的蛋白質(zhì)含量均顯著高于OD1200(p<0.01)，而CPE-c和CPE-d的蛋白質(zhì)含量顯著低于OD5000。

糖含量檢測結(jié)果顯示，四種CPE的總糖含量低于兩種“CGF”對照(p<0.01)，但其中CPE-c和CPE-d的糖含量較CPE-a豐富(p<0.05)。此外，除了CPE-c，其余產(chǎn)物中檢測不到還原糖的存在。

3、活性分析

1)四種CPE的˙OH清除能力

測試方法：取濃度為0、100、200、500、1000μg/mL的上述4種樣品，加入Griess試劑，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)1min后終止反應(yīng)，以630nm為參考波長，測定反應(yīng)物在550nm處的OD值。樣品的自由基清除能力，根據(jù)公式進(jìn)行計算，以樣品對˙OH的百分清除率表示。

從圖2分析四種CPE對˙OH的清除率比較(n＝6；與空白對照相比，*p<0.05，**p<0.01；與CPE-a相比，+p<0.05，++p<0.01)，上述四種CPE均具有清除˙OH的能力，且隨著參試濃度的提高，清除率逐漸上升。在同一參試濃度對四種CPE的清除率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CPE-a對˙OH的清除效果最佳，在40-400μg/mL范圍內(nèi)，其余三種CPE的˙OH清除率均顯著低于CPE-a(p<0.05)；當(dāng)濃度提高到1000μg/mL時，CPE-a對˙OH的清 除率可達(dá)到74.31％。

2)四種CPE對巨噬細(xì)胞存活率的影響

從圖3分析四種CPE對巨噬細(xì)胞Ana-1存活率的影響(n＝6；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01；與CPE-a相比，+p<0.05，++p<0.01)，四種CPE能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞Ana-1增殖。在25-200μg/mL的濃度范圍內(nèi)，四種CPE均能以濃度依賴的方式促進(jìn)Ana-1細(xì)胞增殖，其中以CPE-a的作用最佳，在100μg/mL時，CPE-a對Ana-1的促增殖率顯著高于其他三種CPE(p<0.05)；200μg/mL時，CPE-a使Ana-1的存活率提高到162.98％，其他三種CPE的促增殖作用極顯著低于CPE-a(p<0.01)。

3)四種CPE的金屬離子螯合能力

測試方法：在200μL pH 4.9(Fe²⁺螯合測試)或pH 6.0(Cu²⁺螯合測試)的HAc-NaAc緩沖液中各加入10μL 5mmol/L的相應(yīng)金屬離子溶液(終濃度為1.25mmol/L)。以20μL濃度為2.5，5.0，和7.5mmol/L的EDTA溶液作為陽性對照，其余為不同濃度的CPE樣品20μL。各反應(yīng)管內(nèi)用蒸餾水補(bǔ)足，使每個體系體積達(dá)到240μL。室溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，分別加入20μL 50mmol/L的FZ(菲洛嗪)溶液(Fe²⁺螯合測試)或5μL 20mM的PV(鄰苯二酚紫)溶液(Cu²⁺螯合測試)顯色30min，檢測其在535nm或612nm處的OD值，根據(jù)上述公式計算樣品對Cu²⁺和Fe²⁺的螯合率。

從圖4分析四種CPE粗提物對Fe²⁺和Cu²⁺的螯合率(n＝3；與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01；與CPE-a相比，+p<0.05)，在濃度低于1mg/mL時，四種CPE對Fe²⁺基本上沒有螯合作用，但當(dāng)濃度達(dá)到10mg/mL時，四種CPE均表現(xiàn)出一定的Fe²⁺螯合能力(p<0.01)。

四種CPE對Cu²⁺均有一定的螯合作用，且隨著CPE參試濃度的提高，螯合率也相應(yīng)增加。在1mg/mL時，各組對Cu²⁺的螯合率均低于10％(p<0.05)，且各組之間無顯著差異；當(dāng)濃度達(dá)到10mg/mL時，四種CPE對Cu²⁺的螯合能力相應(yīng)提高。

4)四種CPE對AGEs形成的影響

測試方法：將10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)和0.5mol/L的葡萄糖溶解于0.02mol/L的磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)中，成為蛋白質(zhì)非酶糖基化的體外反應(yīng)體系。將CPE加入到非酶糖基化孵育體系中，使其終濃度為10，100，和1000μg/mL，同時以單獨孵育在PBS 中的10mg/mL BSA為空白對照。所有樣品經(jīng)直徑0.22μm的微孔濾膜抽濾滅菌，在37℃避光孵育1、3、7、14、28、42d后，將孵育產(chǎn)物稀釋至1mg/mL，分別檢測孵育產(chǎn)物在370/440nm和335/385nm處的熒光值。以1mg/mL BSA的熒光值為一個熒光單位，根據(jù)上述公式計算CPE作用下孵育產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度(FI)。

采用上述小球藻功能成分CPE的篩選系統(tǒng)及篩選方法，對4種不同制備方法得到的小球藻功能成分CPE進(jìn)行篩選評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過高壓破壁法制備的小球藻功能成分CPE綜合評價最好，且該制備方法簡單，成本低，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。