一種快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法，主要步驟包括采樣、固定、染色、壓片及顯微觀察，該方法結(jié)合氣溫，根據(jù)花藥顏色及花蕾直徑的多重采樣標準選取合適的花蕾，再進行染色壓片，然后在顯微鏡下進行觀察、確定牡丹花粉母細胞的減數(shù)分裂各時期。利用本發(fā)明的方法，取材固定后當天就可以觀察檢測花粉細胞的減數(shù)分裂情況，這不僅能節(jié)省時間、節(jié)約成本、提高實驗效率，也能避免錯過減數(shù)分裂期。
【專利說明】一種快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)中植物表型及細胞學研宄方法領(lǐng)域，具體涉及一種快速確定 牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 對于有性生殖的真核生物來說，減數(shù)分裂是一個非常重要的過程，它從二倍體細 胞中產(chǎn)生單倍體配子，在這個過程中DNA復制一次緊接著發(fā)生兩次連續(xù)的核分裂，染色體 數(shù)目減半。減數(shù)分裂既供應一半親本染色體又改組存在于親本中的遺傳變異。因此減數(shù)分 裂對維持個體的正常發(fā)育、保持物種的連續(xù)性和穩(wěn)定性、揭示物種的起源以及物種的進化 具有重要的主導作用。
[0003] 已有研宄報道過如何通過花蕾大小等方法確定少量植物減數(shù)分裂時期，如席夢利 等（麝香百合小孢子母細胞減數(shù)分裂進程與花蕾大小相關(guān)性研宄，南京林業(yè)大學學報， 2008)通過觀察麝香百合花蕾大小確定其減數(shù)分裂時期，劉天倫（水稻花粉母細胞減數(shù)分 裂的時期，中國農(nóng)科科學，1981)根據(jù)水稻穎花的長度確定水稻花粉母細胞減數(shù)分裂期，高 鵬等（杜仲大小孢子母細胞減數(shù)分裂進程對應關(guān)系的研宄，北京林業(yè)大學學報，2006)根 據(jù)杜仲花芽的長度及花藥的變化判斷減數(shù)分裂期，黃遠新等（黑麥減數(shù)分裂時期的定位觀 察，生物學通報，2008)根據(jù)花藥的長度來判斷黑麥減數(shù)分裂時期，還有李靜等（山楊小孢 子發(fā)生與雄配子體發(fā)育進程即時觀察，林業(yè)科技，2014)根據(jù)水培時間確定山楊減數(shù)分裂 期，其中提到減數(shù)分裂與花藥的顏色變化相關(guān)。但這些方法中考察標準單一，而植物細胞的 減數(shù)分裂時期一般時間很短，容易錯過最佳的觀察時期。
[0004] 雖然已有少量研宄芍藥屬植物花粉母細胞發(fā)育過程的報道，但還沒有對于確定其 花粉母細胞減數(shù)分裂時期方法的報道。如韓莉等（牡丹小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育的研 宄，山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2000,31 (1): 27?31)在研宄牡丹小孢子發(fā)生與雄 配子體發(fā)育時曾提到在山東泰安采樣時間為3月中旬到4月中旬，其采樣時間長達一個月； 由于年際間的氣溫變化很大，即便在同一地區(qū)每年牡丹花粉母細胞真正的減數(shù)分裂時期也 是不一樣的，因而，依據(jù)這種模糊的時間區(qū)段的描述性報道是無法準確確定花粉母細胞減 數(shù)分裂時間的。此外，按照前述報道上長達一個月的采樣，需要消耗大量的實驗材料，投入 大量的人員和時間成本，顯然既費工又費時。
[0005] 在其他少量相關(guān)研宄中，研宄者們也大多采用一個"經(jīng)驗時間"，從其研宄結(jié)果也 可以看出，因為采樣時間不確定，未能全面觀察到減數(shù)分裂的過程。
[0006] 另外，魏樂等研宄者主要通過石蠟切片技術(shù)觀察減數(shù)分裂過程，但石蠟切片所需 時間較長（約1周），不利于快速檢測花粉母細胞的分裂狀況，取材存在局限性。因此，關(guān)于 如何準確快速確定牡丹減數(shù)分裂確切時間點的方法至今未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法，利用該 方法取材固定后當天就可以快速、準確鑒定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂的各個時期，不僅能 夠節(jié)省實驗時間、節(jié)約實驗材料、減少實驗成本，也能夠避免錯過減數(shù)分裂期，進而極大提 高了實驗效率和實驗質(zhì)量。
[0008] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0009] 一種快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法，包括，
[0010] 1)米樣：在日平均氣溫為6. 5?15. 5°C時，選取花藥顏色嫩黃，直徑為12?16mm 的花蕾；
[0011] 2)固定：將步驟1)得到的花蕾去掉萼片花瓣，浸沒在卡諾固定液中，做上標記；固 定1?24小時后，用酒精清洗，并轉(zhuǎn)移到酒精中于-40?-20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0012] 3)染色：取出步驟2)保存?zhèn)溆玫幕ɡ伲喝⌒廴?；用吸水紙吸去上面的酒精；?載玻片上滴一滴醋酸，將雄蕊置于載玻片上的醋酸中軟化1?10秒，用解剖針切取一段 1?6mm長的花藥，滴加15?35yL卡寶品紅對花藥上的染色體染色，用鑷子夾碎樣品，去 掉殘渣，得到樣品；
[0013] 4)觀察：將樣品先在顯微鏡10?30倍鏡下找到視野，再在顯微鏡40?100倍鏡 下觀察處于分裂期的染色體。
[0014] 優(yōu)選地，步驟2)中固定時間為1?3小時。
[0015] 優(yōu)選地，步驟3)中將雄蕊置于醋酸中軟化3?8秒。
[0016] 又優(yōu)選地，步驟3)中將雄蕊置于醋酸中軟化后，用解剖針切取2_長的花藥。
[0017] 進一步，所述的方法中，在顯微鏡下進行觀察之前，還包括壓片步驟，具體為，在樣 品上蓋上蓋玻片，用力壓片，將染色體壓開，以便在觀察時得到更加清晰的圖像。
[0018] 通過實驗發(fā)現(xiàn)，花蕾直徑大小在12?16mm之間減數(shù)分裂較旺盛，在此范圍內(nèi)可找 到減數(shù)分裂過程中各個時期的細胞；溫度在6.5?15. 5°C時采樣較佳，花蕾直徑相對較大 但日平均溫度相對較低的情況下也可見減數(shù)分裂時期細胞；當花蕾中大多數(shù)花粉母細胞處 于減數(shù)分裂期時，花藥顏色大都為嫩黃，此時采樣最適宜；而當花藥顏色為嫩黃偏乳白時， 大多數(shù)花粉母細胞還沒有進入減數(shù)分裂期，此時采樣則偏早；而當花藥顏色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色時， 則已絕大多數(shù)花粉母細胞已經(jīng)過了減數(shù)分裂時期，此時采樣則太晚。
[0019] 因此，采集樣品時，花蕾直徑大小在12?16mm之間，平均溫度為6. 5?15. 5°C，花 藥顏色為嫩黃，在三個條件均滿足的情況下采集的樣品減數(shù)分裂較旺盛，且有較多處于后 期的染色體。
[0020] 有益效果：
[0021] 本發(fā)明的方法中，在采樣時結(jié)合氣溫，花藥顏色及花蕾直徑的多重標準選取合適 的花蕾，再進行染色壓片，進而去檢測牡丹的花粉母細胞的減數(shù)分裂時期，通過該方法能夠 快速捕獲牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂期細胞，避免了現(xiàn)有技術(shù)中采樣時，由于偶然性與不確 定性因素的存在，而錯過得到處于減數(shù)分裂時期的牡丹花粉母細胞的最佳時期。
[0022] 采用本發(fā)明的方法，能夠采到牡丹減數(shù)分裂時期的細胞樣品，并且能夠觀察到各 個時期，為科研工作節(jié)省了時間和人力、節(jié)約了成本、提高了工作效率，并且為更加全面深 入地揭示減數(shù)分裂這一生命現(xiàn)象提供了實驗材料這一前提保證。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明實施例中采取的花蕾之一。
[0024] 圖2為本發(fā)明實施例中去掉萼片及花瓣的花蕾。
[0025]圖3為本發(fā)明實施例中減數(shù)第一次分裂前期的花粉母細胞。
[0026]圖4為本發(fā)明實施例中減數(shù)第一次分裂中期的花粉母細胞。
[0027]圖5為本發(fā)明實施例中減數(shù)第一次分裂后期的花粉母細胞。
[0028]圖6為本發(fā)明實施例中減數(shù)第一次分裂末期的花粉母細胞。
[0029]圖7為本發(fā)明實施例中減數(shù)第二次分裂前期的花粉母細胞。
[0030] 圖8為本發(fā)明實施例中減數(shù)第二次分裂中期的花粉母細胞。
[0031]圖9為本發(fā)明實施例中減數(shù)第二次分裂后期的花粉母細胞。
[0032]圖10為本發(fā)明實施例中減數(shù)第二次分裂末期的花粉母細胞。
[0033] 圖11為本發(fā)明實施例中的成熟花粉粒。

【具體實施方式】
[0034] 以下結(jié)合具體實施例和附圖進一步詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案，需要特別指出的 是，這些描述僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制，各種對本發(fā)明做出的顯而 易見的修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0035] 實施例確定鳳丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期
[0036] 1?材料和方法：
[0037] 器材：鑷子，手術(shù)刀，游標卡尺，冰盒，帶蓋塑料瓶，解剖針，載玻片，蓋玻片，培養(yǎng) 皿，濾紙，吸水紙，普通光學顯微鏡。
[0038] 試劑：卡諾固定液，卡寶品紅，45%醋酸（體積比），70%酒精（體積比）。
[0039] 樣品：鳳丹，取其花蕾作為樣品。
[0040] 采集樣品地點：上海辰山植物園。
[0041] 本次采集56個花蕾樣品，采樣花蕾直徑跨度為11. 50mm?18. 75mm(詳見表1及 圖1)，共計727張照片。
[0042]1.1采集及固定：
[0043] 1)準備工作：在塑料瓶中裝入卡諾固定液（乙醇：乙酸=3:1)，并置于冰盒中；
[0044] 2)采樣：用游標卡尺量取鳳丹花蕾的直徑，直徑范圍在11. 50mm?18. 75mm;
[0045] 3)固定：用鑷子將花蕾摘下，去掉萼片花瓣，浸沒在卡諾固定液中，做上標記；固 定1?3小時之后，用70%酒精清洗，并轉(zhuǎn)移到70%的酒精中于-20°C冰箱保存?zhèn)溆?，固?清洗之后即可檢測，采集頻率可為半天，一天或兩天采一次。
[0046] 1. 2染色體制片及檢測
[0047] 1)取出花蕾，撕取一根雄蕊，吸水紙吸去上面的酒精；
[0048] 2)在載玻片上滴一滴（約40yL)45%的醋酸，將雄蕊置于醋酸中軟化5s，用解剖 針切取一段2mm長的花藥，剩下的放入保存液（70%酒精）中；
[0049] 3)滴加20yL卡寶品紅，用鑷子夾碎樣品，去掉殘渣，得到樣品；
[0050] 4)將樣品蓋上蓋玻片，用大拇指用力壓片，將染色體壓開，在顯微鏡10?30倍鏡 下找到視野，然后換40?100倍鏡觀察并拍照記錄。
[0051] 2結(jié)果
[0052]通過實驗發(fā)現(xiàn)，牡丹花粉母細胞處于減數(shù)分裂期的花蕾直徑大小在12?16mm之 間（參見表1)，平均溫度為6. 5?15. 5°C，花藥顏色為嫩黃（見圖2)，該條件下采集的樣品 減數(shù)分裂較旺盛，可從10?90%的花粉母細胞中檢測到減數(shù)分裂，且有較多處于后期的染 色體。
[0053]減數(shù)分裂主要過程以及花粉粒形成過程如圖3?11所示，圖3為減數(shù)第一次分裂 前期的花粉母細胞，圖4為減數(shù)第一次分裂中期的花粉母細胞，圖5為減數(shù)第一次分裂后期 的花粉母細胞，圖6為減數(shù)第一次分裂末期的花粉母細胞，圖7為本減數(shù)第二次分裂前期的 花粉母細胞，圖8為減數(shù)第二次分裂中期的花粉母細胞，圖9為減數(shù)第二次分裂后期的花粉 母細胞，圖10為減數(shù)第二次分裂末期的花粉母細胞，圖11為成熟花粉粒。
[0054] 同時，在染色體制片過程中發(fā)現(xiàn)花蕾發(fā)育出現(xiàn)不同步現(xiàn)象，同一花蕾中，中間雄蕊 發(fā)育較快，邊緣較慢，且在同一雄蕊中發(fā)育也不同步，在形態(tài)學上端發(fā)育較下端快，所以在 取材時可根據(jù)發(fā)育不同步現(xiàn)象選擇樣品。
[0055] 表1花蕾直徑、平均溫度和花藥顏色所對應的分裂時期細胞數(shù)百分比

【權(quán)利要求】
1. 一種快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法，包括如下步驟， 1) 米樣：在日平均氣溫為6. 5?15. 5°C時，選取花藥顏色嫩黃，直徑為12?16mm的花 蕾； 2) 固定：將步驟1)得到的花蕾去掉萼片花瓣，浸沒在卡諾固定液中，做上標記；固定 1?24小時后，用酒精清洗，并轉(zhuǎn)移到酒精中于-40?-20°C保存?zhèn)溆茫? 3) 染色：取出步驟2)保存?zhèn)溆玫幕ɡ?，撕取雄蕊；吸去上面的酒精；在載玻片上滴一 滴醋酸，將雄蕊置于載玻片上的醋酸中軟化1?10秒，用解剖針切取一段1?6mm長的花 藥，滴加15?35 y L卡寶品紅，對花藥上的染色體染色，用鑷子夾碎樣品，去掉殘渣，得到樣 品； 4) 觀察：將樣品先在顯微鏡10?30倍鏡下找到視野，再在顯微鏡40?100倍鏡下觀 察處于分裂期的染色體。
2. 如權(quán)利要求1所述的快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法，其特征在于， 步驟2)中固定時間為1?3小時。
3. 如權(quán)利要求1所述的快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法，其特征在于， 步驟3)中將雄蕊置于醋酸中軟化3?8秒。
4. 如權(quán)利要求1或3所述的快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法，其特征在 于，步驟3)中將雄蕊置于醋酸中軟化后，用解剖針切取2mm長的花藥。
5. 如權(quán)利要求1所述的快速確定牡丹花粉母細胞減數(shù)分裂時期的方法，其特征在于， 步驟4)在顯微鏡下進行觀察之前，還包括壓片步驟，具體為，在樣品上蓋上蓋玻片，用力壓 片，將染色體充分壓開。
【文檔編號】G01N15/10GK104458538SQ201410649179
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】袁軍輝, 胡永紅, 張林娟, 劉洪峰, 杜少博, 宣亞楠, 王云鵬, 杜玉玲, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:上海辰山植物園