專利名稱：一種提高量子點(diǎn)編碼微球的編碼穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物篩選和納米技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高量子點(diǎn)(QDs)編碼微球的編碼穩(wěn)定性的方法，這種微球可在多元化檢測(cè)和分析領(lǐng)域有很廣闊的用途，尤其有利于新型自編碼光譜識(shí)別高通量藥物篩選系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)。
背景技術(shù)：
基于編碼微球的多元化分析檢測(cè)是目前藥物開發(fā)研究中的熱點(diǎn)，其中，利用納米量子點(diǎn)(QDs)的發(fā)光特性對(duì)微球進(jìn)行編碼是近年才提的新思路，該方法在藥物篩選和納米技術(shù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其適用于新型自編碼光譜識(shí)別高通量藥物篩選系統(tǒng)的構(gòu)建。
在量子點(diǎn)編碼微球的制備過(guò)程中，將不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)按照一定比例吸附在微球表面或者滲入到微球內(nèi)部，從而對(duì)微球進(jìn)行特定編碼。微球的編碼信號(hào)主要是由兩個(gè)因素組成的發(fā)射波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度。發(fā)射波長(zhǎng)是QDs本身固有特性，與濃度無(wú)關(guān)；而熒光強(qiáng)度則與微球中所負(fù)載的量子點(diǎn)的數(shù)量有關(guān)。因此，雖然QDs有窄的半峰寬(20～30nm)，但是在可見光400～700nm范圍內(nèi)，考慮到波長(zhǎng)重疊問(wèn)題，能夠用來(lái)編碼的QDs的種類也是有限的。要產(chǎn)生盡量多的編碼，必須對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行重點(diǎn)考慮，即嚴(yán)格控制負(fù)載在微球上的QDs的數(shù)量。然而，在已報(bào)道的編碼技術(shù)中，作為編碼信號(hào)的量子點(diǎn)都存在不同程度的泄漏，這導(dǎo)致了微球中量子點(diǎn)數(shù)量的改變從而影響到編碼的穩(wěn)定性，嚴(yán)重阻礙了利用不同波長(zhǎng)、多個(gè)熒光強(qiáng)度的QDs對(duì)微球進(jìn)行密集編碼的實(shí)現(xiàn)。見Shuming Nie et al.，NatureBiotech.2001.19.631-635.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高量子點(diǎn)編碼微球的編碼穩(wěn)定性的方法，該方法可以很好地抑制微球中量子點(diǎn)的泄漏，提高量子點(diǎn)編碼的穩(wěn)定性和編碼信號(hào)的精確性。
本發(fā)明提供的一種提高量子點(diǎn)編碼微球的編碼穩(wěn)定性的方法，其步驟為(1)對(duì)待編碼的微球表面進(jìn)行功能化修飾和多孔化處理；(2)將處理后的微球放入量子點(diǎn)溶液中，吸附到編碼溶液中的熒光強(qiáng)度不再變化后，取出微球進(jìn)行充分洗滌；(3)將上述量子點(diǎn)編碼微球加入到環(huán)己烷、氨水、硅酸酯的混合溶液，其中硅酸酯的體積百分比為1～10％，氨水的體積百分比為0.04-4％，通過(guò)硅酸酯水解反應(yīng)形成硅顆粒沉積在編碼微球表面，形成一層外殼；(4)將上述被包埋的量子點(diǎn)編碼微球與生物探針連接。
步驟(1)采用采用氯磺酸的二氯甲烷溶液對(duì)待編碼的微球表面進(jìn)行多孔化處理，其中，氯磺酸的體積百分比為0.3-1％。
本發(fā)明將量子點(diǎn)的熒光光譜特性轉(zhuǎn)換為微球的編碼信號(hào)，進(jìn)而對(duì)微球進(jìn)行包被處理以獲得穩(wěn)定的編碼特征。本發(fā)明以提高多孔性微顆粒的熒光編碼特別是量子點(diǎn)編碼精確性及其穩(wěn)定性為研究對(duì)象；本發(fā)明通過(guò)對(duì)微顆粒進(jìn)行處理，使其表面既有功能化接枝的“手臂”分子，又產(chǎn)生多孔性；本發(fā)明還通過(guò)對(duì)摻入多孔性微球的量子點(diǎn)進(jìn)行固定化包被處理，保護(hù)摻入的量子點(diǎn)不被氧化和保護(hù)微球不受化學(xué)試劑或者生物試劑的破壞。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，可以推廣到各種微球的編碼應(yīng)用上，同時(shí)還有助于實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確識(shí)別，尤其可以促進(jìn)新型自編碼光譜識(shí)別高通量藥物篩選系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)。


圖1(a)為量子點(diǎn)的紫外吸收?qǐng)D，圖1(b為量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜圖；
圖2為微球的紅外光譜圖其中(a)原始微球；(b)-COOH功能化的微球；(c)硅包被微球；圖3為SEM掃描電鏡下微球表面的形貌圖(A)磺化接枝前的微球表面形貌；(B)磺化接枝后的微球表面形貌；圖4為硅包被4小時(shí)微球表面的SEM形貌圖；圖5為硅包被對(duì)微球上-COOH含量的影響；圖6為不同包被時(shí)間對(duì)量子點(diǎn)泄漏的影響；圖7為不同包被時(shí)間對(duì)量子點(diǎn)熒光半衰期(t1/2)的影響，半衰期是通過(guò)指數(shù)曲線擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到的，0小時(shí)是指沒(méi)有包被的微球；圖8為不同處理?xiàng)l件下微球的熒光光譜圖其中(A)PS+DNA；(B)PS+EDC+DNA-FITC；(C)PS-COOH+DNA-FITC；(D)PS-COOH+EDC+DNA-FITC；硅包被條件均為4小時(shí)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的具體步驟為(1)對(duì)待編碼的微球表面進(jìn)行功能化修飾和多孔化處理；對(duì)各種納米或微米級(jí)的微球(如聚合物微球、硅顆粒)，通過(guò)物理吸附或化學(xué)反應(yīng)使該微球具備功能化表面，即微球的表面修飾有氨基、羧基、巰基、羥基、鹵素基(包括氟、氯、溴、碘)的分子。
功能化修飾和多孔化處理可同步或分步進(jìn)行，不受操作順序限制。
采用氯磺酸的二氯甲烷溶液對(duì)待編碼的微球表面進(jìn)行多孔化處理，其中，氯磺酸的體積百分比為0.3-1％。
多孔化處理也可以采用含有甲基丙烯酸酯或苯乙烯同系物的化學(xué)試劑。
(2)對(duì)上述微球進(jìn)行量子點(diǎn)編碼將處理后的微球放入QDs溶液中，吸附到編碼溶液中的熒光強(qiáng)度不再變化后，取出微球進(jìn)行充分洗滌。
其中QDs溶液的配制為根據(jù)編碼信號(hào)的波長(zhǎng)和相對(duì)強(qiáng)度，分別將其轉(zhuǎn)化成量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)和摩爾濃度，再根據(jù)發(fā)射波長(zhǎng)確定溶液中量子點(diǎn)的種類，根據(jù)摩爾濃度確定這些量子點(diǎn)的濃度比例。
(3)對(duì)量子點(diǎn)編碼微球進(jìn)行穩(wěn)定化處理將上述量子點(diǎn)編碼微球加入到包被液中，通過(guò)包被液中的硅酸酯在堿性條件下水解形成硅顆粒沉積在編碼微球表面從而形成一層外殼，其厚度通過(guò)包被時(shí)間米控制，該外殼對(duì)其負(fù)載的量子點(diǎn)進(jìn)行包埋處理。
其中包被液為環(huán)己烷、氨水、硅酸酯的混合溶液，其中硅酸酯的體積百分比為1～10％，氨水的體積百分比為0.04-4％。
(4)連接量子點(diǎn)編碼微球與生物探針。
生物探針包括蛋白質(zhì)、核酸、糖類、肽等生物分子或醇和羧酸。針對(duì)不同的生物探針，采用相應(yīng)的物理吸附或發(fā)生共價(jià)化學(xué)反應(yīng)連接量子點(diǎn)編碼微球與生物探針。
包被后表面修飾的功能化分子在與生物探針連接后通過(guò)光譜儀能實(shí)現(xiàn)對(duì)探針信號(hào)的檢測(cè)。
實(shí)施例1下面以量子點(diǎn)編碼聚苯乙烯樹脂微球(PS)的制備為例，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施做詳細(xì)說(shuō)明。
(1)稱取0.5g微球，加入含0.8％(vol)氯磺酸的二氯甲烷溶液，攪拌反應(yīng)0.5小時(shí)，吸出殘液，再加入10ml含有4g 6-氨基正己酸的環(huán)己烷/蒸餾水(1∶1，體積比)溶液，攪拌反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾取出微球，用0.1M HCl和0.1M的NaOH溶液交替洗滌3次后用蒸餾水洗滌3次，干燥。圖2是通過(guò)磺化接枝處理后微球的紅外光譜圖，圖3(B)是通過(guò)磺化處理后的微球。
(2)將步驟(1)所得微球0.45g放入5ml QDs溶液中，振蕩吸附1小時(shí)，離心，用乙醇洗滌微球至乙醇?xì)堃褐袩o(wú)熒光，干燥得到量子點(diǎn)編碼微球。
上述QDs溶液為氯仿/正丁醇(9∶1，體積比)混合液稀釋發(fā)射波長(zhǎng)在571nm的QDs，使最終的濃度為10-7M。量子點(diǎn)的紫外及其發(fā)射光譜見圖1。
(3)將0.40g量子點(diǎn)編碼微球加入到含有7.5ml環(huán)己烷、0.2ml氨水(26％，w％)混合液中，再加入0.5ml正硅酸乙酯(TEOS)，振蕩反應(yīng)2小時(shí)，過(guò)濾取出微球，用乙醇洗滌3次，干燥；改變反應(yīng)時(shí)間為4、6、8、12、24小時(shí)，分別重復(fù)此步操作。圖2(c)是硅包被后的紅外光譜圖。圖4為包被時(shí)間為4小時(shí)的表面形貌圖。
稱取0.1g步驟(3)處理后的微球用3ml的KOH的甲醇溶液(含KOH為2.771mmol)浸泡24h，過(guò)濾后保留殘液用蒸餾水洗滌3次，定容至6ml，取2ml稀釋成5ml，用0.01M的HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，作3次平行試驗(yàn)，計(jì)算在不同的硅包被時(shí)間下，微球表面的-COOH的含量。結(jié)果見圖5，包被4小時(shí)剩余-COOH的含量在2.1mmol/g左右。
包被后的微球0.05g用5ml氯仿浸泡，振蕩，每隔一段時(shí)間測(cè)氯仿中的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖6。
不同包被時(shí)間的單個(gè)編碼微球在倒置Olympus(IX71)顯微鏡下用汞燈(λ＝400~440nm)連續(xù)激發(fā)，通過(guò)光纖與顯微鏡相連的光譜儀測(cè)量其熒光強(qiáng)度的變化，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)指數(shù)擬合。見圖7，包被時(shí)間4小時(shí)的值是530秒左右。
(4)經(jīng)過(guò)步驟(3)處理后的微球0.01g室溫下于2ml PBS緩沖液中與3μmol的FITC標(biāo)記DNA在偶聯(lián)劑EDC存在下反應(yīng)24小時(shí)，過(guò)濾取出微球，用PBS緩沖液洗滌至殘液中沒(méi)有熒光，干燥后用光譜儀測(cè)單個(gè)微球表面的熒光，結(jié)果見圖8。

權(quán)利要求
1.一種提高量子點(diǎn)編碼微球的編碼穩(wěn)定性的方法，其步驟為(1)對(duì)待編碼的微球表面進(jìn)行功能化修飾和多孔化處理；(2)將處理后的微球放入量子點(diǎn)溶液中，吸附到編碼溶液中的熒光強(qiáng)度不再變化后，取出微球進(jìn)行充分洗滌；(3)將上述量子點(diǎn)編碼微球加入到環(huán)己烷、氨水、硅酸酯的混合溶液，其中硅酸酯的體積百分比為1～10％，氨水的體積百分比為0.04-4％，通過(guò)硅酸酯水解反應(yīng)形成硅顆粒沉積在編碼微球表面，形成一層外殼；(4)將上述被包埋的量子點(diǎn)編碼微球與生物探針連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)采用采用氯磺酸的二氯甲烷溶液對(duì)待編碼的微球表面進(jìn)行多孔化處理，其中，氯磺酸的體積百分比為0.3-1％。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)和分析技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種提高量子點(diǎn)編碼微球的編碼穩(wěn)定性的方法。其步驟為對(duì)待編碼的微球表面進(jìn)行功能化修飾和多孔化處理；將處理后的微球放入量子點(diǎn)溶液中，吸附均勻后取出微球洗滌；再將量子點(diǎn)編碼微球加入到環(huán)己烷、氨水(0.04－4％vol)和硅酸酯(1～10％vol)的混合液，通過(guò)水解反應(yīng)形成硅顆粒沉積在微球表面，形成外殼；最后將被包埋的微球與生物探針連接。本發(fā)明通過(guò)微顆粒表面處理，使其表面既有功能化接枝的“手臂”分子，又產(chǎn)生多孔性；并通過(guò)包被處理保護(hù)摻入的量子點(diǎn)不被氧化和保護(hù)微球不受化學(xué)或生物試劑的破壞。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易行，能利用預(yù)提取的編碼特征對(duì)微球進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別，有助于高通量藥物篩選系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)B82B3/00GK1775654SQ20051001962
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2005年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者曹元成, 黃振立, 趙元弟, 王海橋 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)