制備視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供[1]制備視網(wǎng)膜組織的方法，所述方法包括以下步驟(1)至(3)：(1)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的聚集體，(2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將在第一步中形成的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，和(3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將在第二步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)；[2]制備視杯樣結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括以下步驟：在各自含有作用于Sonic?hedgehog信號途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，對在以上步驟(3)中培養(yǎng)的含有視網(wǎng)膜組織的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)；[3]制備視網(wǎng)膜色素上皮的方法，所述方法包括以下步驟：在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中(其中所述無血清培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)基不含作用于Sonic?hedgehog信號途徑的物質(zhì))，將在以上步驟(3)中培養(yǎng)的含有視網(wǎng)膜組織的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)；以及[4]制備視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括使包含在來源于靈長類多能干細(xì)胞的視網(wǎng)膜組織中的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞接觸抑制Notch信號途徑的物質(zhì)。
【專利說明】制備視網(wǎng)膜組織和視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備視網(wǎng)膜組織以及視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞如視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮等的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織如腦和視網(wǎng)膜具有低的再生能力并且損傷的組織幾乎不會自然地恢復(fù)。因此，預(yù)期移植治療用的分化自多能干細(xì)胞的細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)是戰(zhàn)勝難治性疾病的最后一張牌。此外，通過自多能干細(xì)胞的分化獲得的人源細(xì)胞被認(rèn)為能夠精確地評估化學(xué)物質(zhì)對人的作用，并且朝向應(yīng)用于化合物的毒性評估和藥物發(fā)現(xiàn)的研究和開發(fā)正在進(jìn)行中。 [0003]視網(wǎng)膜是重要的感覺組織，其接收光，將其轉(zhuǎn)化為電信號并且，在信息處理后，經(jīng)由軸突將所述信息傳遞至大腦的視覺中樞。視網(wǎng)膜主要由在彼此之上疊加的兩種內(nèi)部和外部上皮組織構(gòu)成。內(nèi)部是神經(jīng)視網(wǎng)膜，其接收光并處理信息，并且包含超過一種類型的細(xì)胞如光感受器。外部是視網(wǎng)膜色素上皮，其是支持光感受器的存活和功能的單層細(xì)胞片。
[0004]已有已知的從多能干細(xì)胞制備構(gòu)成神經(jīng)視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞(光感受器，水平細(xì)胞，無長突細(xì)胞，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等)的報道(專利文獻(xiàn)I)。此外，作為由多能干細(xì)胞制備三維視網(wǎng)膜組織的方法，描述的是，視網(wǎng)膜先祖組織、視杯樣結(jié)構(gòu)和多層神經(jīng)視網(wǎng)膜組織可以在體外通過以下方式制備:在無血清培養(yǎng)基中形成均質(zhì)的多能干細(xì)胞聚集體并且在基膜制備物存在下將其進(jìn)行漂浮培養(yǎng)(非專利文獻(xiàn)I和專利文獻(xiàn)2)。
[0005]另一方面，關(guān)于通過使用多能干細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮的報道也是已知的(非專利文獻(xiàn)2)。然而，沒有關(guān)于高效地制備視網(wǎng)膜色素上皮的報道。
[0006][文獻(xiàn)列表]
[0007][專利文獻(xiàn)]
[0008]專利文獻(xiàn)1:W02008/087917
[0009]專利文獻(xiàn)2:W02011/055855
[0010][非專利文獻(xiàn)]
[0011]非專利文獻(xiàn)1:Mototsugu Eiraku, Nozomu Takata, Hiroki Ishibashi, MasakoKawadaj Eriko SakakurajSatoru Okudaj Kiyotoshi Sekiguchij Taiji Adachi & YoshikiSasai (2011)Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensionalculture (三維培養(yǎng)中的自組織視杯形態(tài)發(fā)生).Nature，卷:472，頁碼:51-56
[0012]非專利文獻(xiàn)2:Maria Idelson，Ruslana Alper，Alexey Obolensky，EttiBen-Shushanj Itzhak Hemo，Nurit Yachimovich-CohenjHanita Khanerj Yoav Smith, OferWiser, Michal Gropp，Malkiel A.Cohen, Sharona Even-Ramj Yael Berman-Zakenj LimorMatzrafi，Gideon Rechavij Eyal Banin 和 Benjamin Reubinoff(2009)DirectedDifferentiation of HumanEmbryonic Stem Cells into Functional Retinal PigmentEpithelium Cells(人胚胎干細(xì)胞直接分化為功能性視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞).Cell StemCell5, 396-408
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明要解決的問題
[0015]需要高效地制備視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)和視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞以及視網(wǎng)膜色素上皮的的方法。
[0016]解決問題的手段
[0017]在此種情況下本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量研究并且獲得了本發(fā)明。
[0018]因此,本發(fā)明如下。
[0019][1]制備視網(wǎng)膜組織的方法，包括以下步驟(1)至(3):
[0020](1)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的聚集體，
[0021](2)第二步,在含有基膜制備物(basement membrane preparation)的無血清培養(yǎng)基中將第一步中形成的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，和
[0022](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將第二步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0023][2]制備視杯樣結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于Sonichedgehog (下文中，有時也稱作“Shh” )信號途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，將通過前述[I]的方法獲得的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0024][3]制備視網(wǎng)膜色素上皮的方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中(其中前述無血清培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)基不含作用于Sonic hedgehog(下文中，有時也稱作“Shh”)信號途徑的物質(zhì))，將通過前述[I]的方法獲得的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0025][4]前述[3]的方法，其中前述含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基還包含作用于激活蛋白(Activin)信號途徑的物質(zhì)。
[0026][5]前述[I]至[4]中任一項的方法，其中前述多能干細(xì)胞是靈長類多能干細(xì)胞。
[0027][6]前述[I]至[4]中任一項的方法，其中前述多能干細(xì)胞是人多能干細(xì)胞。
[0028][7]前述[I]至[6]中任一項的方法，其中前述基膜制備物是至少一種選自由以下組成的組的細(xì)胞外基質(zhì)分子:層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。
[0029][8]前述[I]至[7]中任一項的方法，其中前述第一步至第三步在敲除血清置換物(Knockout serum replacement)(下文中，有時也稱作“KSR”)存在下進(jìn)行。
[0030][9]制備視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括使包含在來源于靈長類多能干細(xì)胞的視網(wǎng)膜組織中的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞接觸抑制Notch信號途徑的物質(zhì)。
[0031][10]前述[9]的方法，其中前述抑制Notch信號途徑的物質(zhì)是Y分泌酶活性抑制物質(zhì)。
[0032][11]前述[9]或[10]的方法，其中前述抑制Notch信號途徑的物質(zhì)是N-[N-(3, 5- 二氟苯乙?；?-L-丙氨?；鵠-S-苯基甘氨酸叔丁酯(下文中，有時也稱作“DAPT”)。
[0033][12]前述[9]至[11]中任一項的方法，其中前述靈長類是人。[0034][13]前述[9]至[12]中任一項的方法，其中所述視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞是光感受器。
[0035][14]前述[9]至[12]中任一項的方法，其中所述視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
[0036][15]前述[9]至[14]中任一項的方法，其中所述包含在來源于靈長類多能干細(xì)胞的視網(wǎng)膜組織中的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞是包含在通過以下步驟制備的視網(wǎng)膜組織中的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞:
[0037](I)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中將靈長類多能干細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成靈長類多能干細(xì)胞的聚集體，
[0038](2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將第一步中形成的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，
[0039](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將第二步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，
[0040](4)第四步,在各自含有作用于Sonic hedgehog(下文中，有時也稱作“Shh”)信號途徑的物質(zhì)和作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中將第三步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，以形成視杯樣結(jié)構(gòu)，和
[0041](5)將第四步中形成的視杯樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行漂浮培養(yǎng)的步驟。 [0042][16]用于評估毒性或藥物效力的試劑，所述試劑包含通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞。
[0043][17]用于評估測試物質(zhì)的毒性或藥物效力的方法，所述方法包括使通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞接觸所述測試物質(zhì)，并且檢查所述物質(zhì)對所述組織、結(jié)構(gòu)或細(xì)胞的影響。
[0044][18]用于由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病的治療劑，所述治療劑包含通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞。
[0045][19]用于治療由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病的方法，所述方法包括移植有效量的通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞至需要所述移植的靶標(biāo)。
[0046][20]通過前述[I]至[15]中任一項的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞，其用于治療由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病。
[0047]發(fā)明效果
[0048]根據(jù)本發(fā)明，可以高效地制備視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮。因此，考慮到有效提供視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮以用于化學(xué)物質(zhì)等的毒性或藥物效力評估、移植治療等，本發(fā)明是高度有用的。
[0049]附圖簡述
[0050]圖1是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第25天，通過僅添加Matrigel (下文中，有時也稱作Matrigel)和不添加抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)制備的人多能干細(xì)胞來源的聚集體的明視場圖像(A)和熒光圖像(B)，在自開始漂浮培養(yǎng)起第25天，通過添加抑制Nodal信號途徑的物質(zhì)和Matrigel制備的人多能干細(xì)胞來源的聚集體的明視場圖像(C)和熒光圖像(D)，以及在自開始漂浮培養(yǎng)起第25天，通過添加抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)和Matrigel制備的人多能干細(xì)胞來源的聚集體的明視場圖像(E)和熒光圖像(F)。
[0051]圖2是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過添加抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞以及在不存在胎牛血清的情況下另外漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞制備的聚集體的明視場圖像(A)和熒光圖像(B)，在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過添加抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞以及在胎牛血清存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞制備的聚集體的明視場圖像(C)和熒光圖像(D)，以及在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過添加抑制fct信號途徑的物質(zhì)漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞以及另外在胎牛血清和作用于Sonic hedgehog(下文中，有時也稱作“Shh”)信號途徑的物質(zhì)存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞制備的聚集體的明視場圖像(E)和熒光圖像(F)。
[0052]圖3顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天構(gòu)成聚集體的表達(dá)GFP的細(xì)胞的FACS直方圖(A)，所述聚集體是通過添加抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞以及另外在不存在胎牛血清的情況下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞制備的；在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天構(gòu)成聚集體的表達(dá)GFP的細(xì)胞的FACS直方圖(B)，所述聚集體是通過添加抑制fct信號途徑的物質(zhì)漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞以及另外在胎牛血清存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞制備的；在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天構(gòu)成聚集體的表達(dá)GFP的細(xì)胞的FACS直方圖(C)，所述聚集體是通過添加抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞、在Matrigel存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞以及在胎牛血清和抑制Shh信號途徑的物質(zhì)存在下漂浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞制備的；并且圖(D)顯示GFP強(qiáng)陽性細(xì)胞的比例，所述GFP強(qiáng)陽性細(xì)胞是視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞。
[0053]圖4是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第60天免疫染色視網(wǎng)膜組織(A，B，C)和在自開始漂浮培養(yǎng)起第126天免疫染色視網(wǎng)膜組織(D，E，F(xiàn)，G，H，I)的結(jié)果，所述視網(wǎng)膜組織是通過本發(fā)明的視網(wǎng)膜組織的制備方法制備的。
[0054]圖5是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第14天(A)，第15天(B)，第16天(C)，第17天(D)通過本發(fā)明的視杯樣結(jié)構(gòu)的制備方法獲得的聚集體的同一部分的明視場和熒光圖像的重疊的圖像。
[0055]圖6是這樣的視圖，其顯示在自開始漂浮培養(yǎng)起第24至26天通過本發(fā)明的視杯樣結(jié)構(gòu)的制備方法獲得的漂浮培養(yǎng)的聚集體的通過顯微鏡觀察的明視場圖像(A)和熒光圖像(B)，和雙光子顯微鏡觀察圖像(C)和獲得自雙光子顯微鏡觀察圖像的3D重構(gòu)圖像Φ)。
[0056]圖7是這樣的視圖，其顯示利用抗-Mitf抗體和抗-ChxlO抗體，通過本發(fā)明的視杯樣結(jié)構(gòu)的制備方法的漂浮培養(yǎng)制備的視杯樣結(jié)構(gòu)的冷凍切片的免疫染色的結(jié)果。
[0057]圖8是這樣的視圖，其顯示在不添加10 μ M DAPT的條件下開始漂浮培養(yǎng)，漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第41天的情況中的熒光顯微鏡(A)，在添加DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第41天的情況中的熒光顯微鏡(B)，在不添加10 μ M DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第43天的情況中的利用抗-恢復(fù)蛋白抗體(C)或抗-Brn3抗體(E)免疫染色的冷凍切片的照片，以及在添加DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至分化誘導(dǎo)的第43天的情況中的利用抗-恢復(fù)蛋白抗體(D)或抗-Brn3抗體(F)免疫染色的冷凍切片的照片，其各自使用在自開始漂浮培養(yǎng)起第29天的Crx::GFP敲入人ES細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜組織。
[0058]圖9是這樣的視圖，其顯示在不添加10 μ M DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第49天的情況中的熒光顯微鏡(A)，在添加DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第49天的情況中的熒光顯微鏡(B)，在不添加10 μ M DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)直至自開始漂浮培養(yǎng)起第49天的情況中的利用抗-恢復(fù)蛋白抗體(C)或抗-Brn3抗體(E)免疫染色的冷凍切片的照片，以及在添加DAPT的條件下漂浮培養(yǎng)在自開始漂浮培養(yǎng)起第33天凍融視網(wǎng)膜組織后在自開始漂浮培養(yǎng)起第38天的Crx::GFP敲入人ES細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜組織直至自開始漂浮培養(yǎng)起第49天的情況中的利用抗-恢復(fù)蛋白抗體(D)或抗-Brn3抗體(F)免疫染色的冷凍切片的照片。
[0059]圖10是這樣的視圖，其顯示通過以下方式制備的聚集體的明視場:在含有抑制fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成聚集體，在基膜制備物存在下在無血清培養(yǎng)基中漂浮培養(yǎng)形成的聚集體，在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)的聚集體，并且在含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)的聚集體。
[0060]圖11是這樣的視圖，其顯示通過以下方式制備的聚集體的明視場:在含有抑制fct信號途徑的物質(zhì)的無 血清培養(yǎng)基中進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成聚集體，在基膜制備物存在下在無血清培養(yǎng)基中漂浮培養(yǎng)形成的聚集體，在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)的聚集體，并且在含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)和作用于激活蛋白A通路的物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)的聚集體。
【具體實施方式】
[0061]以下詳細(xì)說明實施本發(fā)明的方式。
[0062]在本發(fā)明中，“轉(zhuǎn)化體”是指通過轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的有生命的物質(zhì)如細(xì)胞的全部或部分。轉(zhuǎn)化體的實例包括原核細(xì)胞，酵母，動物細(xì)胞，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞等。根據(jù)靶標(biāo)，轉(zhuǎn)化體有時也被稱為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，轉(zhuǎn)化組織，轉(zhuǎn)化宿主等。用于本發(fā)明的細(xì)胞也可以是轉(zhuǎn)化體。
[0063]用于本發(fā)明中的遺傳改造技術(shù)的原核細(xì)胞的實例包括屬于埃希氏菌屬(genusEscherichia),沙雷氏菌屬(genus Serratia),芽抱桿菌屬(genus Bacillus),短桿菌屬(genus Brevibacterium)，棒桿菌屬(genus Corynebacterium),微桿菌屬(genusMicrobacterium),假單胞菌屬(genus Pseudomonas)等，如埃希氏菌 XLl-Blue,埃希氏菌XL2-Blue，和埃希氏菌DH1。這些細(xì)胞具體描述于，例如，Sambrook，J和Russell, D.W.的 “Molecular Cloning (分子克隆)(第 3 版)”,附錄 3 (卷 3), Vector and Bacterialstrains (載體和菌株).A3.2 (Cold Spring Harbor USA2001)。
[0064]本發(fā)明中的“載體”是指能夠?qū)⑺璧亩嗪塑账嵝蛄修D(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞中的載體。這樣的載體的實例包括能夠在宿主細(xì)胞如原核細(xì)胞，酵母，動物細(xì)胞，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，動物個體和植物個體等中自主復(fù)制的那些，或能夠整合到染色體中并且在適于多核苷酸轉(zhuǎn)錄的位置處含有啟動子的那些。
[0065]在所述載體中，適于克隆的載體有時被稱為“克隆載體”。這樣的克隆載體通常具有含有多個限制酶位點的多個克隆位點。目前，有很多載體可用于相關(guān)領(lǐng)域中的基因克隆，并且它們被經(jīng)銷商以不同的名稱銷售，因為它們稍有不同(例如，多克隆位點處的限制酶的種類和序列)。例如，代表的克隆載體描述于(經(jīng)銷商也被描述)Sambix)0k，J和Russell, D.W.的 “Molecular Cloning (分子克隆)(第 3 版)”,附錄 3 (卷 3), Vector andBacterial strains (載體和菌株).A3.2 (Cold Spring Harbor USA2001),并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)目標(biāo)適當(dāng)?shù)厥褂盟鼈儭?br> [0066]本發(fā)明中的“載體”還包括“表達(dá)載體”，“報告載體”，和“重組載體”。“表達(dá)載體”是指這樣的核酸序列，其中除了結(jié)構(gòu)基因和啟動子以外的調(diào)節(jié)其表達(dá)的各種調(diào)節(jié)元件以這樣的方式連接以致它們在宿主中是可操作的?！罢{(diào)節(jié)元件”的實例包括終止子，選擇標(biāo)記如藥物抗性基因，以及含有增強(qiáng)子的調(diào)節(jié)元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，使用的有生命的物質(zhì)(例如，動物)的表達(dá)載體的類型和調(diào)節(jié)元件的類型可以根據(jù)宿主細(xì)胞而改變。
[0067]本發(fā)明中的“重組載體”的實例包括(a)用于基因組文庫篩選的λ FIX載體(噬菌體載體)，(b)用于cDNA篩選的λ ZAP載體(噬菌體載體)，和(c)用于克隆基因組DNA的pBluescript I I SK+/-, pGEM,和pCR2.1載體(質(zhì)粒載體)。“表達(dá)載體”的實例包括pSV2/neo 載體,pcDNA 載體,pUC18 載體,pUC19 載體,pRc/RSV 載體,pLenti6/V5_Dest 載體,pAd/CMV/V5-DEST載體，pDON-A1-2/neo載體，和pME1-5/neo載體(質(zhì)粒載體)等?！皥蟾孑d體”的實例包括pGL2載體，pGL3載體，pGL4.10載體，pGL4.11載體，pGL4.12載體，pGL4.70載體，pGL4.71 載體，pGL4.72 載體，pSLG 載體，pSLO 載體，pSLR 載體，pEGFP 載體，pAcGFP 載體,pDsRed載體等。根據(jù)前述Molecular Cloning (分子克隆)文獻(xiàn)可以適當(dāng)?shù)厥褂眠@些載體。
[0068]在本發(fā)明中，作為用于將核酸分子引入細(xì)胞中的技術(shù)，例如，可以提及轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染等。作為此種引入技術(shù)，可以具體提及例如，描述于AusubelF.A.等編輯(1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY ；SambrookJ.等(1987)，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2 版和第 3 版；ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；特干丨J , ExperimentalMedicine “transgene&expression analysis experiment method，，Y0D0SHA C0., LTD., 1997等中的方法。作為用于確認(rèn)基因的胞內(nèi)引入的技術(shù)，可以提及RNA印跡分析，蛋白質(zhì)印跡分析或其他公知的常規(guī)技術(shù)等。
[0069]在本發(fā)明中，“干細(xì)胞”是指甚至在細(xì)胞分化后仍保持相同分化能力的細(xì)胞，并且其組織可以在組織損傷時再生。此處，干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)或組織干細(xì)胞(也被稱為組織的干細(xì)胞，組織特異性干細(xì)胞或體干細(xì)胞)，或人造的多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞:誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)，但不限于此。如從上述來源于干細(xì)胞的組織細(xì)胞可以再生組織的事實理解的，已知干細(xì)胞可以分化為與活體中的細(xì)胞接近的正常細(xì)胞。
[0070]干細(xì)胞可以獲得自給定的組織，或者也可以購買市售產(chǎn)品。例如，人胚胎干細(xì)胞，KhES-1, KhES-2 和 KhES-3 可獲得自 Kyoto University 的前沿醫(yī)學(xué)研究所(Institute forFrontier Medical Sciences)。小鼠胚胎干細(xì)胞EB5細(xì)胞可獲得自RIKEN，而D3細(xì)胞系可獲得自ATCC。
[0071]干細(xì)胞可以通過根據(jù)本身已知的方法培養(yǎng)來維持。例如，干細(xì)胞可以通過補(bǔ)充以胎牛血清(FCS)、敲除血清置換物(Knockout Serum Replacement, KSR)和LIF的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)來維持。
[0072]在本發(fā)明中，“多能干細(xì)胞”是指這樣的干細(xì)胞，其可以在體外培養(yǎng)并且有能力分化成構(gòu)成除胎盤以外的活體的任何細(xì)胞(來源于三胚層(外胚層、中胚層、內(nèi)胚層)的組織)(分化多能性)，其包括胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)。“多能干細(xì)胞”獲得自受精卵，克隆胚胎，再生干細(xì)胞，和組織中的干細(xì)胞。其還包括，在向體細(xì)胞中引入若干種基因后具有類似于胚胎干細(xì)胞的分化多能性的人工多能性的細(xì)胞(也被稱為人造多能干細(xì)胞)。多能干細(xì)胞可以通過本身已知的方法制備。制備方法的實例包括描述于Cell 131 (5)pp.861-872，Cell 126(4)pp.663-676 等中的方法。
[0073]在本發(fā)明中，“胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)”是指具有自身復(fù)制能力和多能性(即，“多能性”)的干細(xì)胞，其是源自早期胚胎的多能干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞首先建立于1981年，并且自1989年起已被應(yīng)用于產(chǎn)生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干細(xì)胞，其也被用于再生醫(yī)學(xué)。
[0074]在本發(fā)明中，“人造多能干細(xì)胞”是指通過直接重編程分化的細(xì)胞如成纖維細(xì)胞等，通過表達(dá)若干種基因如0ct3/4、Sox2、Klf4和Myc被誘導(dǎo)而具有多能性的細(xì)胞，其在 2006 年由 Yamanaka 等在小鼠細(xì)胞中建立(Takahashi K, Yamanaka S.Cell.2006,126 (4)，p663-676)。在2007年，其也在人成纖維細(xì)胞中被建立，并且具有類似于胚胎干細(xì)胞的多倉泛性(Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka
S.Cell.2007, 131 (5), p861_872.；Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-BourgetJ, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA.,Science.2007, 318(5858),pl917_1920.；Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, TakahashiK, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S.Nat Biotechnol., 2008，26(l)，pl01-106)。
[0075]遺傳修飾的多能干細(xì)胞可以例如使用同源重組技術(shù)制備。要被修飾以用于制備修飾的多能干細(xì)胞的染色體上的基因的實例包括組織相容性抗原基因，與由神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的紊亂所致的疾病相關(guān)的基因等。染色體上的目標(biāo)基因可以通過描述于Manipulatingthe Mouse Embryo, A Laboratory Manual (操縱小鼠胚胎，實驗室手冊)，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1994) ；Gene Targeting,A Practical Approach (基因?qū)じ锇停瑢嵱梅椒?，IRL Press, Oxford University Press (1993) ；Bio Manual 系列 8, genetargeting, Production of mutant mouse by using ES cells (基因?qū)じ顴，通過使用 ES細(xì)胞制備突變體小鼠)，Y0D0SHA C0.，LTD.(1995)等中的方法修飾。
[0076]具體地，例如，分離要修飾的靶基因的基因組基因(例如，組織相容性抗原基因、疾病相關(guān)基因等)，并且使用分離的基因組基因制備用于靶基因的同源重組的靶載體。將制備的靶載體引入干細(xì)胞中，并且選擇顯示靶基因和靶載體間的同源重組的細(xì)胞，由此可以制備在染色體上具有修飾的基因的干細(xì)胞。
[0077]作為用于分離靶基因的基因組基因的方法，可以提及描述于MolecularCloning, A Laboratory Manual (分子克隆，實驗室手冊)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)中的當(dāng)前實驗方案)，John Wiley & Sons (1987-1997)等中的已知方法。此外，可以使用基因組DNA文庫篩選系統(tǒng)(由 Genome Systems 生產(chǎn)),Universal Genomeffalker Kits (由 CL0NTECH 生產(chǎn))等分離靶基因的基因組基因。
[0078]根據(jù)描述于Gene Targeting, A Practical Approach (基因?qū)れ?，實用方?，IRLPress, Oxford University Press (1993) ；Bio Manual 系列 8, gene targeting, Productionof mutant mouse by using ES cells (基因?qū)じ顴，通過使用ES細(xì)胞制備突變體小鼠)，Y0D0SHA C0., LTD.(1995)等中的方法，可以制備用于靶基因的同源重組的靶載體，并且可以有效地選擇同源重組體。靶載體可以是任何置換類型和插入類型的，并且選擇方法可以是陽性選擇，啟動子選擇，陰性選擇，PolyA選擇等。
[0079]作為用于從選擇的細(xì)胞系中選擇目的同源重組體的方法，可以提及用于基因組DNA的Southern雜交法、PCR法等。
[0080]在本發(fā)明中，“組織”是指細(xì)胞群體的結(jié)構(gòu)，其具有一定的構(gòu)造，其中形狀和性質(zhì)不同的超過一種類型的細(xì)胞在空間上被布置成特定的模式。
[0081]在本發(fā)明中，“視網(wǎng)膜組織”是指這樣的視網(wǎng)膜組織，其中構(gòu)成活體視網(wǎng)膜中的相應(yīng)的視網(wǎng)膜層的至少兩種以上類型的細(xì)胞如光感受器，水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長突細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，其前體細(xì)胞或其視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞在空間上被布置成層。關(guān)于各細(xì)胞，哪種細(xì)胞構(gòu)成哪個視網(wǎng)膜層可以通過已知方法確認(rèn)，例如，細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。
[0082]視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)記物的實例包括，但不限于，Rax(視網(wǎng)膜的先祖細(xì)胞)，PAX6(先祖細(xì)胞)，巢蛋白(nestin)(其表達(dá)在下丘腦神經(jīng)元的先祖細(xì)胞中而不表達(dá)在視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞中)，Soxl (其表達(dá)在下丘腦神經(jīng)上皮中但是不表達(dá)在視網(wǎng)膜中)，Crx(光感受器的前體細(xì)胞)等。特別 地，上述視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)元的標(biāo)記物的實例包括，但不限于，ChxlO (雙極細(xì)胞)，L7(雙極細(xì)胞)，Tujl (神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)，Brn3(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)，鈣視網(wǎng)膜蛋白(Calretinin)(無長突細(xì)胞)，鈣結(jié)合蛋白(Calbindin)(水平細(xì)胞)，視紫紅質(zhì)(Rhodopsin)(光感受器)，恢復(fù)蛋白(光感受器)，RPE65 (色素上皮)，Mitf (色素上皮)Nrl (視桿細(xì)胞)，Rxr- Y (視錐細(xì)胞)等。
[0083]在本發(fā)明中，“視杯樣結(jié)構(gòu)”是指具有與胚胎發(fā)育過程中的視杯類似的形狀的結(jié)構(gòu)。在胚胎發(fā)育過程中，視網(wǎng)膜的原基發(fā)育自間腦的側(cè)面，并且形成類似從間腦突出的囊。所述囊樣上皮結(jié)構(gòu)被稱為視泡。視泡的最外部(未來將成為神經(jīng)視網(wǎng)膜)逐漸向視泡內(nèi)部凹入，并且形成視杯，視杯是由上皮的內(nèi)外兩層構(gòu)成的杯狀組織。視杯之后長大并且形成具有視網(wǎng)膜組織的視網(wǎng)膜。其是否是視杯樣結(jié)構(gòu)可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過利用顯微鏡、放大鏡等進(jìn)行觀察來確認(rèn)。
[0084]要在本發(fā)明中制備的視杯樣結(jié)構(gòu)不僅顯示形態(tài)學(xué)上的視杯樣突起而且還顯示在構(gòu)成視杯樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞中的Rax的高頻表達(dá)，Rax是視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞標(biāo)記物。此外，視杯樣結(jié)構(gòu)的外層還顯示表達(dá)Mitf的視網(wǎng)膜色素上皮的層，并且內(nèi)層顯示構(gòu)成視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞，如表達(dá)ChxlO的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞。此種視杯樣結(jié)構(gòu)非常類似活體發(fā)育中的視杯組織的結(jié)構(gòu)。
[0085]本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜層”是指構(gòu)成視網(wǎng)膜的各層。其具體實例包括視網(wǎng)膜色素上皮層，光感受器層，外部限制膜，外部核層，外部叢狀層，內(nèi)部核層，內(nèi)部叢狀層，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，神經(jīng)纖維層和內(nèi)部限制膜。
[0086]本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞”是指構(gòu)成視網(wǎng)膜層并且特異于視網(wǎng)膜層的神經(jīng)細(xì)胞。[0087]本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞”是指可以分化為光感受器，水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長突細(xì)胞，和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的任何成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞的先祖細(xì)胞。
[0088]另一方面，光感受器前體，水平前體細(xì)胞，雙極前體細(xì)胞，無長突前體細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)前體細(xì)胞是被確定分別分化為光感受器，水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長突細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的前體細(xì)胞。
[0089]本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜色素上皮”是指存在于活體的視網(wǎng)膜中的神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的外側(cè)上的上皮細(xì)胞。是否是視網(wǎng)膜色素上皮可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過例如細(xì)胞標(biāo)記物(RPE65(色素上皮)，Mitf (色素上皮)等)的表達(dá)、黑素顆粒的存在、特征多角細(xì)胞形狀等容易地確認(rèn)。
[0090]本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基可以制備自作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的用于培養(yǎng)動物細(xì)胞的培養(yǎng)基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實例包括BME培養(yǎng)基，BGJb培養(yǎng)基，CMRL1066培養(yǎng)基，Glasgow MEM培養(yǎng)基，改進(jìn)的MEM Zinc Option培養(yǎng)基，MDM培養(yǎng)基，Mediuml99培養(yǎng)基，Eagle MEM培養(yǎng)基，a MEM培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，火腿培養(yǎng)基，RPMI1640培養(yǎng)基，F(xiàn)ischer氏培養(yǎng)基，及它們的混合培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)基不受特別的限制，只要其可以用于培養(yǎng)動物細(xì)胞。
[0091]本發(fā)明中的“無血清培養(yǎng)基”是指不含未調(diào)整的或未純化的血清的培養(yǎng)基。含有純化的來源于血液的組分和來源于動物組織的組分(例如，生長因子)的培養(yǎng)基被認(rèn)為是無血清培養(yǎng)基，除非其中含有未調(diào)整的或未純化的血清。
[0092]培養(yǎng)基不受特別的限制，只要其如上所限定。然而，為了避免復(fù)雜的制備，添加有適當(dāng)量(例如，1-20% )的市售KSR的無血清培養(yǎng)基(GMEM或DMEM，0.lmM2_巰基乙醇，0.1mM非必需氨基酸混合物，ImM丙酮酸鈉)可以用作無血清培養(yǎng)基。
[0093]此外，無血清培養(yǎng)基可以含有血清置換物。血清置換物可以合適地含有，例如，清蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，脂肪酸，月父原蛋白如體，痕量兀素，2_疏基乙醇或3 ’硫醇甘油(3’ thiolglycerol),其等效物等。此種血清置換物可以通過例如W098/30679中所述的方法制備。此外，為了更方便地進(jìn)行本發(fā)明的方法，血清置換物可以是市售產(chǎn)品。此種市售血清置換物的實例包括Chemically-defined Lipid concentrated(化學(xué)上限定的脂質(zhì)濃縮物)(由Gibco生產(chǎn))和Glutamax (由Gibco生產(chǎn))。
[0094]用于漂浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基可以含有脂肪酸或脂質(zhì)，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，維生素，生長因子，細(xì)胞因子，抗氧化劑，2-巰基乙醇，丙酮酸，緩沖劑，無機(jī)鹽等。
[0095]本發(fā)明中的“含血清的培養(yǎng)基”是指含有未調(diào)整的或未純化的血清的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基不受特別限制，只要其如上所限定。此外，含血清的培養(yǎng)基可以含有脂肪酸或脂質(zhì)，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，維生素，生長因子，細(xì)胞因子，抗氧化劑，2-巰基乙醇，丙酮酸，緩沖劑，無機(jī)鹽等。
[0096]本發(fā)明中的“漂浮培養(yǎng)”是指在防止細(xì)胞或細(xì)胞質(zhì)粘附到細(xì)胞培養(yǎng)容器材料等的條件下培養(yǎng)。
[0097]用于漂浮培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)容器不受特別限制，只要其使“漂浮培養(yǎng)”成為可能，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)貙ζ溥M(jìn)行確定。此種細(xì)胞培養(yǎng)容器的實例包括燒瓶，組織培養(yǎng)燒瓶，盤，培養(yǎng)皿，組織培養(yǎng)皿，多盤(multidish),微板,微孔板,微孔，多板(multiplate),多孔板,室載玻片(chamber slide),盤碟(schale),試管,碟,培養(yǎng)袋和滾瓶(roller bottle)。因為這些細(xì)胞培養(yǎng)容器用于漂浮培養(yǎng)，所以它們優(yōu)選是細(xì)胞非粘附性的。作為細(xì)胞非粘附性容器，可以使用其表面未被人工處理(例如，利用胞外基質(zhì)的包被處理等)以提高細(xì)胞粘附性的容器等。
[0098]本發(fā)明中的“靈長類”是指屬于靈長類的哺乳動物。靈長類的實例包括卷鼻猴亞目(Strepsirrhini)如狐猴、懶猴和Tsubai,以及類人猿亞目(Haplorhini)如猴、類人猿和人。
[0099]<視網(wǎng)膜組織的制備方法>
[0100]本發(fā)明的第一方面是制備視網(wǎng)膜組織的方法，其包括以下步驟(1)至(3):
[0101](I)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的聚集體，
[0102](2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將第一步中形成的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，和
[0103](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將第二步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0104](I)第一步
[0105]解釋第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的聚集體。
[0106]抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)不受特別限制，只要其可以抑制由Wnt介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的實例包括Dkkl, Cerberus蛋白,Wnt受體抑制劑,可溶型Wnt受體，fct抗體，酪蛋白激酶抑制劑，顯性陰性fct蛋白，CK1-7 (N-(2-氨基乙基)-5-氯-異喹啉-8-磺酰胺)，D4476 (4- {4- (2，3- 二氫苯并[1，4] 二嗯烯-6-基)~5~吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基}苯酰胺)，IffR-1-內(nèi)(IWR-1-endo) (IffRle)，IWP-2 等。
[0107]用于本發(fā)明的抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的濃度僅需要是形成多能干細(xì)胞的聚集體的濃度。例如，常見的抑制fct信號途徑的物質(zhì)如IWRle以約0.1 μ M至100 μ Μ，優(yōu)選地約I μ M至10 μ Μ，更優(yōu)選地約3 μ M的濃度添加。
[0108]抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)可以在開始漂浮培養(yǎng)前被添加至無血清培養(yǎng)基，或在自開始漂浮培養(yǎng)起的數(shù)天內(nèi)(例如，5天內(nèi))添加到無血清培養(yǎng)基。優(yōu)選地，抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)在自開始漂浮培養(yǎng)起的5天內(nèi)、更優(yōu)選地3天內(nèi)、最優(yōu)選地與開始漂浮培養(yǎng)同時被添加至無血清培養(yǎng)基。此外，在添加抑制fct信號途徑的物質(zhì)的情況下，漂浮培養(yǎng)進(jìn)行至自開始漂浮培養(yǎng)起的第18天、更優(yōu)選地第12天。
[0109]培養(yǎng)條件如第一步中的培養(yǎng)溫度和CO2濃度可以被適當(dāng)?shù)卮_定。而培養(yǎng)溫度不受特別限制，其為，例如，約30至40°C，優(yōu)選地約370C。CO2濃度為，例如，約I至10%，優(yōu)選地約5%。
[0110]本發(fā)明中的“聚集體”是指分散在培養(yǎng)基中但聚集以形成聚集體的大量細(xì)胞。本發(fā)明中的“聚集體”包括由在漂浮培養(yǎng)開始時分散的細(xì)胞形成的聚集體和在漂浮培養(yǎng)開始時已經(jīng)形成的聚集體。
[0111]當(dāng)細(xì)胞聚集從而形成細(xì)胞聚集體并且對聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)時，“形成聚集體”是指“快速地聚集給定數(shù)目的分散的干細(xì)胞”以形成在質(zhì)量上均勻的細(xì)胞聚集體。
[0112]形成聚集體的實驗操作的實例包括涉及通過使用具有小孔的平板(96孔板)、微孔等將細(xì)胞保持在小空間中的方法，涉及通過使用小離心管短時間離心來聚集細(xì)胞的方法[0113]第一步中多能干細(xì)胞的濃度可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定，以更均勻和有效地形成多能干細(xì)胞的聚集體。形成聚集體時多能干細(xì)胞的濃度不受特別限制，只要其允許形成干細(xì)胞的均勻聚集體。例如，當(dāng)使用96孔微孔板對人ES細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)時，加入制備成每孔約I X IO3至約5 X IO4個細(xì)胞、優(yōu)選地約3 X IO3至約3 X IO4個細(xì)胞、更優(yōu)選地約5X IO3至約2X IO4個細(xì)胞、最優(yōu)選地約9X IO3個細(xì)胞的液體，并且靜置平板以形成聚集體。
[0114]形成聚集體所需的漂浮培養(yǎng)的時間可以根據(jù)所用的多能干細(xì)胞適當(dāng)?shù)卮_定，只要細(xì)胞可以快速聚集。為了形成均勻的聚集體，其理想地是盡可能的短。例如，在人ES細(xì)胞的情況中，聚集體理想地 優(yōu)選地在24小時內(nèi)、更優(yōu)選地在12小時內(nèi)形成。聚集體形成所需的時間可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過控制用于聚集細(xì)胞的工具、離心條件等適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。
[0115]本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以基于聚集體的尺寸和細(xì)胞數(shù)目，宏觀形態(tài)，微觀形態(tài)，通過組織染色分析及其均勻性，分化和未分化標(biāo)記物的表達(dá)及其均勻性，控制分化標(biāo)記物的表達(dá)及其同步，聚集體間分化效率的再現(xiàn)性等來確定是否已經(jīng)形成多能干細(xì)胞的聚集體。
[0116](2)第二步
[0117]解釋第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中對第一步中形成的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0118]“基膜制備物”是指含有基膜構(gòu)成組分的制備物，當(dāng)能夠形成基膜的目的細(xì)胞被鋪板于其上并培養(yǎng)時，其具有與上皮細(xì)胞類似的控制細(xì)胞形成，分化，生長，活動性，功能表達(dá)等的功能。此處，“基膜構(gòu)成組分”是指存在于動物組織中的上皮細(xì)胞層和間隙細(xì)胞層等之間的薄膜形式的細(xì)胞外基質(zhì)分子。基膜制備物可以通過例如以下方式制備:利用能夠溶解細(xì)胞脂質(zhì)的溶液、堿溶液等移除經(jīng)由基膜粘附在載體上的能夠形成基膜的細(xì)胞。優(yōu)選的基膜制備物的實例包括可作為基膜組分商購的產(chǎn)品(例如，MatrigeU下文中，有時也稱作Matrigel))和已知作為基膜組分的細(xì)胞外基質(zhì)分子(例如，層粘連蛋白，IV型膠原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，巢蛋白等)。
[0119]Matrigel是制備自來源于Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤的基膜的產(chǎn)品。Matrigel的主要成分是IV型膠原蛋白，層粘連蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。除了這些以外，還含有由EHS腫瘤天然產(chǎn)生的TGF-β，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，組織纖溶酶原激活物和生長因子。Matrigel的“生長因子減少的產(chǎn)品”具有比通常Matrigel低的生長因子濃度，并且其標(biāo)準(zhǔn)濃度為〈0.5ng/ml (對于EGF)，〈0.2ng/ml (對于NGF)，<5pg/ml (對于PDGF)，5ng/ml (對于IGF-1)，以及1.7ng/ml (對于TGF- β )。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選使用“生長因子減少的產(chǎn)品”。
[0120]雖然在第二步中添加到用于漂浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基的基膜制備物的濃度不受特別限制，只要神經(jīng)組織的上皮結(jié)構(gòu)(例如，視網(wǎng)膜組織)被穩(wěn)定地保持，但是例如，當(dāng)使用Martigel時，其優(yōu)選為培養(yǎng)基的1/20至1/200體積，更優(yōu)選為約1/100體積。雖然當(dāng)開始培養(yǎng)干細(xì)胞時基膜制備物可以已經(jīng)被添加到培養(yǎng)基，但是優(yōu)選地，其在自開始漂浮培養(yǎng)起5天內(nèi)、更優(yōu)選地在2天內(nèi)被添加至無血清培養(yǎng)基。
[0121]作為第二步中使用的無血清培養(yǎng)基，可以直接使用第一步中使用的無血清培養(yǎng)基，或者可以用新鮮無血清培養(yǎng)基替換。
[0122]當(dāng)將第一步中使用的無血清培養(yǎng)基直接用于該步時，“基膜制備物”可以被添加到培養(yǎng)基。
[0123]用于第一步和第二步中的漂浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基不受特別限制，只要其如上所限定。然而，為了避免復(fù)雜的制備，優(yōu)選地使用添加有適當(dāng)量的市售KSR(敲除血清置換物)的無血清培養(yǎng)基(GMEM或DMEM，0.lmM2_巰基乙醇，0.1mM非必需氨基酸混合物，ImM丙酮酸鈉)作為無血清培養(yǎng)基。添加到無血清培養(yǎng)基的KSR的量不受特別限制并且，例如，在人ES細(xì)胞的情況中，其通常為I至20%、優(yōu)選為2至20%。
[0124]第二步中的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度和CO2濃度可以被適當(dāng)?shù)卮_定。雖然培養(yǎng)溫度不受特別限制，但是其為，例如約30至40°C，優(yōu)選為約37°C。CO2濃度為例如約I至10%、優(yōu)選為約5%。
[0125](3)第三步
[0126]解釋第三步，在含血清的培養(yǎng)基中對第二步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0127]作為用于第三步的含血清的培養(yǎng)基，可以使用直接添加血清的用于第二步的培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，或者用新鮮的含血清的培養(yǎng)基替換用于第二步的培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。
[0128]作為添加到第三步中的 培養(yǎng)基的血清，例如，可以使用哺乳動物血清如牛血清，小牛血清，胎牛血清，馬血清，小馬血清,胎馬血清,兔血清,小兔血清，胎兔血清和人血清等。
[0129]自開始漂浮培養(yǎng)起，在第7天或之后，更優(yōu)選地在第9天或之后，最優(yōu)選地在第12天或之后添加血清。添加的血清的濃度為約I至30%，優(yōu)選為約3至20%，更優(yōu)選為約10%。
[0130]第三步中使用的含血清的培養(yǎng)基不受特別限制，只要其如上所限定。優(yōu)選使用上述添加血清的無血清培養(yǎng)基(GMEM或DMEM，0.lmM2_巰基乙醇，0.1mM非必需氨基酸混合物，ImM丙酮酸鈉)。
[0131]作為此種含血清的培養(yǎng)基，也可以使用添加有適當(dāng)量的市售KSR(敲除血清置換物)的培養(yǎng)基。
[0132]在第三步中，視網(wǎng)膜組織的制備效率可以通過除了血清外添加作用于Shh信號途徑的物質(zhì)來提高。
[0133]作用于Shh信號途徑的物質(zhì)不受特別限制，只要其可以增強(qiáng)由Shh介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。作用于Shh信號途徑的物質(zhì)的實例包括屬于Hedgehog家族的蛋白(例如，Shh), Shh受體，Shh受體激動劑，Purmorphamine, SAG等。
[0134]該步中使用的作用于Shh信號途徑的物質(zhì)的濃度為，例如，在常見的作用于Shh信號途徑的物質(zhì)如SAG的情況中，約0.1nM至10 μ M，優(yōu)選地約IOnM至I μ Μ，更優(yōu)選地約ΙΟΟηΜ。
[0135]因此制備的視網(wǎng)膜組織存在以覆蓋聚集體的表面。通過本發(fā)明的制備方法制備的是否是視網(wǎng)膜組織可以通過如以下(4)中所述的免疫染色方法來確認(rèn)。
[0136]還可能的是，用鑷子等物理切除存在于聚集體表面上的視網(wǎng)膜組織。在這種情況中，因為除視網(wǎng)膜組織以外的神經(jīng)組織可以形成在各聚集體的表面上，從聚集體切除的部分神經(jīng)組織被切斷并通過如(4)中所述的免疫染色方法確認(rèn)，由此組織被確認(rèn)為視網(wǎng)膜組織。
[0137](4)視網(wǎng)膜組織的確認(rèn)方法
[0138]視網(wǎng)膜組織可以通過上述第一步至第三步制備。此外，提供第一步至第三步制備的視網(wǎng)膜組織可以通過以下方法確認(rèn)。
[0139]在含血清的培養(yǎng)基中對第三步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。用于漂浮培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)容器的實例包括上述那些。漂浮培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、CO2濃度和O2濃度可以被適當(dāng)?shù)卮_認(rèn)。雖然培養(yǎng)溫度不受特別限制，但其為，例如，約30至40°C，優(yōu)選為約37°C。CO2濃度為，例如，約I至10%，優(yōu)選為約5%。O2濃度為，例如，20至70%，優(yōu)選為20至60%，更優(yōu)選為30至50%。
[0140]雖然該步中的培養(yǎng)時間不受特別限制，但其通常不少于48小時，優(yōu)選地不少于7天。
[0141]視網(wǎng)膜組織可以通過以下方式確認(rèn):在完成漂浮培養(yǎng)后，用固定劑如多聚甲醛溶液固定聚集體，制備冷凍切片，并且通過免疫染色方法等確認(rèn)層結(jié)構(gòu)的形成。因為視網(wǎng)膜組織的各層由不同的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞(光感受器，水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長突細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)組成，所以層結(jié)構(gòu)的形成可以通過免疫染色方法使用針對前述在這些細(xì)胞中表達(dá)的標(biāo)記物的抗體來確認(rèn)。
[0142]〈視杯樣結(jié)構(gòu)的制備方法〉
[0143]本發(fā)明的第二方面是視杯樣結(jié)構(gòu)的制備方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于Shh信號途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中對通過上述〈視網(wǎng)膜組織的制備方法 > 獲得的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。作為在上述〈視網(wǎng)膜組織的制備方法 > 中獲得的視網(wǎng)膜組織，可以使用包含在上述〈視網(wǎng)膜組織的制備方法〉的第三步中培養(yǎng)的視網(wǎng)膜組織的聚集體。作為第二個發(fā)明的實施方案，可以提及包括以下步驟(1) 至(4)的制備視杯樣結(jié)構(gòu)的方法:
[0144](I)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的聚集體，
[0145](2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中對第一步中形成的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，
[0146](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中對第二步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，和
[0147](4)第四步，在各自含有作用于Shh信號途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中對第三步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0148]此處，作用于Shh信號途徑的物質(zhì)不受特別限制，只要其可以增強(qiáng)由Shh介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。作用于Shh信號途徑的物質(zhì)的實例包括屬于Hedgehog家族的蛋白(例如，Shh),Shh 受體，Shh 受體激動劑，Purmorphamine, SAG 等。
[0149]用于本發(fā)明的第二方面的作用于Shh信號途徑的物質(zhì)的濃度為，例如，在常見的作用于Shh信號途徑的物質(zhì)如SAG的情況中，約0.1nM至10 μ M，優(yōu)選為約IOnM至I μ Μ，更優(yōu)選為約ΙΟΟηΜ。
[0150]作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的實例包括屬于Wnt家族的蛋白，Wnt受體，Wnt受體激動劑，GSK3 β抑制劑(例如，6-溴靛玉紅-3，-月虧(BIO)，CHIR99021, Kenpaullone)等。[0151 ] 用于本發(fā)明的第二方面的作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的濃度為，例如，在常見的作用于fct信號途徑的物質(zhì)如CHIR99021的情況中，約0.1 μ M至100 μ M，優(yōu)選為約I μ M至30 μ Μ，更優(yōu)選為約3 μ Μ。
[0152]自開始漂浮培養(yǎng)起，在第12天或之后并且在第25天或之前，優(yōu)選地在第15或之后并且在第18天或之前添加作用于Shh信號途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)。在此情況中，優(yōu)選使用不含在聚集體形成步驟中添加的抑制fct信號途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基。
[0153]自開始漂浮培養(yǎng)起，在第18天或之后，產(chǎn)生視杯樣結(jié)構(gòu)，其形式為自聚集體的突起。其是否是視杯樣結(jié)構(gòu)可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過利用顯微鏡、放大鏡等觀察來確認(rèn)。
[0154]因此制備的視杯樣結(jié)構(gòu)形成外層和內(nèi)層的兩層結(jié)構(gòu)。因為視網(wǎng)膜色素上皮存在于外層中而視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞存在于內(nèi)層中，所以視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮可以通過例如制備視杯樣結(jié)構(gòu)的冷凍切片并進(jìn)行免疫染色來觀察。
[0155]此外，因為通過本發(fā)明的方法制備的視杯樣結(jié)構(gòu)形成為自聚集體的突起的形式，還可能的是，通過以下方式獲得高純 度的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞:物理和形態(tài)學(xué)上切去自聚集體的突起，之后對所得的視杯樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)和FACS分選。用于切去視杯樣結(jié)構(gòu)的方法不受特別限制，并且可以使用精細(xì)的鑷子等容易地將其從干細(xì)胞的聚集體切去。
[0156]<視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞的制備方法>
[0157]本發(fā)明的第三方面是制備視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括使包含在來源于靈長類多能干細(xì)胞的視網(wǎng)膜組織中的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞接觸抑制Notch信號途徑的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞可以制備自視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞。
[0158](靈長類多能干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜組織的制備方法)
[0159]說明用于視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞的制備方法中的“靈長類多能干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜組織”。
[0160]作為靈長類多能干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜組織，例如可以使用通過上述〈視網(wǎng)膜組織的制備方法 > 獲得的視網(wǎng)膜組織，或制備自通過上述〈視杯樣結(jié)構(gòu)的制備方法 > 獲得的視杯樣結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜組織。
[0161]在后一種情況中，視網(wǎng)膜組織可以通過以下方式制備:對上述〈視杯樣結(jié)構(gòu)的制備方法 > 的第四步中形成的視杯樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步漂浮培養(yǎng)。
[0162]因為如上所述，視杯樣結(jié)構(gòu)形成為自聚集體的突起的形式，所以可以通過以下方式獲得高純度的視網(wǎng)膜組織:物理和形態(tài)學(xué)上切去自聚集體的突起，之后進(jìn)行分離和培養(yǎng)。用于切去視杯樣結(jié)構(gòu)的方法不受特別限制，并且可以使用精細(xì)鑷子等將其容易地自干細(xì)胞的聚集體切去。
[0163]如上所述制備的視網(wǎng)膜組織和視杯樣結(jié)構(gòu)含有視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞，并且視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞可以通過使前述視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞接觸抑制Notch信號途徑的物質(zhì)而制備自視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞。
[0164]<抑制Notch信號途徑的物質(zhì)>
[0165]接下來，說明用于視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞的制備方法中的抑制Notch信號途徑的物質(zhì)。
[0166]抑制Notch信號途徑的物質(zhì)不受特別限制，只要其可以抑制由Notch介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。抑制Notch信號途徑的物質(zhì)的實例包括Notch抗體，Notch受體拮抗劑，ADAM抑制劑，Y分泌酶抑制劑等。
[0167]Y分泌酶抑制劑的實例包括N-[N-(3，5- 二氟苯乙?；?_L_丙氨酰基]_S_苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)。
[0168]y分泌酶抑制劑的濃度不受特別限制，只要其可以增強(qiáng)視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞向光感受器前體細(xì)胞或光感受器的分化。所述濃度為，例如，在常見的Y分泌酶抑制劑的情況中，約0.1至1000 μ Μ，優(yōu)選為約I至100 μ Μ，更優(yōu)選為約10 μ Mo
[0169]對于制備自靈長類多能干細(xì)胞的視網(wǎng)膜組織，自開始漂浮培養(yǎng)靈長類多能干細(xì)胞起，在第15天或之后并且在第200天或之前，添加Y分泌酶抑制劑。優(yōu)選地，在第20天或之后并且在第150天或之前，更優(yōu)選地在第25天或之后并且在第100天或之前，向分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)基添加Y分泌酶抑制劑。
[0170]在Υ分泌酶抑制劑存在下粘附培養(yǎng)的時間可以是這樣的長度，其允許更有效地制備光感受器前體細(xì)胞或光感受器。這樣的時間的長度可以為，例如，約3天以上，優(yōu)選為約5至100天,更優(yōu)選為約7至30天。
[0171](視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞的確認(rèn)方法)
[0172]通過參照視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞是光感受器、光感受器前體或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的情況來說明確認(rèn)如上所述制備的視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞的方法。
[0173]制備的視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞是否是光感受器前體細(xì)胞可以通過已知方法確認(rèn),例如,通過光感受器前體細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。光感受器前體細(xì)胞標(biāo)記物的實例包括Crx。
[0174]光感受器包含視 桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞。制備的細(xì)胞是否是光感受器可以通過本身已知的方法確認(rèn)，例如，通過光感受器標(biāo)記物的表達(dá)。光感受器標(biāo)記物的實例包括視紫紅質(zhì)(視桿細(xì)胞)，紅/綠視蛋白(視錐細(xì)胞)，藍(lán)視蛋白(視錐細(xì)胞)，恢復(fù)蛋白(視桿細(xì)胞，視維細(xì)胞)等。
[0175]此外，制備的視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞是否是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以通過已知方法確認(rèn)，例如，通過神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記物的實例包括Brn3。
[0176]在完成粘附培養(yǎng)后，光感受器前體細(xì)胞或光感受器可以分離自視網(wǎng)膜組織。此種分離可以通過本身已知的方法(細(xì)胞分選儀等)并且使用針對光感受器前體細(xì)胞或光感受器的表面標(biāo)記物的抗體等進(jìn)行。此外，在完成培養(yǎng)后，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以分離自視網(wǎng)膜組織。此種分離可以通過本身已知的方法(細(xì)胞分選儀等)并且使用針對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的表面標(biāo)記物的抗體等進(jìn)行。備選地，通過使用，作為多能干細(xì)胞，其中標(biāo)記的基因(例如，熒光蛋白如GFP)已經(jīng)被敲入編碼光感受器前體細(xì)胞的標(biāo)記物(例如，Crx)或光感受器的標(biāo)記物(例如，恢復(fù)蛋白)或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)記物(Brn3)的基因的讀框中的細(xì)胞，各細(xì)胞可以通過本身已知的方法(細(xì)胞分選儀等)使用標(biāo)記基因的表達(dá)作為指示物來分離。
[0177]〈視網(wǎng)膜色素上皮的制備方法〉
[0178]本發(fā)明的第四方面是視網(wǎng)膜色素上皮的制備方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)(但是不含有作用于Sonic hedgehog信號途徑的物質(zhì))的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，對通過上述〈視網(wǎng)膜組織的制備方法 > 獲得的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。作為在上述〈視網(wǎng)膜組織的制備方法 > 中獲得的視網(wǎng)膜組織，可以使用包含上述〈視網(wǎng)膜組織的制備方法 > 的第三步中培養(yǎng)的視網(wǎng)膜組織的聚集體。作為第四發(fā)明的實施方案，可以提及包括以下步驟(1)至(4)的制備視網(wǎng)膜色素上皮的方法:
[0179](I)第一步，在含有抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的聚集體，[0180](2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中對第一步中形成的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，
[0181](3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中對第二步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，和
[0182](4)第四步，在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中(其中前述無血清培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)基不含作用于Sonic hedgehog信號途徑的物質(zhì))對第三步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0183]此處，作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的實例包括屬于Wnt家族的蛋白，Wnt受體，Wnt受體激動劑，GSK3 3抑制劑(例如，6-溴靛玉紅-3’ -月虧(BIO), CHIR99021, Kenpaullone)
坐寸ο
[0184]用于本發(fā)明的第四方面的作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的濃度為，例如，在常見的作用于fct信號途徑的物質(zhì)如CHIR99021的情況中，約0.1 μ M至100 μ M，優(yōu)選為約I μ M至30 μ Μ，更優(yōu)選為約3 μ Μ。
[0185]當(dāng)例如使用人ES細(xì)胞時，在第12天或之后、最優(yōu)選地在第15天添加作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)。在此情況中，優(yōu)選使用的是不含第一步中添加的抑制fct信號途徑的物質(zhì)和第三步中添加的作用于Shh信號途徑的物質(zhì)的培養(yǎng)基。
[0186]在本發(fā)明 的第四方面中，通過上述〈視網(wǎng)膜組織的制備方法 > 獲得的視網(wǎng)膜組織或含有視網(wǎng)膜組織的聚集體優(yōu)選地在各自含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)和作用于激活蛋白信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0187]作用于激活蛋白信號途徑的物質(zhì)不受特別限制，只要其可以增強(qiáng)由激活蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。作用于激活蛋白信號途徑的物質(zhì)的實例包括屬于激活蛋白家族的蛋白(例如，激活蛋白A，激活蛋白B，激活蛋白C，和激活蛋白AB等)，激活蛋白受體，激活蛋白受體激動劑等。
[0188]用于該步中的作用于激活蛋白信號途徑的物質(zhì)的濃度為，例如，在常見的作用于激活蛋白信號途徑的物質(zhì)如重組人/小鼠/大鼠激活蛋白A(R&D systems#338-AC)的情況中，lng/ml 至 10ug/ml,優(yōu)選為約 10ng/ml 至 lug/ml,更優(yōu)選為約 100ng/ml。
[0189]因為因此制備的視網(wǎng)膜色素上皮存在于聚集體的表面，所以其可以通過顯微鏡觀察等容易地觀察到。還可能的是，通過以下方式獲得高純度的視網(wǎng)膜色素上皮:對包含視網(wǎng)膜色素上皮的聚集體進(jìn)行例如分散處理(例如，胰蛋白酶/EDTA處理)之后FACS分選。還可能的是，利用鑷子等自聚集體物理地切去視網(wǎng)膜色素上皮，之后培養(yǎng)。在分散或切去后，視網(wǎng)膜色素上皮可以在粘附條件下培養(yǎng)。在粘附培養(yǎng)的情況中，優(yōu)選使用細(xì)胞粘附培養(yǎng)容器，例如，在用細(xì)胞外基質(zhì)等(例如，聚-D-賴氨酸，層粘連蛋白，纖連蛋白)包被處理后的培養(yǎng)容器。粘附培養(yǎng)的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、CO2濃度和O2濃度可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。在此情況中，所述培養(yǎng)可以在血清、已知的生長因子、促進(jìn)生長的添加劑和化學(xué)物質(zhì)的存在下進(jìn)行。已知的生長因子的實例包括EGF，F(xiàn)GF等。促進(jìn)生長的添加劑的實例包括 N2 添加物(Invitrogen), B27 添加物(Invitrogen)等。
[0190]<使用視網(wǎng)膜組織作為用于評估毒性或藥物效力的試劑>
[0191]通過本發(fā)明的第一至第四方面制備的視網(wǎng)膜組織，視杯樣結(jié)構(gòu)，視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮也可以用于篩選用于由視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞的紊亂所致的疾病的治療藥物，或用于細(xì)胞治療的移植材料，用于研究疾病的材料或用于由其他病因所致的細(xì)胞損傷的治療藥物的藥物開發(fā)材料。此外，它們在化學(xué)物質(zhì)等的毒性和藥物效力評估中可以用于毒性如光毒性的研究、測試等。
[0192]由視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞的紊亂所致的疾病的實例包括有機(jī)汞中毒，氯喹視網(wǎng)膜病(chloroquine retinopathy),色素性視網(wǎng)膜炎(retinitis pigmentosa),年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration),青光眼(glaucoma),糖尿病視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy)，新生兒視網(wǎng)膜病(neonatal retinopathy)等。
[0193]〈使用視網(wǎng)膜組織，視杯樣結(jié)構(gòu)，視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮作為用于移植的生物材料〉
[0194]通過本發(fā)明的第一至第四方面制備的視網(wǎng)膜組織，視杯樣結(jié)構(gòu)，視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮可以用作用于補(bǔ)充受損細(xì)胞或自身處于細(xì)胞損傷狀態(tài)的患病組織的移植(例如，用于移植操作)等的生物材料。移植方法的實例包括，但不限于，下述實施例中描述的方法。
[0195]以下通過參照比較例和實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明的制備方法。實施例僅顯示本發(fā)明的范例并且絕不限制本發(fā)明的范圍。
[0196]實施例
[0197](建立RAX敲入人ES細(xì)胞)
[0198]制備具有在 RAX基因座(其是視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的標(biāo)記物基因之一)處敲入的GFP的人ES細(xì)胞系。
[0199]特異性切割人ES細(xì)胞系(KhES-1:由Kyoto University建立的人ES細(xì)胞系)的基因組DNA上的RAX基因的鋅指核酸酶(ZFN)購買自Sigma-Aldrich C0.LLC0使用解離成單個細(xì)胞的人ES細(xì)胞并且根據(jù)電穿孔方法，共轉(zhuǎn)染編碼ZFN的mRNA和搭載GFP和新霉素-抗性基因(其是藥物選擇基因)的敲入載體，并且將其鋪平板于用絲裂霉素C處理的新霉素抗性小鼠成纖維細(xì)胞上。從鋪平板的第二天起，將G418加入到培養(yǎng)基中并且進(jìn)行藥物選擇。挑取獲得的抗性克隆的菌落，繼續(xù)培養(yǎng)，并且通過PCR法和DNA印跡法選擇敲入細(xì)胞，由此建立RAX::GFP敲入的人ES細(xì)胞系。
[0200]比較例1:通過使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜組織(Matrigel添加條件)
[0201]根據(jù)“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細(xì)胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的 DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen)。通過使用 0.25 %胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將 ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(100 μ I)中，37°C，5% CO2，直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9X 10~3個細(xì)胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITEC0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20 % KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸和20 μ M Υ27632獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。其后，定期地進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，同時繼續(xù)漂浮培養(yǎng)。
[0202]作為直至自開始漂浮培養(yǎng)起第25天的熒光顯微鏡觀察的結(jié)果，稍微發(fā)現(xiàn)表達(dá)GFP的細(xì)胞，其顯示視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞的誘導(dǎo)(圖1Α，B)。
[0203]比較例2:通過使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜組織(Nodal信號途徑抑制劑和Matrigel添加條件)
[0204]根據(jù)“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細(xì)胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網(wǎng)膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細(xì)胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20 % KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Y27632和抑制Nodal信號途徑的物質(zhì)(10yMSB431542)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起， 以每體積1/100的量加入Matrigel。其后，繼續(xù)漂浮培養(yǎng)并且在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過FACS進(jìn)行表達(dá)GFP的細(xì)胞的比例的熒光顯微鏡觀察和確認(rèn)。
[0205]結(jié)果，稍微發(fā)現(xiàn)表達(dá)GFP的細(xì)胞(圖1C，D)。
[0206]比較例3:通過使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜組織(Wnt信號途徑抑制劑和Matrigel添加條件)
[0207]根據(jù)“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細(xì)胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網(wǎng)膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)將ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細(xì)胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)(3μΜ IWRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。其后，繼續(xù)漂浮培養(yǎng)并且在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過FACS進(jìn)行表達(dá)GFP的細(xì)胞的比例的熒光顯微鏡觀察和確認(rèn)。
[0208]結(jié)果，與比較例I和2相比，表達(dá)GFP的細(xì)胞明顯增加(圖1Ε，F(xiàn))。
[0209]實施例1:通過使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜組織(Wnt信號途徑抑制劑和Matrigel、血清添加條件)
[0210]根據(jù)“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細(xì)胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網(wǎng)膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細(xì)胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)(3μΜ IWRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。此外,在自開始漂浮培養(yǎng)起第12天，以每體積1/10的量加入胎牛血清。其后，繼續(xù)漂浮培養(yǎng)并且在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過FACS進(jìn)行表達(dá)GFP的細(xì)胞的比例的熒光顯微鏡觀察和確認(rèn)。同時，還在不添加血清的比較例3的條件下進(jìn)行實驗。
[0211]雖然在比較例3的條件下表達(dá)GFP的細(xì)胞的比例為3.2% (圖2A，B，圖3A)，但是在添加血清的條件下出現(xiàn)了很多表達(dá)GFP的細(xì)胞(圖2C，D)。在通過FACS的分析中，GFP陽性細(xì)胞的比例超過30% (圖3B)。
[0212]實施例2:通過使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜組織(添加Wnt信號途徑抑制劑和Matrigel、血清和作用于Shh信號的物質(zhì)的條件)
[0213]根據(jù)“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細(xì)胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網(wǎng)膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)將ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細(xì)胞(SUMIL0N球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)(3μΜ IWRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。在自開始漂浮培養(yǎng)起第12天,加入胎牛血清(以每體積1/10的量)和作用于Shh信號途徑的物質(zhì)(IOOnM SAG)。在自開始漂浮培養(yǎng)起第18天通過FACS測量表達(dá)GFP的細(xì)胞的比例。
[0214]當(dāng)作用于Shh信號 途徑的物質(zhì)與血清同時添加時，出現(xiàn)非常多數(shù)目的表達(dá)GFP的細(xì)胞(圖2E，F(xiàn))。由使用FACS的分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)GFP的細(xì)胞的比例達(dá)到不少于70%。
[0215]發(fā)現(xiàn)，與比較例3相比，在添加血清的實施例1的條件下表達(dá)GFP的細(xì)胞的比例增加至約10倍，并且進(jìn)一步，在同時添加血清和作用于Shh信號途徑的物質(zhì)的實施例2的條件下，表達(dá)GFP的細(xì)胞的比例增加至約24倍(圖3D)。
[0216]實施例3:確認(rèn)視網(wǎng)膜組織形成
[0217](方法)
[0218]利用實施例2和3中制備的具有表達(dá)GFP的細(xì)胞的聚集體來確認(rèn)視網(wǎng)膜組織的形成。使用通過向DMEM/F12培養(yǎng)基添加N2添加物，10% (v/v)胎牛血清和0.5 μ M視黃酸獲得的含血清的培養(yǎng)基，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第18天起在40% O2的條件下進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。其后，利用4%多聚甲醛溶液固定聚集體，制備冷凍切片，并且通過免疫染色方法確認(rèn)組織結(jié)構(gòu)。
[0219]結(jié)果，在自開始漂浮培養(yǎng)起第60天，發(fā)現(xiàn)在最底層中的Brn3和TuJl陽性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，在最外層和中間層中的Crx和恢復(fù)蛋白陽性的光感受器-前體細(xì)胞，以及在最外層中的Brn3陽性細(xì)胞和在最內(nèi)層中的Brn3陽性細(xì)胞之間的中間神經(jīng)元先祖細(xì)胞如ChxlO陽性的雙極細(xì)胞以有序的方式布置成層(圖4A，B, C)。此外，當(dāng)繼續(xù)漂浮培養(yǎng)直至第126天時，Crx和恢復(fù)蛋白陽性的光感受器-前體細(xì)胞積累在最外層中，并且觀察到表達(dá)在視桿細(xì)胞中特異表達(dá)的Nrl的細(xì)胞和表達(dá)在視錐細(xì)胞中特異表達(dá)的Rxr-Y的細(xì)胞。此外，在中間層中觀察到表達(dá)水平細(xì)胞和無長突細(xì)胞的前體細(xì)胞標(biāo)記物Ptfla的細(xì)胞(圖4D，E，F(xiàn)，G，H，I)。由這些結(jié)果，證明可以由人ES細(xì)胞高效地制備視網(wǎng)膜組織。
[0220]實施例4:將由人ES細(xì)胞制備的視網(wǎng)膜組織移植到眼中
[0221]在切開眼球的鞏膜后，將注射針從鞏膜切口插入到玻璃體中以降低眼內(nèi)壓。利用細(xì)胞移植針將眼內(nèi)灌注液從鞏膜切口注射到視網(wǎng)膜下空間，以人工地形成淺的視網(wǎng)膜脫離狀態(tài)。利用細(xì)胞移植針或細(xì)胞片移植設(shè)備將視網(wǎng)膜組織移植到形成的空間中。
[0222]實施例5:使用人ES細(xì)胞高效地制備視杯樣結(jié)構(gòu)
[0223](方法)
[0224]使用RAX::GFP敲入人ES細(xì)胞，制備視杯樣結(jié)構(gòu)。
[0225]根據(jù)“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細(xì)胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)形成聚集體，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (InvitiOgen)將ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其懸浮在無血清培養(yǎng)基(100 μ I)中直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細(xì)胞(SUMILON球形板，SUMITOMOBAKELITE C0.，LTD.)，以允許快速形成聚集體，并且進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，37°C ,5% C02。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)(3 μ M IffRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始 漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。在自開始漂浮培養(yǎng)起第12天，將漂浮的聚集體轉(zhuǎn)移到不含抑制fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中，以每體積1/10的量加入胎牛血清并且培養(yǎng)聚集體。此外，從第15天起，在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)(3yMCHIR99021)和作用于Shh信號途徑的物質(zhì)(IOOnMSAG)的含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0226](結(jié)果)
[0227]當(dāng)通過上述方法制備時，在自開始漂浮培養(yǎng)起第14天左右在部分的聚集體中出現(xiàn)顯示RAX表達(dá)的GFP陽性的細(xì)胞群體(圖5A)，其之后向聚集體的外側(cè)凸起(圖5B，C)。當(dāng)繼續(xù)漂浮培養(yǎng)時，形成明顯的突起(圖OT)。此外，當(dāng)繼續(xù)漂浮培養(yǎng)時，在由GFP陽性細(xì)胞(視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞)組成的聚集體上形成明顯的視杯樣結(jié)構(gòu)(圖6)。簡單地通過顯微鏡觀察聚集體可以清楚地識別此視杯樣結(jié)構(gòu)(圖6A)。當(dāng)通過雙光子顯微鏡深入地觀察形成在聚集體上的視杯樣結(jié)構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)其具有外部和內(nèi)部的兩層結(jié)構(gòu)(圖6C，D)。制備視杯樣結(jié)構(gòu)的冷凍切片并進(jìn)行免疫染色。結(jié)果，表達(dá)Mitf的視網(wǎng)膜色素上皮的層存在于外部，而ChxlO陽性的神經(jīng)視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞存在于其內(nèi)部(圖7)。
[0228]實施例6:將由人ES細(xì)胞制備的視杯樣結(jié)構(gòu)移植到眼中
[0229]在切開眼球的鞏膜后，將注射針從鞏膜切口插入到玻璃體中以降低眼內(nèi)壓。利用細(xì)胞移植針將眼內(nèi)灌注液從鞏膜切口注射到視網(wǎng)膜下空間，以人工地形成淺的視網(wǎng)膜脫離狀態(tài)。利用細(xì)胞移植針或細(xì)胞片移植設(shè)備將培養(yǎng)的視杯樣結(jié)構(gòu)移植到形成的空間中。
[0230]實施例7:利用作用于Notch信號的物質(zhì)處理人ES細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜組織
[0231]根據(jù)“Ueno，M.等PNAS2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech2007”中所述的方法培養(yǎng)CrX::GFP敲入人ES細(xì)胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的 DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen)。通過使用 0.25 %胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將 ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(100μ I)中，37°C，5% CO2，直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9X 10~3個細(xì)胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITEC0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20 % KSR、
0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)(3 μ M IffRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。從漂浮培養(yǎng)的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel并且進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。在漂浮培養(yǎng)的第12天，加入胎牛血清(以每體積1/10的量)和作用于Shh信號途徑的物質(zhì)(IOOnMSAG)并進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以制備視網(wǎng)膜組織。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第29天向視網(wǎng)膜組織加入作用于Notch信號的物質(zhì)(10 μ M DAPT( Y分泌酶活性抑制劑))，在自開始漂浮培養(yǎng)起的第41天(添加后的第12天)利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，并且在自開始漂浮培養(yǎng)起的第43天(添加后的第14天)利用4%多聚甲醛固定，并且制備冷凍切片。對制備的冷凍切片進(jìn)行針對恢復(fù)蛋白(其是光感受器的標(biāo)記物基因之一)和Brn3(其是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)記物基因之一)的免疫染色，并且比較添加和不添加DAPT的情況之間的結(jié)果。
[0232]結(jié)果，與不添加DAPT時(圖8A)相比，在添加DAPT時(圖8B)，表達(dá)GFP的細(xì)胞顯著增加。此外，由冷凍切片的免疫染色的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加DAPT時，恢復(fù)蛋白陽性的細(xì)胞增加3至5倍(圖8C，D)。
[0233]這些結(jié)果顯示光感受器的顯著增加。此外，由Brn3的免疫染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過添加DAPT，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞也增加(圖8E，F(xiàn))。
[0234]實施例8:在凍融后用作用于Notch信號的物質(zhì)處理人ES細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜組織
[0235]根據(jù)“Ueno，M.等PNAS 2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech 2007” 中所述的方法培養(yǎng)RAX::GFP敲入人ES細(xì)胞(來源于KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20%KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)。為了通過漂浮培養(yǎng)制備視網(wǎng)膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)將ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其漂浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基(IOOyl)中，37°C，5% CO2，直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細(xì)胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE C0.，LTD.)。在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2-巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)(3 μ M IWRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起使用添加有Matrigel (以每體積1/100的量)的無血清培養(yǎng)基。自漂浮培養(yǎng)的第2天起以每體積1/100的量添加Matrigel并且進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第12天添加胎牛血清(以每體積1/10的量)和作用于Shh信號途徑的物質(zhì)(IOOnM SAG)并且進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以制備視網(wǎng)膜組織。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第33天凍融制備的視網(wǎng)膜組織，并且在自開始漂浮培養(yǎng)起的第38天向視網(wǎng)膜組織添加Notch信號作用抑制物質(zhì)(10 μ M DAPT)。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第49天(添加后的第11天)利用熒光顯微鏡觀察所述組織，并且利用4%多聚甲醛固定，并且制備冷凍切片。對制備的冷凍切片進(jìn)行針對恢復(fù)蛋白(其是光感受器的標(biāo)記物基因之一)和Brn3(其是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)記物基因之一)的免疫染色，并且比較添加和不添加DAPT的情況之間的結(jié)果。
[0236]結(jié)果，與不添加DAPT時(圖9A)相比，在添加DAPT時(圖9B)，顯著地產(chǎn)生表達(dá)GFP的細(xì)胞。此外，由冷凍切片的免疫染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加DAPT時，產(chǎn)生約5倍的恢復(fù)蛋白陽性的細(xì)胞(圖9C，D)。這些結(jié)果顯示光感受器的明顯產(chǎn)生。此外，由Brn3的免疫染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過添加DAPT，還產(chǎn)生神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(圖9E，F(xiàn))。
[0237]實施例9:將由人ES細(xì)胞制備的視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞移植到眼中
[0238]在切開眼球的鞏膜后，將注射針從鞏膜切口插入到玻璃體中以降低眼內(nèi)壓。利用細(xì)胞移植針將眼內(nèi)灌注液從鞏膜切口注射到視網(wǎng)膜下空間，以人工地形成淺的視網(wǎng)膜脫離狀態(tài)。利用細(xì)胞移植針或細(xì)胞片移植設(shè)備將視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞移植到形成的空間中。
[0239]實施例10:使用人ES細(xì)胞高效地制備視網(wǎng)膜色素上皮
[0240](方法)
[0241]根據(jù)“Ueno，M.等 PNAS 2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech 2007” 中所述的方法培養(yǎng)人ES細(xì)胞(KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20% KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2-疏基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(InvitiOgen)。為了通過漂浮培養(yǎng)形成視網(wǎng)膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (InvitiOgen)將ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其懸浮在無血清培養(yǎng)基(100 μ I)中直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細(xì)胞(SUMILON球形板，SUMITOMOBAKELITE C0.，LTD.)，以允許快速形成聚集體，并且進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，37°C ,5% CO20在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)(3 μ M IffRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。從漂浮培養(yǎng)的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel并進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第12天， 將聚集體轉(zhuǎn)移到不含抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中，以每體積1/10的量加入胎牛血清并培養(yǎng)。從第15天起，在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)(3 μ MCHIR99021)的培養(yǎng)基中進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0242](結(jié)果)
[0243]當(dāng)通過上述方法制備時，視網(wǎng)膜色素上皮群體出現(xiàn)在聚集體的幾乎全部表面上(圖 10)。
[0244]實施例11:使用人ES細(xì)胞制備視網(wǎng)膜色素上皮
[0245](方法)
[0246]根據(jù)“Ueno, Μ.等 PNAS 2006”、“Watanabe, K.等 Nat Biotech 2007” 中所述的方法培養(yǎng)人ES細(xì)胞(KhES-1)并用于實驗。作為培養(yǎng)基，使用添加有20% KSR(敲除血清置換物；Invitrogen)、0.lmM2-疏基乙醇、ImM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基(InvitiOgen)。為了通過漂浮培養(yǎng)形成視網(wǎng)膜組織，通過使用0.25%胰蛋白酶-EDTA (InvitiOgen)將ES細(xì)胞分散為單個細(xì)胞，并且將其懸浮在無血清培養(yǎng)基(100 μ I)中直至每個非細(xì)胞粘附性96孔培養(yǎng)板的孔9Χ10~3個細(xì)胞(SUMILON球形板，SUMIT0M0BAKELITE C0.，LTD.)，以允許快速形成聚集體，并且進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，37°C ,5% CO20在此情況中，作為無血清培養(yǎng)基，使用通過向G-MEM培養(yǎng)基添加20% KSR、0.lmM2_巰基乙醇、ImM丙酮酸、20 μ M Υ27632和抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)(3 μ M IffRle)獲得的無血清培養(yǎng)基。在漂浮培養(yǎng)期間，從自開始漂浮培養(yǎng)起的第2天起，以每體積1/100的量加入Matrigel。在自開始漂浮培養(yǎng)起的第12天，將聚集體轉(zhuǎn)移到不含抑制Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中，以每體積1/10的量加入胎牛血清并培養(yǎng)。從第15天起，在含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)(3yMCHIR99021)和作用于激活蛋白信號途徑的物質(zhì)(重組人/小鼠/大鼠激活蛋白A(R&D systems#338-AC) 100ng/ml)的培養(yǎng)基中進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
[0247](結(jié)果)
[0248]當(dāng)通過上述方法制備時，呈現(xiàn)黑色的視網(wǎng)膜色素上皮出現(xiàn)在幾乎所有聚集體的表面上。此外，幾乎所有聚集體的表面覆蓋有視網(wǎng)膜色素上皮(圖11)，并且以驚人地高的效率產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素上皮。
[0249]實施例12:將由人ES細(xì)胞制備的視網(wǎng)膜色素上皮移植到眼中
[0250]在切開眼球的鞏膜后，將注射針從鞏膜切口插入到玻璃體中以降低眼內(nèi)壓。利用細(xì)胞移植針將眼內(nèi)灌注液從鞏膜切口注射到視網(wǎng)膜下空間，以人工地形成淺的視網(wǎng)膜脫離狀態(tài)。利用細(xì)胞移植針或細(xì)胞片移植設(shè)備將視網(wǎng)膜色素上皮移植到形成的空間中。
[0251]工業(yè)實用性
[0252]根據(jù)本發(fā)明，可以高效地制備視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮。本發(fā)明的制備方法非常有用，因為其有效地制備構(gòu)成視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞群(如光感受器和視神經(jīng))，以用于化學(xué)物質(zhì)等的毒性或藥物效力評估、細(xì)胞治療等，并且有效地制備作為“組織材料”的視網(wǎng)膜組織，其用于以下應(yīng)用目的的測試和處理:使用具有一定組織結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜組織的毒性或藥物效力評估，和用于視網(wǎng)膜組織移植治療的移植材料。 [0253]本申請是基于在日本提交的專利申請?zhí)?011-258209,2011-258210，2011-258211，2011-258212，2012-043080，2012-043081，2012-043082 和 2012-043083，這
些申請的內(nèi)容完整地結(jié)合于此。
【權(quán)利要求】
1.制備視網(wǎng)膜組織的方法，所述方法包括以下步驟(1)至(3): (1)第一步，在含有抑制fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成多能干細(xì)胞的聚集體， (2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將所述第一步中形成的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，和 (3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將所述第二步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
2.制備視杯樣結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于Sonichedgehog信號途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，將通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法獲得的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
3.制備視網(wǎng)膜色素上皮的方法，所述方法包括以下步驟:在各自含有作用于fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中(其中所述無血清培養(yǎng)基和含血清的培養(yǎng)基不含作用于Sonic hedgehog信號途徑的物質(zhì))，將通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法獲得的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行漂浮培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述含有作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基還包含作用于激活蛋白信號途徑的物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是靈長類多能干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是人多能干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述基膜制備物是至少一種選自由以下組成的組的細(xì)胞外基質(zhì)分子:層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述第一步至所述第三步在敲除血清置換物存在下進(jìn)行。
9.制備視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括:使包含在來源于靈長類多能干細(xì)胞的視網(wǎng)膜組織中的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞接觸抑制Notch信號途徑的物質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述抑制Notch信號途徑的物質(zhì)是Y分泌酶活性抑制物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述抑制Notch信號途徑的物質(zhì)是N-[N-(3, 5- 二氟苯乙酰基)-L_丙氨?；鵠-S_苯基甘氨酸叔丁酯。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項所述的方法，其中所述靈長類是人。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞是光感受器。
14.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求9至14中任一項所述的方法，其中所述包含在來源于靈長類多能干細(xì)胞的視網(wǎng)膜組織中的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞是包含在通過以下步驟制備的視網(wǎng)膜組織中的視網(wǎng)膜先祖細(xì)胞: (I)第一步，在含有抑制fct信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中將靈長類多能干細(xì)胞進(jìn)行漂浮培養(yǎng)以形成靈長類多能干細(xì)胞的聚集體，(2)第二步，在含有基膜制備物的無血清培養(yǎng)基中將在所述第一步中形成的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)， (3)第三步，在含血清的培養(yǎng)基中將在所述第二步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)， (4)第四步，在各自含有作用于Sonichedgehog信號途徑的物質(zhì)和作用于Wnt信號途徑的物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中，將所述第三步中培養(yǎng)的聚集體進(jìn)行漂浮培養(yǎng)，以形成視杯樣結(jié)構(gòu)，和 (5)對第四步中形成的視杯樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行漂浮培養(yǎng)的步驟。
16.用于評估毒性或藥物效力的試劑，所述試劑包含通過根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮、或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞。
17.用于評估測試物質(zhì)的毒性或藥物效力的方法，所述方法包括:使通過根據(jù)權(quán)利要求I至15中任一項所述的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮、或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞接觸所述測試物質(zhì)，并且檢查所述物質(zhì)對所述組織、結(jié)構(gòu)或細(xì)胞的影響。
18.用于由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病的治療劑，所述治療劑包含通過根據(jù)權(quán)利要求I至15中任一項所述的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮、或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞。
19.用于治療由 視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病的方法，所述方法包括:移植有效量的通過根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮、或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞至需要所述移植的靶標(biāo)。
20.通過根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法制備的視網(wǎng)膜組織、視杯樣結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜色素上皮、或視網(wǎng)膜層特異性神經(jīng)細(xì)胞，其用于治療由視網(wǎng)膜組織的紊亂所致的疾病。
【文檔編號】G01N33/50GK103998599SQ201280060865
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月25日
【發(fā)明者】中野德重, 安藤覺, 笹井芳樹, 永樂元次 申請人:住友化學(xué)株式會社, 獨立行政法人理化學(xué)研究所