本發(fā)明涉及檢測受試者血清中抗ACTL7a和GAPDH-2抗體的方法和試劑盒。具體地，本發(fā)明涉及用ELISA方法檢測血清中的抗ACTL7a和GAPDH-2抗體的水平以及試劑盒。另一方面，本發(fā)明涉及抗ACTL7a和GAPDH-2抗體的檢測在診斷免疫性不孕癥中的用途。
背景技術(shù)：
：精子表面存在一些獨特的、細胞特異的蛋白質(zhì)，其可產(chǎn)生免疫原性。一些分子刺激機體的免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體后可能會導(dǎo)致阻斷精子穿透卵膜和受精，并可能導(dǎo)致免疫性不孕?？咕拥鞍卓贵w既在男性，也在女性體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并且在不孕夫婦中的發(fā)現(xiàn)率很高，高達9-12.8％。目前檢測抗精子蛋白抗體的方法很多，臨床上用于檢測抗精子蛋白抗體的定性檢測即精子凝集試驗可以鑒定出血清中是否含有抗精子抗體，從而判斷不孕者血清中是否含有抗精子抗體，進而幫助醫(yī)生判斷不孕的原因，一般臨床上精子凝集實驗的血清稀釋度在1：8以上依然發(fā)生凝集時需要引起重視，采用必要的治療手段。但此方法需要志愿者提供新鮮的活力正常的精子，很多醫(yī)院不愿意采用此方法。對免疫性不孕的檢測各家醫(yī)院采取的方法不同，沒有相對統(tǒng)一的檢測指標，檢測的結(jié)果對于醫(yī)生沒有很好的參考價值。有專家指出現(xiàn)有的檢測手段多是以精子總蛋白或膜蛋白為靶目標進行檢測，而總蛋白或是膜蛋白中有很多體細胞蛋白，沒有很好的特異性。因此，需要選擇特異性高的精子特異表達的蛋白進行靶目標進行檢測。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了兩種精子特異表達的蛋白質(zhì)ACTL7a和GAPDH-2，在發(fā)明人先前的研究中已證明其是精子特異表達的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)容易產(chǎn)生抗精子抗體，適于作為免疫性不孕的靶目標進行檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明人通過原核表達純化獲得了用于抗原包被的ACTL7a和GAPDH-2蛋白。并通過ELISA方法實現(xiàn)了高靈敏度、高特異性的抗ACTL7a和GAPDH-2抗體的檢測。一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測受試者血清中抗ACTL7a抗體水平的ELISA方法，所述方法包括以下步驟：a)從受試者獲得待測血清樣本；b)用純化的ACTL7a抗原包被平板；c)將以1:1000稀釋的步驟a)獲得的血清樣本加入步驟b)的平板中，過夜孵育；d)向步驟c)的每孔中加入辣根過氧化物酶標記的抗體，孵育；e)測定步驟b)的抗體濃度。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中進一步包括制備標準擬合曲線的步驟。另一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測受試者血清中抗GAPDH-2抗體水平的ELISA方法，所述方法包括以下步驟：a)從受試者獲得待測血清樣本；b)用純化的GAPDH-2抗原包被平板；c)將以1:1000稀釋的步驟a)獲得的血清樣本加入步驟b)的平板中，過夜孵育；d)向步驟c)的每孔中加入辣根過氧化物酶標記的抗體，孵育；e)測定步驟b)的抗體濃度。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，其中進一步包括制備標準擬合曲線的步驟。另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測抗ACTL7a抗體水平的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括純化的ACTL7a抗原包被的平板。另一方面，本發(fā)明涉及用于檢測抗GAPDH-2抗體水平的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括純化的GAPDH-2抗原包被的平板。另一方面，本發(fā)明涉及一種精子特異性抗原在制備用于診斷免疫性不孕癥的試劑盒中的用途，所述精子特異性抗原選自ACTL7a和GAPDH-2。另一方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷免疫性不孕癥的試劑盒，所述試劑盒包含純化的ACTL7a抗原包被的平板和/或純化的GAPDH-2抗原包被的平板。附圖說明圖1顯示ACTL7a的標準擬合曲線。圖2顯示GAPDH-2的標準擬合曲線。具體實施方式ELISA方法大致為抗原包被、一抗反應(yīng)(血清中的抗體或標準曲線中的抗體)、酶標二抗反應(yīng)、底物顯色等幾個主要步驟。具體步驟如下：1)抗原包被：用0.1M碳酸包被緩沖液將純化的精子抗原ACTL7a或者GAPDH-2稀釋至200ng/100μl(兩種抗原分別包被)。所述精子抗原由細菌原核誘導(dǎo)表達的方法純化；其中，ACTL7a的純化方式同文獻：人精子肌動蛋白樣蛋白7a蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)的表達純化及多克隆抗體制備，細胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29(5)，507-510)；GAPDH-2的純化方式同文獻：主動免疫肌動蛋白樣蛋白7a蛋白引起小鼠睪丸曲細精管的損傷，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2013，35(6)，595-600)中ACTL7a-his融合蛋白的誘導(dǎo)表達及純化。在酶標板中每孔加入100μl，4℃過夜，或37℃4h，將平板中液體傾盡，用PBS-T(磷酸緩沖液，新鮮加入0.05％Tween-20)洗滌三次；2)封閉：每孔加入1％BSA200μl(PBS-T配)，室溫30分鐘。用PBS-T洗滌三次；3)一抗反應(yīng)：將待檢血清用生理鹽水(或PBS)以1：1000比例稀釋；同時分別加入0，0.125，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，單位為*10-4g/L濃度的兔抗ACTL7a或者GAPDH-2抗體(加入的標準曲線的抗體與包被的抗原對應(yīng))；100μl/孔，4℃過夜，PBS-T洗三次；4)二抗反應(yīng)：每孔中加入100μl用PBS-T以1:500稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗體(IgG-HRP，抗體購自Thermoscientific，貨號21230)，37℃保溫2h。PBS-T洗滌三次；5)顯色反應(yīng)與測定光密度：每孔中加入底物鄰苯二胺100μl，室溫孵育3-10min。加入50μl2MHCl終止反應(yīng)。用酶標儀測波長490nm處光密度值并按照標準曲線計算血清樣品中的抗體濃度。溶液組成：1、包被用抗原：ACTL7a和GAPDH-2濃度一般在1-10mg/ml濃度，每個批次濃度不同，依照濃度使用；2、PBS-T(pH7.4)：NaCl8.0g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，Tween-200.5ml，加去離子水至1000ml；3、0.1M碳酸包被緩沖液(pH9.6)：儲備A液0.2M:21.2gNa2CO3加去離子水到1000ml，儲備B液0.2M:16.8gNaHCO3加去離子水到1000ml，將80ml(A)+170ml(B)+250ml去離子水混合，即為所需溶液。4、底物用磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)：A液：檸檬酸(無水)1.92g加去離子水到100ml，B液：Na2HPO4·12H2O7.16g加去離子水到100ml，取2.43ml(A)+2.57ml(B)+5ml去離子水混合即為所需溶液，新鮮配制：30％H2O215μl+鄰苯二胺4mg+9.985ml磷酸-檸檬酸緩沖液。5、封閉液：用PBS-T配制的1％BSA。實施例1、ACTL7a的標準曲線的擬合如表1所示，在EXCEL第一行依次輸入標準曲線測得的OD值，第二行對應(yīng)輸入標準曲線的濃度，如0，0.125，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2。表1：OD值00.10980.28640.60330.79591.18411.65302.2497濃度00.1250.250.50.7511.52以散點圖作圖擬合曲線，得到y(tǒng)＝ax+b的公式及R2值。一般R2接近于1，一般為0.97-0.99，最低不應(yīng)低于0.95。擬合結(jié)果見圖1，其中y＝0.8881*x+0.0017，R2＝0.9978。R2＝0.9978說明曲線擬合成功，通過擬合公式可以計算待測血清中抗精子抗體的濃度。擬合公式結(jié)果是a＝0.8881，b＝0.0017。將血清測得的OD值，如1.9372代入公式，得到的結(jié)果是1.7221。標準曲線的單位是10-4g/L，因此檢測血清的濃度為1.7221*10-4g/L。血清稀釋比例為1：1000，最后得到的結(jié)果是血清中含有抗ACTL7a抗體濃度為1.7221*10-1g/L。實施例2、GAPDH-2的標準曲線的擬合在EXCEL第一行依次輸入標準曲線測得的OD值，第二行對應(yīng)輸入標準曲線的濃度，如0，0.125，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2。如表2所示，在EXCEL第一行依次輸入標準曲線測得的OD值，第二行對應(yīng)輸入標準曲線的濃度，如0，0.125，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2。表2：OD值00.09720.24300.57790.79110.95151.52032.0462濃度00.1250.250.50.7511.52以散點圖作圖擬合曲線，見圖2，其中y＝ax+b的公式及R2值，一般R2接近于1，一般為0.97-0.99，最低不應(yīng)低于0.95。擬合結(jié)果是y＝0.9797*x+0.003，R2＝0.9969。R2＝0.9969說明曲線擬合成功，通過擬合公式可以計算待測血清中抗精子抗體的濃度。擬合公式結(jié)果是a＝0.9797，b＝0.003，將血清測得的OD值，如1.3924代入公式，得到的結(jié)果是1.3672，標準曲線的單位是10-4g/L，因此檢測血清的濃度為1.3672*10-4g/L。血清稀釋比例為1：1000，最后得到的結(jié)果是血清中含有抗GAPDH-2抗體濃度為1.3672*10-1g/L。實施例3、免疫性不孕血清檢測按照前面所敘述的方法，將收集的每例血清進行檢測和計算。共收集可孕對照血清237份；免疫性不孕血清是經(jīng)精子凝集實驗檢測陽性的血清，其中稀釋比例小于等于1：8，圖中標記為不孕(≤1:8)的共58份；稀釋比例大于1：8的，圖中標記為不孕(＞1:8)的共117份。3.1、血清中抗ACTL7a抗體的檢測三組檢測結(jié)果得到的平均值(Mean)和標準誤(SEM)分別如表3所示：表3：組名數(shù)量(n)平均值(*10-1g/L)SEM(*10-1g/L)可孕對照2370.22000.007242不孕(≤1:8)580.43180.02707不孕(＞1:8)1171.5070.1304分別對三組間進行統(tǒng)計檢驗，發(fā)現(xiàn)可孕對照組分別與不孕(≤1:8)組和不孕(＞1:8)組之間，以及不孕(≤1:8)組與不孕(＞1:8)組之間的統(tǒng)計結(jié)果均為P<0.0001，一般標記為三個星號“***”，即有顯著差異。統(tǒng)計結(jié)果說明ACTL7a可以很好的作為抗精子抗體檢測的靶目標，并且隨著抗精子抗體滴度的增加，抗ACTL7a的抗體濃度也明顯增加。3.2、血清中抗GAPDH-2抗體的檢測三組檢測結(jié)果得到的平均值(Mean)和標準誤(SEM)分別如表4所示：表4：組名數(shù)量(n)平均值(*10-1g/L)SEM(*10-1g/L)可孕對照2370.21470.005737不孕(≤1:8)580.40570.01460不孕(＞1:8)1171.2560.1031分別對三組間進行統(tǒng)計檢驗，發(fā)現(xiàn)可孕對照組分別與不孕(≤1:8)組和不孕(＞1:8)組之間，以及不孕(≤1:8)組與不孕(＞1:8)組之間的統(tǒng)計結(jié)果均為P<0.0001，一般標記為三個星號“***”，即有顯著差異。統(tǒng)計結(jié)果說明GAPDH-2可以很好的作為抗精子抗體檢測的靶目標，并且隨著抗精子抗體滴度的增加，抗GAPDH-2的抗體濃度也明顯增加。3.3、根據(jù)ELISA法檢測的抗ACTL7a抗體水平和抗GAPDH-2抗體水平確定不孕原因受試者工作特征曲線即ROC曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve)評價用于判斷檢測方法的敏感性和特異性。將可孕組與不孕組[不孕(≤8)組和不孕(＞8)組合并]進行ROC分析，找到敏感性和特異性最佳的點對應(yīng)的抗體濃度值，大于此值的設(shè)定為陽性即“+”；將兩組不孕組不孕(≤8)組和不孕(＞8)組進行ROC分析，找到敏感性和特異性最佳的點對應(yīng)的抗體濃度值，大于此值的設(shè)定為強陽性“++”。通過分析得到的ACTL7a和GAPDH-2抗體濃度臨界值即“+”和“++”列表如下表5：表5：分別對三組陽性結(jié)果進行統(tǒng)計，ACTL7a抗體在各組中陽性及強陽性病例的個數(shù)和比例如下表6：表6：GAPDH-2抗體在各組中陽性和強陽性病例的個數(shù)和比例如下表7：表7：三組樣本ACTL7a抗體和GAPDH-2抗體單陽性(+/-或-/+)和雙陽性(+/+)以及單強陽性(++/+或+/++)和雙強陽性(++/++)病例的個數(shù)和比例如下表8：表8：由以上結(jié)果可見GAPDH-2抗體的敏感性相對高，在不孕人群中相對多的被檢測出陽性病例；ACTL7a抗體檢測的特異性相對強，ACTL7a抗體的陽性病例基本被包含于雙陽性病例中。隨著抗精子抗體濃度增加，ACTL7a抗體和GAPDH-2抗體雙陽性的病例比例也明顯增加[由可育組的6.33％，不孕(≤8)組的58.62％增加至不孕(＞8)組的80.34％]。特別注意的是，ACTL7a抗體和GAPDH-2抗體雙強陽性的病例僅存在于不孕(＞8)組即抗精子抗體滴度較高組中。提示，結(jié)合兩種抗精子抗體檢測結(jié)果更有利于臨床對不孕者病因的判斷并選擇合適的治療手段。以上結(jié)果表明，本文中所述的ELISA方法可特異地且敏感地檢測受試者血清中的抗ACTL7a抗體水平和抗GAPDH-2抗體水平，結(jié)合所檢測的抗體水平，可以靈敏且特異地判斷受試者的不孕原因。當前第1頁1 2 3