一種檢測瘦肉精的檢測試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種檢測瘦肉精的檢測試劑，能夠單獨(dú)或同時(shí)檢測鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和萊克巴多胺。本發(fā)明的檢測試劑包含有包被在載體上的，用于檢測鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和萊克巴多胺中的任一種或幾種的特異性抗體和抗原；用于顯色反應(yīng)的試劑，所述的顯色反應(yīng)的試劑為染色的且用上述的特異性抗體致敏的金黃色葡萄球菌。本發(fā)明所制備的試劑特異性強(qiáng)，降低了假陽性出現(xiàn)的幾率；制備成本低廉，操作極為簡便，縮短了工時(shí)；易于推廣，適于普查；與協(xié)同凝集試驗(yàn)所用試劑相比，更適于抗原或抗體的檢測，速度快，靈敏度高，可以檢測到0.1ppb的鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺，其結(jié)果易于觀察，且可以長期保存。
【專利說明】-種檢測瘦肉精的檢測試劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于目-受體激動(dòng)劑檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測瘦肉精的檢測試劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 瘦肉精是一類動(dòng)物用藥的統(tǒng)稱，有數(shù)種藥物被稱為瘦肉精，例如鹽酸克倫特羅、沙 下胺醇和萊克多己胺，上述H種藥物是一類選擇性目2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有調(diào)節(jié)動(dòng) 物神經(jīng)興奮及其體內(nèi)營養(yǎng)素重分配的功能，可W提高瘦肉率，減少脂肪沉積和促進(jìn)動(dòng)物生 長。瘦肉精化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，加熱至172C時(shí)才分解，一般方法不能將其破壞，腸道吸收快，作 用時(shí)間持久，藥理作用強(qiáng)。動(dòng)物食用了瘦肉精后，初期會(huì)采食下降、行為動(dòng)作失調(diào)、神經(jīng)緊張 不安甚至全身震顫、呼吸加劇、體溫上升，長期食用直接損傷肉畜的機(jī)體。人食用了飼喂含 目-受體激動(dòng)劑作為飼料添加劑的產(chǎn)品后，就會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀，通常會(huì)出現(xiàn)肌肉震顫、也棒、 精神緊張、頭疼、肌肉疼痛、胺暈、惡也、嘔吐、發(fā)燒、戰(zhàn)栗等癥狀，甚至死亡，給患者的精神、 健康及正常生活造成了嚴(yán)重危害。因此，世界上許多國家禁止在飼料中使用瘦肉精來提高 動(dòng)物的瘦肉率，我國也于1997年發(fā)文禁止瘦肉精在飼料和畜牧生產(chǎn)中使用，商務(wù)部自2009 年12月9日起，禁止進(jìn)出口萊克多己胺和鹽酸萊克多己胺。2001年12月27日、2002年2 月9日、4月9日，農(nóng)業(yè)部分別下發(fā)文件禁止食品動(dòng)物禁止使用目激動(dòng)劑類藥物作為飼料添 加劑（農(nóng)業(yè)部176號(hào)、193號(hào)公告、1519號(hào)條例），并且通過相關(guān)政策手段對相關(guān)領(lǐng)域進(jìn)行監(jiān) 督管理，而且，對于畜禽產(chǎn)品要進(jìn)行瘦肉精含量的檢測。
[0003] 目前對鹽酸克倫特羅、沙下胺醇及萊克多己胺等瘦肉精的檢測方法主要有沉淀反 應(yīng)、凝集反應(yīng)、補(bǔ)體參與抗原抗體反應(yīng)、中和反應(yīng)、標(biāo)記免疫反應(yīng)等，與之相對應(yīng)有酶免疫檢 測試劑盒，也有單獨(dú)檢測鹽酸克倫特羅、沙下胺醇及萊克多己胺的檢測試紙條和同時(shí)檢測 W上H種瘦肉精的膠體金法，但該些檢測方法主要依懶化學(xué)儀器分析，要么要求有復(fù)雜的 儀器設(shè)備和繁瑣的操作過程，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查，要么就是檢測時(shí)間較長、 對操作人員專業(yè)要求高，或是檢測成本高、假陽性現(xiàn)象比較多，或是靈敏度不夠高。由此衍 生的檢測試劑也同樣存在制備成本高、不適于推廣應(yīng)用、結(jié)果判斷不直觀等特點(diǎn)，所W，目 前急需一種操作簡便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、靈敏、適合臨床推廣的檢測方法和試劑來檢測抗原和抗 體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測瘦肉精的檢測試劑，能夠單獨(dú)或同時(shí)檢測抗鹽酸 克倫特羅抗體、抗沙下胺醇抗體和抗萊克己多胺抗體。本發(fā)明制備的試劑具有特異性強(qiáng)、敏 感性高、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005] 本發(fā)明的檢測試劑包含有包被在載體上的，用于檢測鹽酸克倫特羅、沙下胺醇和 萊克己多胺中的任一種或幾種的特異性抗體；用于顯色反應(yīng)的試劑，所述的顯色反應(yīng)的試 劑為染色的且用上述的特異性抗體致敏的金黃色葡萄球菌。
[0006] 作為實(shí)施例的優(yōu)選，所述的特異性抗體為鹽酸克倫特羅、沙下胺醇或萊克多己胺 免疫家兔后制備的效價(jià)達(dá)到1:800或W上的兔子血清；
[0007] 作為實(shí)施例的優(yōu)選，上述的載體為NC膜或化ISA板。
[0008] 作為實(shí)施例的一種優(yōu)選，所述的金黃色葡萄球菌用石碳酸復(fù)紅染料進(jìn)行了染色；
[0009] 所述金黃色葡萄球菌的致敏是將染色后的金黃色葡萄球菌用抗鹽酸克倫特羅、沙 下胺醇或萊克多己胺抗體中的任一種或幾種致敏的。
[0010] 上述的試劑，還包含有用作陽性對照的陽性血清和/或作為陰性對照的陰性血 清；
[0011] 作為實(shí)施例的優(yōu)選，所述的陽性血清，是將鹽酸克倫特羅、沙下胺醇和萊克多己胺 免疫家兔后制備的效價(jià)達(dá)到1:800或W上的兔子血清；
[0012] 所述的瘦肉精陰性血清，是抗鹽酸克倫特羅、抗沙下胺醇和抗萊克多己胺抗體的 效價(jià)低于1:1的動(dòng)物血清。
[0013] 上述的測試劑還包含有包被在載體上的、用于檢測抗鹽酸克倫特羅抗體、抗沙下 胺醇抗體和抗萊克己多胺抗體中的任一種或幾種的瘦肉精抗原；
[0014] 本發(fā)明所制備的試劑特異性強(qiáng)，降低了假陽性出現(xiàn)的幾率；制備成本低廉，操作極 為簡便，縮短了工時(shí)；易于推廣，適于普查；與協(xié)同凝集試驗(yàn)所用試劑相比，更適于抗原或 抗體的檢測，速度快，靈敏度高，可W檢測到0. Ippb的鹽酸克倫特羅、沙下胺醇和萊克多己 胺，其結(jié)果易于觀察，且可W長期保存，該對于快速判斷被檢樣本中是否含有特異性抗原或 抗體具有重要診斷價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[001引圖1 ;本發(fā)明檢測抗原原理圖
[0016] 圖2 ;本發(fā)明檢測抗體原理圖
[0017] 圖3 ;本發(fā)明線性包被示意圖，其中T1、T2及"……"表示包被的特異性抗體（或 抗原）PC表示陽性對照，NC表示陰性對照。圖中特異性抗體（或抗原）的包被是線性包被。
[0018] 圖4 ;本發(fā)明點(diǎn)狀包被示意圖，其中T1、T2及"……"表示包被的特異性抗體（或 抗原）PC表示陽性對照，NC表示陰性對照。圖中特異性抗體（或抗原）的包被是點(diǎn)狀包被。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 金黃色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA)是存在于細(xì)菌細(xì)胞壁的 一種表面蛋白。SPA是一種單鏈多膚，與胞壁膚聚糖呈共價(jià)結(jié)合。目前，SPA應(yīng)用最多的是 用于協(xié)同凝集試驗(yàn)，但協(xié)同凝集試驗(yàn)在檢測抗原或抗體存在諸多的不足，如沒有固定的結(jié) 合點(diǎn)，結(jié)果不易于觀察且不能長期保存，適于檢測的抗原大多為顆粒性抗原，檢測可溶性抗 原時(shí)易產(chǎn)生假陽性，所W，也不能作為抗原或抗體檢測的最為理想的方法，因此，該方法所 用試劑也不是最理想的試劑。但 申請人:發(fā)現(xiàn)將SPA與抗體結(jié)合作為顯色試劑，能夠明顯提 高檢測靈敏度，從而促成了本發(fā)明。
[0020] 本發(fā)明分別用鹽酸克倫特羅、沙下胺醇和萊克多己胺單獨(dú)或同時(shí)免疫健康家兔， 從而獲得抗鹽酸克倫特羅抗體、抗沙下胺醇抗體、抗萊克多己胺抗體、抗瘦肉精陽性血清； 采集健康家兔血清測定效價(jià)制備陰性血清；用染料對SPA菌液進(jìn)行染色獲得染色的SPA菌 液，由抗鹽酸克倫特羅抗體、抗沙下胺醇抗體和抗萊克多己胺抗體致敏的染色的SPA菌液。
[0021] 本發(fā)明中所用的組分的制備方法如下：
[0022] 1)制備抗鹽酸克倫特羅抗體、抗沙下胺醇抗體和抗萊克多己胺抗體、抗瘦肉精陽 性血清和陰性血清，備用；
[0023] 所述抗鹽酸克倫特羅抗體的制備步驟為；將鹽酸克倫特羅與弗氏完全佐劑按照 10:1?15:1的比例混合，置37C搖床振搖3天，之后放室溫或4C靜止1天后W皮下注射 和靜脈注射的方式免疫健康家兔，共免疫4次，每次間隔7?10天，第4次免疫5天后耳靜 脈采血測定抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1:800 W上時(shí)，即可自也臟放血，收集血清，即制得抗鹽酸 克倫特羅抗體。
[0024] 所述抗沙下胺醇抗體的制備步驟為：將沙下胺醇與佐劑按照10:1?15:1的比例 混合，置37C搖床振搖3天，之后放室溫或4C靜止1天后W皮下注射和靜脈注射的方式免 疫健康家兔，共免疫4次，每次間隔7?10天，第4次免疫5天后耳靜脈采血測定抗體效價(jià)， 效價(jià)達(dá)到1:800 W上時(shí)，即可自也臟放血，收集血清，即制得抗沙下胺醇抗體。
[00巧]所述抗萊克多己胺抗體的制備步驟為；將萊克多己胺與佐劑按照10:1?15:1的 比例混合，置37C搖床振搖3天，之后放室溫或4C靜止1天后W皮下注射和靜脈注射的方 式免疫健康家兔，共免疫4次，每次間隔7?10天，第4次免疫5天后耳靜脈采血測定抗體 效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1:800 W上時(shí)，即可自也臟放血，收集血清，即制得抗萊克多己胺抗體。
[0026] 2)將抗鹽酸克倫特羅抗體（或抗原）、抗沙下胺醇抗體（或抗原）和抗萊克多己 胺抗體（或抗原）、陽性血清（或抗原）、陰性血清（檢測抗體時(shí)為PBS緩沖液）和空白對 照包被在NC膜（或化ISA板）上，進(jìn)行封閉備用，其中陽性血清（或抗原）即為陽性對照， 陰性血清（檢測抗體時(shí)為PBS緩沖液）即為陰性對照；
[0027] 所述抗瘦肉精陽性血清的制備步驟為：將鹽酸克倫特羅、沙下胺醇和萊克多己胺 分別與佐劑按照10:1?15:1的比例混合，置37C搖床振搖3天，之后放室溫或4C靜止1 天后同時(shí)W皮下注射和靜脈注射的方式免疫健康家兔，共免疫4次，每次間隔7?10天，第 4次免疫5天后耳靜脈采血測定抗鹽酸克倫特羅、抗沙下胺醇和抗萊克多己胺抗體效價(jià)，效 價(jià)達(dá)到1:800 W上時(shí)，即可自也臟放血，收集血清，即制得抗瘦肉精陽性血清。
[0028] 所述抗瘦肉精陰性血清的制備步驟為；采集健康動(dòng)物血清測定抗鹽酸克倫特羅、 抗沙下胺醇和抗萊克多己胺抗體的效價(jià)，效價(jià)低于1:1時(shí)，收集血清即為抗瘦肉精陰性血 清。
[0029] 所述制備抗體和陽性血清過程中對免疫動(dòng)物進(jìn)行的靜脈注射和皮下注射，其注 射步驟是：第一次靜脈注射0. 1ml，皮下注射0. Iml ;10天后進(jìn)行第二次免疫，靜脈注射 0.2ml，皮下注射0. Iml ;7天后進(jìn)行第H次免疫，靜脈注射0.5ml，皮下注射0. Iml ;7天后進(jìn) 行第四次免疫，靜脈注射1. Oml,皮下注射0. 3ml ;5天后耳靜脈采血，收集血清，測定效價(jià)， 當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1 ;800 W上時(shí)，即可也臟放血，收集血清，作為特異性抗體（或陽性血清）。
[0030] 3)將SPA進(jìn)行染色，并用抗鹽酸克倫特羅抗體、抗沙了胺醇抗體和抗萊克多己胺 抗體致敏，即得致敏的SPA混合液；
[0031] 所述致敏SPA混合液的制備步驟如下：
[0032] USPA的染色：于金黃色葡萄球菌Cowan 1株菌液中滴加染液，搖晃混勻，放置15 分鐘?20分鐘，200化pm離也10分鐘后加入PBS緩沖液化01M，抑值7. 4)沖洗（此步驟 重復(fù)，直至無顏色脫落為止），加PBS緩沖液恢復(fù)至原體積，即可得到染色的SPA菌液。
[0033] 2、SPA的致敏：將染色后SPA菌液內(nèi)加入同等體積的特異性抗體，混勻，37°C溫箱 放置30分鐘，300化pm離也15分鐘，棄上清，沉淀物再用PBS緩沖液化01M，抑值7. 4)沖 洗兩次，制成5%的息液，即為所需的致敏SPA混合液。
[0034] 所述鹽酸克倫特羅抗體（或抗原）、沙下胺醇抗體（或抗原）、萊克多己胺抗體（或 抗原）及抗瘦肉精陽性血清和陰性血清的包被與封閉步驟如下：
[00巧]將上述抗體（或抗原）按照Img/L的濃度包被在NC膜（或化ISA板）上，然后 3% BAS封閉，4°C過夜，備用。
[0036] 所述0. OlM的PBS緩沖液的制備步驟如下：
[0037] 稱取化2冊〇42. 2g，NaH2P〇4〇. 3g，化Cl 8. 5g，調(diào)節(jié)溶液的抑值至7. 4,最后加水定 容IOOOml, 121. 3°C滅菌30分鐘，保存于4°C冰箱中備用。
[0038] 如果所述包被的載體為NC膜，則其反應(yīng)體系的組裝與切割步驟如下（包被載體為 ELISA板時(shí)省略該步驟）：
[0039] a)將帶有鹽酸克倫特羅抗體（或抗原）、沙下胺醇抗體（或抗原）、萊克多己胺抗 體（或抗原）及抗瘦肉精陽性血清和陰性血清的硝酸纖維素膜黏貼到用于支撐整個(gè)反應(yīng)體 系的PVC板中部。
[0040] b)將吸水紙黏貼在PVC板兩端。
[0041] C)用切紙刀將PVC板按照要求切割成檢測板。
[0042] 本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例參見附圖進(jìn)一步說明如下：
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 檢測對象為動(dòng)物尿液中的瘦肉精，屬于抗原檢測，具體操作步驟如下：
[0045] 將鹽酸克倫特羅（一種瘦肉精）標(biāo)準(zhǔn)品（lOOug/ml)做1:2、1:20、1:200、1:2000、 1:10000、1:20000倍稀釋，分別用膠體金法和本發(fā)明的SPA法同時(shí)對稀釋好的鹽酸克倫特 羅標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液進(jìn)行檢測。
[004引（一）本發(fā)明的SPA法檢測方法如下：
[0047] 制備抗鹽酸克羅抗體；將鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品與弗氏完全佐劑按10:1的比例進(jìn) 行混合，置37C搖床振搖3天，放室溫靜止1天，之后，W皮下注射和靜脈注射的方式免疫健 康家兔，共免疫4次，第一次靜脈注射0. 1ml，皮下注射0. Iml ; 10天后進(jìn)行第二次免疫，靜 脈注射0. 2ml，皮下注射0. Iml ; 7天后進(jìn)行第H次免疫，靜脈注射0. 5ml，皮下注射0. Iml ;7 天后進(jìn)行第四次免疫，靜脈注射1. Oml,皮下注射0. 3ml ;5天后耳靜脈采血，收集血清，測定 效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1 ;800 W上時(shí)，即可也臟放血，收集血清，作為抗鹽酸克羅抗體（陽性 血清）。
[0048] 制備鹽酸克倫特羅陰性血清；采集健康動(dòng)物血清測定效價(jià)，效價(jià)低于1:1時(shí)，收集 血清即為抗鹽酸克倫特羅的陰性血清。
[0049] SPA的染色：于金黃色葡萄球菌Cowan 1株菌液中滴加1%染液，搖晃混勻，室溫放 置20分鐘，200化pm離也15分鐘后加入PBS緩沖液化01M，抑值7.4)沖洗（此步驟重復(fù)， 直至無顏色脫落為止），加PBS緩沖液恢復(fù)至原體積，即可得到染色的SPA菌液。
[0050] SPA的致敏：將染色后SPA菌液內(nèi)加入同等體積的抗鹽酸克羅抗體，混勻，37C溫 箱放置30分鐘，300化pm離也15分鐘，棄上清，沉淀物再用PBS緩沖液化01M，抑值7. 4) 沖洗兩次，制成5%的息液，即為所需的致敏SPA混合液。
[0051] 應(yīng)用SPA法快速檢測鹽酸克倫特羅抗原的具體步驟如下：
[0052] 1)將抗鹽酸克倫特羅抗體（效價(jià)為1:10000)、陰性對照血清及空白對照分別按照 lug/ml的濃度包被于NC膜上，37°C溫箱放置30min。
[005引。然后加入3% BAS，進(jìn)行封閉，4°C過夜，備用。
[0054] 3)取 1:2、1:20、1:200、1:2000、1: IOOOOU :20000 稀釋的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品 5ul滴在包被了抗鹽酸克倫特羅抗體、陰性對照和空白對照且已經(jīng)封閉好的NC膜上， 37 °C 30min ；
[005引 4)用PBS緩沖液化01M，抑值7. 4)沖洗3次；
[005引 W再于NC膜上滴加5 y 1致敏的SPA混合液，37C SOmin ;
[0057] 6)用PBS緩沖液0). 01M，抑值7. 4)沖洗3次；
[005引結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：
[0059] a)如果陽性對照有顯色反應(yīng)，同時(shí)陰性對照和空白對照無顯色反應(yīng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 成立，否則，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成立。
[0060] b)在實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立的條件下，包被的抗鹽酸克倫特羅抗體位置上有顯色反應(yīng)的判 為陽性，即被檢樣品中含有鹽酸克倫特羅；反之，無顯色反應(yīng)的判為陰性，即被檢樣品中不 含有鹽酸克倫特羅。
[0061] 最終本發(fā)明的檢測結(jié)果顯示，應(yīng)用本發(fā)明的SPA法對鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢 測時(shí)能夠檢測到1:2000倍稀釋時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品，即能夠檢測到0. Ippb的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品。
[0062] (二）膠體金法檢測步驟為常規(guī)的方法
[0063] 膠體金法檢測結(jié)果顯示，應(yīng)用膠體金法對鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測時(shí)能夠檢 測到1:200倍稀釋時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品，即能夠檢測到Ippb的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果如表1所 /Jn O
[0064] 表1 ;膠體金法和SPA法檢測鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品的對比結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測瘦肉精的試劑，其特征在于，所述的試劑包含有包被在載體上的、用于檢測 鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和萊克巴多胺中的任一種或幾種的特異性抗體；用于顯色反應(yīng)的 試劑，所述的顯色反應(yīng)的試劑為染色的且用上述的特異性抗體致敏的金黃色葡萄球菌。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的特異性抗體的效價(jià)為1:800或以上。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述載體為NC膜或ELISA板。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的金黃色葡萄球菌用石碳酸復(fù)紅染料 進(jìn)行的染色。
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的金黃色葡萄球菌的致敏是將染色后 的金黃色葡萄球菌用抗鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇或萊克多巴胺抗體中的任一種或幾種致敏 的。
6. 權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的試劑包含有用作陽性對照的陽性血清 和/或作為陰性對照的陰性血清。
7. 如權(quán)利要求6所述的試劑，其特征在于，所述的陽性血清，是將鹽酸克倫特羅、沙丁 胺醇和萊克多巴胺免疫家兔后制備的效價(jià)達(dá)到1:800或以上的兔子血清。
8. 如權(quán)利要求6所述的試劑，其特征在于，所述的瘦肉精陰性血清，是抗鹽酸克倫特 羅、抗沙丁胺醇和抗萊克多巴胺抗體的效價(jià)低于1:1的動(dòng)物血清。
9. 權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于還包含有包被在載體上的、用于檢測抗鹽酸克 倫特羅抗體、抗沙丁胺醇抗體和抗萊克巴多胺抗體中的任一種或幾種的瘦肉精抗原。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104237511SQ201410549342
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】蘇冬梅, 張述智, 李春雨, 朱紹輝, 王友娟 申請人:青島中仁生物科技有限公司