一種快速評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量的方法，是將粉碎后植物性原料樣品中加入定量植酸酶產(chǎn)品，利用兩步酶法(胃蛋白酶—胰酶)進(jìn)行體外消化，取消化液進(jìn)行磷含量的測定，通過消化液中磷含量的高低確定植酸酶產(chǎn)品酶解樣品后釋放的磷量，進(jìn)而確定植酸酶產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明可以快速評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量且適于生產(chǎn)應(yīng)用的方法，為生產(chǎn)中更好的使用植酸酶產(chǎn)品提供保障。
【專利說明】一種快速評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量的方法
(—)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用體外酶消化法評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量的方法，屬于飼料【技術(shù)領(lǐng)域】。
(二)

【背景技術(shù)】
[0002]磷是畜禽營養(yǎng)物質(zhì)中功能最多的營養(yǎng)素之一，畜禽必須從飼料中得到充足的磷才能維持正常生命和生產(chǎn)活動。單胃動物(豬、雞)飼料中植物性飼料所占比例很大，雖然飼料中總磷含量較高，但可被單胃動物利用的有效磷卻不足。原因是谷物飼料中磷主要以植酸和植酸鹽的形式存在，絕大多數(shù)單胃動物不能消化、利用植酸和植酸鹽中的磷，需要通過在飼料中添加磷酸氫鈣等無機(jī)磷的形式進(jìn)行補(bǔ)充，這不僅增加了飼料成本，而且大量不能被畜禽消化吸收的植酸磷隨糞便排出，引起磷對環(huán)境的污染這一問題。植酸酶屬于磷酸單酯水解酶，能夠水解植酸而釋放出磷，提高植物性飼料中磷的利用率?，F(xiàn)在，隨著飼料用植酸酶制劑的問世和飼料工業(yè)的發(fā)展，國內(nèi)外均有飼料專用植酸酶產(chǎn)品在生產(chǎn)和使用，而且大量的試驗研究已明確證明，在畜禽飼糧中添加植酸酶是有效的，可減少無機(jī)磷的添加量，減少糞磷對環(huán)境的污染。但是，由于不同公司所生產(chǎn)植酸酶的生產(chǎn)菌種、基因來源和使用方式等存在差異，其活性的評定缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用效果的優(yōu)劣也無法進(jìn)行客觀的評定。因此，開發(fā)實用的植酸酶活性快速評定方法，對于評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量，指導(dǎo)生產(chǎn)使用具有重要的意義。
(三)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種快速評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量的方法，目的是:提供一種通過體外酶消化法快速評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量且適于生產(chǎn)應(yīng)用的方法，可以為生產(chǎn)中更好的使用植酸酶產(chǎn)品提供保障。
[0004]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:粉碎后植物性原料樣品中加入定量植酸酶產(chǎn)品，利用兩步酶法(胃蛋白酶一胰酶)進(jìn)行體外消化，取消化液進(jìn)行磷含量的測定，通過消化液中磷含量的高低確定植酸酶產(chǎn)品酶解樣品后釋放的磷量，進(jìn)而確定植酸酶產(chǎn)品的質(zhì)量。
[0005]一種快速評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量的方法，包括以下步驟:
[0006]1、將植物性飼料樣品粉碎并過60目篩，每克植物性飼料樣品中添加植酸酶產(chǎn)品
0.5U，充分混勻。準(zhǔn)確稱取混勻后樣品1.0g (m，精確到0.0OOlg)，加入濃度為1.0mg/mL且pH = 1.5?3.5的胃蛋白酶水溶液10mL，密封，36?42°C水浴恒溫振蕩(160?200r/min)消化90min ;再向上述消化90min后的樣品中加入濃度為1.0mol/L NaOH溶液0.1mL中和；然后再向上述中和后的樣品中加入濃度為2.5mg/mL胰酶水溶液1mL,混合均勻后轉(zhuǎn)移到12000?14000D的透析袋中，封口 ;將透析袋放入200ml (V)Tris-HcL緩沖液(pH = 7.6)中，36?42 °C水浴恒溫振蕩(160?200r/min)消化2h ;將2ml濃鹽酸加入20ml (V1)消化2h小時后的消化液中消煮，直至消化液澄清透明；澄清至透明的消化液放置至室溫后調(diào)PH值至7.6后使用中速定量濾紙過濾，并以蒸餾水清洗中速定量濾紙兩次，在合并后的濾液中加入1ml釩鑰酸銨顯色劑，用水定容至50ml，搖勻得到試樣溶液；試樣溶液室溫放置1min后，用Icm光徑比色皿在400nm波長下測定試樣溶液的吸光度，在繪制的工作曲線中查得試樣溶液的磷含量(Hi1)。
[0007]所述釩鑰酸銨顯色劑的制備方法為:稱取偏釩酸銨1.25g，加水200ml加熱溶解，冷卻后加入250ml硝酸；另稱取鑰酸銨25g，加400ml水加熱溶解；在冷卻條件下，將上述兩種溶液混合，用水定容至1000ml。
[0008]2、工作曲線的繪制:分別配制六種磷含量為O μ g/ml、25 μ g/ml>50 μ g/ml、100 μ g/ml>200 μ g/ml和400 μ g/ml的磷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,室溫放置1min后,用Icm光徑比色皿在400nm波長下測定上述六種磷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的吸光度值；以上述六種磷含量為橫坐標(biāo)，以六種磷含量分別對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。
[0009]所述磷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制方法為:將磷酸二氫鉀在105°C烘lh，冷卻后稱取
0.2195g溶于水,加入硝酸3ml,用水稀釋至100ml混勻即成濃度為50ug/ml的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述磷標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.0ml,0.5ml、1.0ml,2.0ml,4.0ml和8.0ml，再分別加入釩鑰酸銨顯色劑1ml并用水定容至50ml,搖勻,得到磷含量分別為O μ g/ml、25 μ g/ml>50 μ g/ml、100 μ g/ml >200 μ g/ml 和 400 μ g/ml 的磷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。
[0010]3、將樣品重量(m)及從工作曲線中查得的試樣溶液磷含量(Hi1)等代入下述公式，計算出磷含量:

【權(quán)利要求】
1.一種快速評定植酸酶產(chǎn)品質(zhì)量的方法，包括以下步驟: 1)將植物性飼料樣品粉碎并過60目篩，每克植物性飼料樣品中添加植酸酶產(chǎn)品0.5U,充分混勻；準(zhǔn)確稱取混勻后樣品ml.0g,加入濃度為1.0mg/mL且pH = 1.5?3.5的胃蛋白酶水溶液10mL，密封，36?42°C水浴160?200r/min恒溫振蕩消化90min ;再向上述消化90min后的樣品中加入濃度為1.0mol/L NaOH溶液0.1mL中和；然后再向上述中和后的樣品中加入濃度為2.5mg/mL胰酶水溶液10mL，混合均勻后轉(zhuǎn)移到12000?14000D的透析袋中封口 ；將透析袋放入200ml pH = 7.6的Tris-HcL緩沖液V中，36?42°C水浴160?200r/min恒溫振蕩消化2h ;將2ml濃鹽酸加入20ml消化2h小時后的消化液V1中消煮，直至消化液澄清透明；澄清至透明的消化液放置至室溫后調(diào)PH值至7.6后使用中速定量濾紙過濾，并以蒸餾水清洗中速定量濾紙兩次，在合并后的濾液中加入1ml釩鑰酸銨顯色劑，用水定容至50ml，搖勻得到試樣溶液；試樣溶液室溫放置1min后，用Icm光徑比色皿在400nm波長下測定試樣溶液的吸光度，在下述繪制的工作曲線中查得試樣溶液的磷含量Hl1 ； 2)工作曲線的繪制:分別配制六種磷含量為Oμ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml>200 μ g/ml和400 μ g/ml的磷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，室溫放置1min后，用Icm光徑比色皿在400nm波長下測定上述六種磷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的吸光度值；以上述六種磷含量為橫坐標(biāo)，以六種磷含量分別對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線； 3)將樣品重量m及從工作曲線中查得的試樣溶液磷含量Hi1等代入下述公式，計算磷含量: ,、Hi1 X ￥ P(%)=——^^—r X 100 m X V1 X 16 其中，P為磷含量，％ ; m為稱取樣品重量，g ； Hi1為由工作曲線中查得試樣溶液磷含量，yg; V為試樣透析消化液的總體積，V = 200ml ； V1為測定時移取試樣透析消化液的體積，V1 = 20ml。
【文檔編號】G01N21/31GK104181116SQ201410428966
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】林海, 焦洪超, 趙梅, 王召, 趙景鵬, 宋志剛 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)