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一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測方法與流程

文檔序號:11995686閱讀:707來源:國知局
一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測方法與流程
本發(fā)明涉及一種藥物檢測方法,特別涉及一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測方法。

背景技術(shù):
雙環(huán)鉑(Dicycloplatin)是由卡鉑與環(huán)丁烷二酸通過四個氫鍵組成的相對穩(wěn)定的超分子化合物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)為1,1-環(huán)丁烷二羧酸,二氨配鉑(Ⅱ)合1,1-環(huán)丁烷二羧酸(Bis-[1,1-cyclobutanedicarboxylicaciddiaminoplatin(Ⅱ)]complex)。研究表明雙環(huán)鉑具有廣譜、高效、低毒、低耐藥、低交叉耐藥以及穿透性好等特點(diǎn),是新一代超分子抗癌藥物。例如,公開號為CN1311183A的發(fā)明專利對雙環(huán)鉑進(jìn)行了急毒、藥效實(shí)驗(yàn)及臨床檢驗(yàn),結(jié)果表明雙環(huán)鉑不僅低毒而且抗癌活性高,對泌生癌、頭頸癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、腸癌、淋巴癌等均有顯著療效。目前,尚無對雙環(huán)鉑進(jìn)行有效定性和/或定量的相關(guān)方法報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明提供一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測方法,用于對雙環(huán)鉑進(jìn)行有效的定性和/或定量分析。雙環(huán)鉑作為新一代超分子抗癌藥物的臨床功效的證明為其推廣應(yīng)用提供了基礎(chǔ),為實(shí)現(xiàn)該藥物的工業(yè)化生產(chǎn),建立相關(guān)的質(zhì)量檢測和監(jiān)控體系不可或缺。雙環(huán)鉑的超分子結(jié)構(gòu)來自分子中卡鉑與環(huán)丁烷二酸之間的氫鍵結(jié)合,本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),由于雙環(huán)鉑的這種超分子結(jié)構(gòu)特性,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、流動注射-質(zhì)譜分析、紅外光譜分析、毛細(xì)管電泳(CZE)等多數(shù)測試方法均無法對以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物中的雙環(huán)鉑進(jìn)行精確地定性,尤其是無法將雙環(huán)鉑的化合物與卡鉑和環(huán)丁二酸的物理混合物區(qū)分開,測定結(jié)果容易出現(xiàn)假象。因此,本發(fā)明提供一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測方法,所述藥物為雙環(huán)鉑原料藥,所述檢測方法包括:對雙環(huán)鉑原料藥進(jìn)行X射線粉末衍射分析,獲得第一衍射圖譜;確認(rèn)所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處和/或2θ角為11.4-11.7°處是否具有衍射峰;若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰和2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰中的一種或兩種情況存在,則所述藥物中含有雙環(huán)鉑。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),采用X射線粉末衍射分析(XRPD)能夠有效地對雙環(huán)鉑進(jìn)行定性分析。其中,室溫以透射模式得到的衍射圖譜中,2θ角為10.3-10.7°處(10.51°左右處)具有衍射峰可以表明雙環(huán)鉑存在,而環(huán)丁二酸、卡鉑、環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物在該處均不具有衍射峰;此外,2θ角為11.4-11.7°處(11.55°左右處)不具有衍射峰也可以表明雙環(huán)鉑存在,環(huán)丁二酸、卡鉑、環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物在該處均具有衍射峰。因此,X射線粉末衍射分析尤其能夠?qū)Ψ勰畹暮须p環(huán)鉑的藥物進(jìn)行定性檢測,例如雙環(huán)鉑原料藥。對于含有雙環(huán)鉑的溶液(例如雙環(huán)鉑針劑),本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)多數(shù)的檢測條件(例如液相色譜分析等)會破壞雙環(huán)鉑分子內(nèi)氫鍵,使其無法以超分子的形式存在,即雙環(huán)鉑在溶液中完全解離成卡鉑和環(huán)丁二酸,因此無法有效地對雙環(huán)鉑溶液中的雙環(huán)鉑進(jìn)行定性檢測,例如無法將其與卡鉑和環(huán)丁二酸的混合溶液區(qū)分開。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),盡管雙環(huán)鉑在溶液狀態(tài)下(例如水溶液)中完全解離成卡鉑和環(huán)丁二酸,然而該溶液在經(jīng)凍干后僅存在少量的卡鉑和環(huán)丁二酸,在對雙環(huán)鉑溶液的水溶凍干粉末進(jìn)行X射線粉末衍射分析所得到的衍射圖譜中,在2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰和/或在2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰(下稱特征峰),即雙環(huán)鉑溶液的水溶凍干粉末與雙環(huán)鉑原料藥具有相同的特征峰;而環(huán)丁二酸和卡鉑物理混合物的水溶凍干粉中雖然形成少量雙環(huán)鉑,但在上述特征峰處呈現(xiàn)不同,即在在2θ角為10.3-10.7°處不具有衍射峰和/或在2θ角為11.4-11.7°處具有衍射峰。因此,利用XRPD能夠有效地對雙環(huán)鉑溶液中的雙環(huán)鉑進(jìn)行定性檢測,從而將其與卡鉑和環(huán)丁二酸的混合溶液區(qū)分開。因此,本發(fā)明還提供一種以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測方法,所述藥物為雙環(huán)鉑針劑,所述檢測方法包括:對雙環(huán)鉑針劑進(jìn)行凍干處理,制得雙環(huán)鉑藥粉;對所述雙環(huán)鉑藥粉進(jìn)行X射線粉末衍射分析,獲得第一衍射圖譜;確認(rèn)所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處和/或2θ角為11.4-11.7°處是否具有衍射峰;若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰和2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰中的一種或兩種情況存在,則所述藥物中含有雙環(huán)鉑。在本發(fā)明中,所述藥物中含有雙環(huán)鉑,其為該藥物的有效成分;此外,該藥物中可能還含有未結(jié)合成雙環(huán)鉑或者由雙環(huán)鉑解離所形成的卡鉑和/或環(huán)丁二酸,本發(fā)明將這些卡鉑和/或環(huán)丁二酸定義為雜質(zhì)。具體地,本發(fā)明可以通過三種方式對藥物中的雙環(huán)鉑進(jìn)行定性檢測,即:1)若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰,則所述藥物中含有雙環(huán)鉑;2)若所述第一衍射圖譜中2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰,則所述藥物中含有雙環(huán)鉑;3)若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰和2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰,則所述藥物中含有雙環(huán)鉑。并且,上述第2)和第3)種情況說明該藥物中不含有所述雜質(zhì)。進(jìn)一步地,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物,所述雜質(zhì)(尤其是卡鉑)表現(xiàn)為在2θ角為11.4-11.7°處具有衍射峰。因此,本發(fā)明還提供了對藥物中所述雜質(zhì)進(jìn)行定量檢測的方法,即:若所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處和2θ角為11.4-11.7°處均具有衍射峰,則所述檢測方法還包括:將雙環(huán)鉑標(biāo)準(zhǔn)品與雜質(zhì)制成混合粉末進(jìn)行X射線粉末衍射分析,獲得第二衍射圖譜,所述混合粉末中雜質(zhì)的質(zhì)量百分含量為X%;分別獲得所述第一衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度A11和2θ角為11.4-11.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度A12,以及分別獲得所述第二衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度A21和2θ角為11.4-11.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度A22,計算A12/A11和A22/A21;若A12/A11≤A22/A21,則所述藥物中雜質(zhì)的含量≤X%,若A12/A11>A22/A21,則所述藥物中雜質(zhì)的含量>X%;其中,所述雜質(zhì)為卡鉑和環(huán)丁二酸中的一種或兩種。在本發(fā)明中,可以藥物中的卡鉑含量(雜質(zhì)為卡鉑)作為藥物雜質(zhì)的評價指標(biāo)來對藥物中的雜質(zhì)含量進(jìn)行評價,特別是所述X%可以為0.1-1%。此時,若A12/A11≤0.67,則所述藥物中卡鉑的含量≤1%;若A12/A11>0.67,則所述藥物中卡鉑的含量>1%;進(jìn)一步地,若A12/A11≤0.55,則所述藥物中卡鉑的含量≤0.5%;若A12/A11>0.55,則所述藥物中卡鉑的含量>0.5%;再進(jìn)一步地,若A12/A11≤0.5,則所述藥物中卡鉑的含量≤0.1%;若A12/A11>0.5,則所述藥物中卡鉑的含量>0.1%。在本發(fā)明中,所述藥物中卡鉑含量的檢測限可達(dá)0.1%。在本發(fā)明具體方案中,采用配有透射旋轉(zhuǎn)樣品臺的X射線粉末衍射儀進(jìn)行所述X射線粉末衍射分析,方法包括:使用單色CuKα輻射,管壓為40kV,管流為40mA,2θ掃描范圍為6-55°,掃描速度為0.6s/步,步長為0.015°/步。所述第一衍射圖譜和第二衍射圖譜均是在室溫以透射模式得到。進(jìn)一步地,本發(fā)明的檢測方法還包括對以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物進(jìn)行定量檢測,即:將雙環(huán)鉑原料藥制成溶液后或雙環(huán)鉑針劑稀釋后進(jìn)行反相高效液相色譜檢測,同時以0.025-0.999mg/mL的卡鉑溶液和0.101-3.99mg/mL的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別確定所述雙環(huán)鉑針劑中卡鉑和環(huán)丁二酸的質(zhì)量含量。進(jìn)一步地,使所述溶液或稀釋后的所述雙環(huán)鉑針劑中雙環(huán)鉑的質(zhì)量濃度為1mg/mL,并且以0.7mg/mL的卡鉑溶液和0.3mg/mL的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。所述質(zhì)量含量的確定可以通過外標(biāo)法進(jìn)行。本發(fā)明還可以采用其它定量檢測方法,例如:將雙環(huán)鉑原料藥制成溶液后或雙環(huán)鉑針劑稀釋后進(jìn)行反相高效液相色譜檢測,同時以0.067-2.7mmol/L的卡鉑溶液和0.7-27.8mmol/L的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別確定所述雙環(huán)鉑針劑中卡鉑和環(huán)丁二酸的摩爾含量以及卡鉑與環(huán)丁二酸的摩爾比。進(jìn)一步地,使所述溶液或稀釋后的所述雙環(huán)鉑針劑中雙環(huán)鉑的摩爾濃度為2mmol/L,并且以2mmol/L的卡鉑溶液和2mmol/L的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。在本發(fā)明具體方法中,所述反相高效液相色譜的條件為:色譜柱:AQ-C18,4.6×250mm,5μm;檢測波長:220nm;進(jìn)樣量:10μL;流速:1.0mL/min;流動相:A相為20mmol/L且pH為3.0的磷酸二氫鈉緩沖液,B相為甲醇;梯度條件:0-3min,5%B相,3-8min,5-60%B相,8-12min,60%B相。本發(fā)明所提供的以雙環(huán)鉑為有效成分的藥物的檢測方法,能夠?qū)λ幬镏械碾p環(huán)鉑進(jìn)行定性和/或定量分析,其能夠排除其它測定方法所帶來的假象,真實(shí)且直觀地對雙環(huán)鉑進(jìn)行有效地測定,尤其是本發(fā)明能夠?qū)⑵渑c卡鉑與環(huán)丁二酸的物理混合物區(qū)分開,并且能夠?qū)λ幬镏械碾s質(zhì)含量(以卡鉑計)進(jìn)行有效地測定,從而為雙環(huán)鉑藥物的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中樣品1在透射模式和反射模式下的X射線粉末衍射圖譜,其中a為透射模式,b為反射模式;圖2為本發(fā)明實(shí)施例1各樣品的X射線粉末衍射圖譜;圖3為本發(fā)明實(shí)施例2各樣品的X射線粉末衍射圖譜;圖4為本發(fā)明實(shí)施例4各樣品的DSC曲線;圖5為本發(fā)明對照例1的樣品1的紅外圖譜;圖6為本發(fā)明對照例1的樣品4的紅外圖譜;圖7為本發(fā)明對照例2的雙環(huán)鉑針劑在正離子模式下的質(zhì)譜圖;圖8為本發(fā)明對照例2的雙環(huán)鉑針劑在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚,下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖和實(shí)施例,對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例,而不是全部的實(shí)施例?;诒景l(fā)明中的實(shí)施例,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例,都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明實(shí)施例所采用的樣品包括:雙環(huán)鉑原料藥(以下稱樣品1):四批,均購自北京市興大科學(xué)系統(tǒng)公司,批號分別為:20130115-1、20130115-2、2013015-3和20130216;環(huán)丁二酸(以下稱樣品2):純度為99.5%以上;卡鉑(以下稱樣品3):純度為99%以上;環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物(以下稱樣品4):取19mg環(huán)丁二酸和50mg卡鉑,混合后于研缽中輕微研成粉末狀,其中環(huán)丁二酸與卡鉑的摩爾比約為1:1;在本發(fā)明中,將環(huán)丁二酸和卡鉑直接混合所得到的混合物定義為環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物,該混合物中環(huán)丁二酸和卡鉑未形成氫鍵;雙環(huán)鉑原料藥的水溶凍干粉(以下稱樣品5):取60mg雙環(huán)鉑原料藥,用2.5ml去離子水溶解,室溫放置2h后,置于-70℃冰箱冷凍4h,轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)(冷阱溫度-69℃,真空為10pa),冷凍干燥12h,制得白色凍干粉;環(huán)丁二酸和卡鉑物理混合物的水溶凍干粉(以下稱樣品6):將上述環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物按照上述方法制成凍干粉;雙環(huán)鉑標(biāo)準(zhǔn)品和針劑:購自北京市興大科學(xué)系統(tǒng)公司,其中:雙環(huán)鉑針劑為5mL安瓿,雙環(huán)鉑的含量為1%(即1g/100mL);雙環(huán)鉑針劑的凍干粉:將上述雙環(huán)鉑針劑按照上述方法制成凍干粉。實(shí)施例1X射線粉末衍射(XRPD)分析一、儀器和條件X射線粉末衍射儀:BrukerD8-advance,配有反射和透射旋轉(zhuǎn)樣品臺;透射:CuKα輻射,聚焦單色器,gobel-mirror聚焦光路,管壓40kV管流40mA;掃描方式:θ/2θ掃描;DS發(fā)散狹縫1.2mm,索拉狹縫2.5mm;2θ掃描范圍:6-55°;掃描速度:0.6s/step;步長:0.015°/step。二、XRPD分析在室溫下采用透射模式和反射模式分別對一批樣品1進(jìn)行XRPD測定,衍射圖譜如圖1所示。由圖1可知:鑒于雙環(huán)鉑原料藥為針狀晶體,存在嚴(yán)重的擇優(yōu)取向,相對于反射模式(b),采用透射模式(a)能夠弱化雙環(huán)鉑的擇優(yōu)取向,從而排除晶體形狀干擾,因此能夠更為真實(shí)地反映樣品的結(jié)構(gòu)信息。在本實(shí)施例中,XRPD均在室溫下采用透射模式進(jìn)行。將上述各樣品分別裝入透射樣品臺后進(jìn)行XRPD測定,衍射圖譜如圖2所示。由圖2可知:含有雙環(huán)鉑的樣品1和樣品5與其它樣品存在顯著差異,首先,樣品1和5在2θ角為11.4-11.7°處(11.55°左右)無明顯的衍射峰,而其它幾個樣品在該處具有明顯的衍射峰;其次,樣品1和5在2θ角為10.3-10.7°處(10.51°左右)具有明顯的衍射峰,而其它樣品在該處無明顯的衍射峰。因此,可以通過衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處和/或2θ角為11.4-11.7°處是否具有衍射峰來判定樣品中是否含有雙環(huán)鉑,從而將其與卡鉑、環(huán)丁二酸、環(huán)丁二酸和卡鉑的物理混合物及其水溶凍干粉區(qū)分開。進(jìn)一步地,對上述雙環(huán)鉑針劑的凍干粉進(jìn)行XRPD測定,其衍射圖譜與樣品5基本相同,衍射圖譜中在2θ角為10.3-10.7°處具有衍射峰,而在2θ角為11.4-11.7°處不具有衍射峰。實(shí)施例2藥物雜質(zhì)分析精密稱取4份50mg雙環(huán)鉑標(biāo)準(zhǔn)品(不含卡鉑和環(huán)丁二酸),向各份分別添加0.5mg、0.25mg、0.05mg和0mg卡鉑,輕微研細(xì)混合均勻,分別制成樣品A、樣品B、樣品C、樣品D,各樣品的卡鉑含量分別為1%、0.5%、0.1%和0%。將上述樣品A-D分別裝入透射樣品臺后,按照實(shí)施例1方法進(jìn)行XRPD測定,衍射圖譜如圖3所示。將衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度記作A21,2θ角為11.4-11.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度記作A22。經(jīng)計算,樣品A-C的A22/A21分別為0.67、0.55和0.5。對雙環(huán)鉑原料藥進(jìn)行XRPD測定,并將其衍射圖譜中2θ角為10.3-10.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度記作A11,2θ角為11.4-11.7°處的衍射峰的積分強(qiáng)度記作A12,計算A12/A11,并通過各樣品的卡鉑含量及其相對應(yīng)的A22/A21作為參照來確定雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量。即,若A12/A11≤0.67,則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量≤1%,若A12/A11>0.67,則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量>1%;進(jìn)一步地,若A12/A11≤0.55,則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量≤0.5%,若A12/A11>0.55,則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量>0.5%;再進(jìn)一步地,若A12/A11≤0.5,則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量≤0.1%,若A12/A11>0.5,則雙環(huán)鉑原料藥中卡鉑的含量>0.1%。本實(shí)施例僅示例了如何對雙環(huán)鉑原料藥中的卡鉑含量進(jìn)行定量檢測,然而上述樣品中的卡鉑含量并不局限于上述所示例的數(shù)值,只要能夠添加通過XRPD衍射圖譜檢測出樣品中的卡鉑含量(例如樣品中卡鉑含量≥0.1%),則A22/A21可以是其它任意數(shù)值,并且可以該數(shù)值作為參照來確定雙環(huán)鉑原料藥中的卡鉑含量。實(shí)施例3反相高效液相色譜分析一、儀器和色譜條件儀器:島津LC-20A高效液相色譜系統(tǒng),配備SPD-10A紫外-可見檢測器,自動進(jìn)樣器,LCSolution化學(xué)工作站;色譜柱:AQ-C18,4.6×250mm,5μm;檢測波長:220nm;進(jìn)樣量:10μL;流速:1.0mL/min;流動相及梯度條件:A相:20mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液,pH3.0;B相:甲醇;梯度條件:0-3min,5%B相,3-8min,5-60%B相,8-12min,60%B相。二、卡鉑和環(huán)丁二酸的線性關(guān)系分別精確稱取卡鉑9.99mg、環(huán)丁二酸39.94mg,置10mL容量瓶中,用流動相溶解并定容至刻度,制成0.999mg/mL的卡鉑溶液和3.99mg/mL的環(huán)丁二酸溶液;經(jīng)逐級稀釋后,制得一系列不同濃度的溶液,然后分別取10μL溶液注入液相色譜儀進(jìn)行測定。液相色譜結(jié)果表明:卡鉑溶液在0.025-0.999mg/mL(即0.067-2.7mmol/L)范圍內(nèi)與峰面積積分值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r為0.999;環(huán)丁二酸溶液在0.101-3.99mg/mL(即0.7-27.8mmol/L)范圍內(nèi)與峰面積積分值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r為0.999。三、雙環(huán)鉑藥物的定量測定分別精密稱取上述四批雙環(huán)鉑原料藥各約10mg至10mL容量瓶,用流動相溶解,配制成約1.0mg/mL的溶液;同時對上述雙環(huán)鉑針劑進(jìn)行稀釋,制成約1.0mg/mL的溶液。分別取10μL上述各溶液注入液相色譜儀進(jìn)行測定;同時以0.7mg/mL左右的卡鉑溶液和0.3mg/mL左右的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用外標(biāo)法進(jìn)行定量測定后,計算測定結(jié)果相對于各自標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量百分含量(即,測定的卡鉑或環(huán)丁二酸的濃度/標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度×100%),結(jié)果如表1所示。表1雙環(huán)鉑藥物中卡鉑和環(huán)丁二酸的質(zhì)量百分含量雙環(huán)鉑藥物卡鉑的質(zhì)量百分含量環(huán)丁二酸的質(zhì)量百分含量第一批原料藥101.8%102.7%第二批原料藥100.0%100.4%第三批原料藥98.3%100.0%第四批原料藥101.3%102.6%雙環(huán)鉑針劑99.8%97.6%由表1結(jié)果可知:雙環(huán)鉑藥物中卡鉑和環(huán)丁二酸的含量在97-103%,其可作為雙環(huán)鉑藥物的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。進(jìn)一步地,還可以采用下述方法進(jìn)行定量測定:將上述四批雙環(huán)鉑原料藥,分別配制成摩爾濃度約為2mmol/L的溶液;同時將上上述雙環(huán)鉑針劑進(jìn)行稀釋為2mmol/L左右的溶液。分別取10μL上述各溶液注入液相色譜儀進(jìn)行測定;同時以2mmol/L左右的卡鉑溶液和2mmol/L左右的環(huán)丁二酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用外標(biāo)法進(jìn)行定量,結(jié)果如表2所示。表2雙環(huán)鉑藥物中卡鉑和環(huán)丁二酸的摩爾濃度及摩爾比由表2結(jié)果可知:雙環(huán)鉑藥物中卡鉑與環(huán)丁二酸的摩爾比為0.95-1.05,其可作為雙環(huán)鉑藥物的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。實(shí)施例4示差掃描量熱法分析(DSC)一、儀器和參數(shù)示差掃描量熱儀:美國TAQ2000,Al盤為參比盤,樣品盤為鋁盤,升溫速率:10℃/min,升溫區(qū)間40℃-240℃。二、示差掃描量熱法分析分別精確稱取50mg樣品1至樣品6,并用示差掃描量熱儀測定其熱重參數(shù),結(jié)果如圖4所示。圖4結(jié)果表明:樣品1、樣品5和樣品6的DSC曲線較為相似,其分別在197.82℃、198.23℃和184.13℃開始出現(xiàn)吸熱峰;樣品4與樣品1的DSC曲線呈現(xiàn)較大差異,其除在182.04℃處有吸熱峰外,在153.05℃還有一個明顯的吸熱峰,該峰與環(huán)丁二酸的吸熱峰接近,可確認(rèn)為環(huán)丁二酸組分吸熱峰;而樣品3在153℃和200℃附近均未出現(xiàn)吸熱峰,當(dāng)溫度升至252℃時有一個分解峰。此外,樣品1和樣品5在197℃出現(xiàn)尖峭的相變峰,吸收峰僅略發(fā)生位移,說明凍干過程對雙環(huán)鉑兩個組分間的影響不大;樣品6與樣品1和樣品5的DSC曲線相似,其在153℃附近未出現(xiàn)環(huán)丁二酸熔融峰,說明樣品6中卡鉑與環(huán)丁二酸由于氫鍵作用形成了雙環(huán)鉑類似物,然而其在197℃附近的峰形很寬,由此說明雙環(huán)鉑的兩個組分處于結(jié)晶態(tài),而卡鉑和環(huán)丁二酸物理混合物的水溶凍干粉的組分處于半結(jié)晶態(tài)或無定形態(tài),其結(jié)晶狀態(tài)與雙環(huán)鉑顯著不同。由此說明,雙環(huán)鉑原料藥與卡鉑和環(huán)丁二酸的物理混合物存在顯著差異,雙環(huán)鉑的兩個組分間由于氫鍵作用而形成了新的超分子氫鍵簇集體。實(shí)施例5核磁共振滴定法(NMR)一、儀器和參數(shù)核磁共振滴定采用日本電子ECA-400型超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振儀,其配有選擇脈沖Laminal波形發(fā)生器和5mmz-軸梯度脈沖多核探頭。1H工作頻率分別為400MHz,以DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo);實(shí)驗(yàn)溫度為室溫,使用Ф5mm多核探頭;1HNMR的譜寬9.18kHz,數(shù)據(jù)點(diǎn)32768,90°脈沖寬度11μs,弛豫延遲1.2s。二、核磁共振滴定實(shí)驗(yàn)(固定環(huán)丁二酸量)固定環(huán)丁二酸的用量并改變卡鉑的加入量,用0.5ml氘代DMSO溶解后放置一夜,測定環(huán)丁二酸羧基與卡鉑氨基的1HNMR化學(xué)位移,卡鉑、環(huán)丁二酸的添加量與核磁滴定結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明,除環(huán)丁二酸分子中的羧基氫外,其它所有氫原子的化學(xué)位移均未隨卡鉑加入量的增加發(fā)生改變,說明卡鉑分子中的氨基氫受環(huán)丁二酸的加入影響較小。并且,環(huán)丁二酸羧基氫的化學(xué)位移隨其自身加入量的增加而發(fā)生顯著變化,從高場往低場發(fā)生移動(12.68→13.42ppm),由此說明環(huán)丁二酸與卡鉑之間的確存在氫鍵作用。此外,依據(jù)不同卡鉑添加量下的羧基氫的化學(xué)位移值(P),通過非線性擬合計算得卡鉑與環(huán)丁二酸之間的解離常數(shù)為0.3mmol/L;依據(jù)羧基氫的化學(xué)位移值倒數(shù)與卡鉑摩爾濃度的倒數(shù),計算得環(huán)丁二酸與卡鉑的結(jié)合常數(shù)為4.22Χ104L/mol;由此進(jìn)一步說明雙環(huán)鉑的兩個組分之間確實(shí)存在氫鍵作用,但兩個組分之間的氫鍵結(jié)合力較弱。表3卡鉑和環(huán)丁二酸的添加量及化學(xué)位移對照例1紅外光譜分析采用PerkinElmer紅外光譜儀(Frontier)對樣品1和樣品4進(jìn)行測定,測定方法具體為:預(yù)先將KBr烘干,研磨,壓片后測本底,再將樣品1、樣品4分別與適量KBr粉末研磨混勻,壓片后測定,樣品1和樣品4的紅外圖譜分別如圖5和圖6所示。圖5和圖6結(jié)果表明:樣品1和樣品4的紅外圖譜無顯著差異,表明紅外光譜分析無法對雙環(huán)鉑原料藥與卡鉑和環(huán)丁二酸的物理混合物進(jìn)行有效區(qū)分,因此無法對雙環(huán)鉑進(jìn)行有效且精確地定性分析。對照例2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)一、儀器及色譜條件毛細(xì)管電壓:3KV(或-2.6KV);提取錐孔電壓:4V(或-4V);樣品錐孔電壓:15V(或-20V);源溫:300℃;掃描范圍:80-1000;色譜柱:XDB-C18,4.6x50mm,1.8um;流動相及梯度條件:流動相A:0.1%甲酸水溶液;流動相B:甲醇;梯度:0min,1%B;1min,1%B;3.5min,60%B;5.5min,60%B;流速:0.5mL/min;進(jìn)樣體積:2uL。二、液相色譜-質(zhì)譜分析按照上述色譜條件對雙環(huán)鉑針劑進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析,結(jié)果如圖7和圖8所示。圖7和圖8結(jié)果表明:雙環(huán)鉑在液相色譜分離條件下無法以其超分子氫鍵簇集體形式存在,其完全解離成卡鉑與環(huán)丁二酸,其中在正離子和負(fù)離子模式下分別檢測到解離產(chǎn)生的卡鉑和環(huán)丁二酸,圖7中m/z372.0514為卡鉑的分子離子峰[M+H]+,圖8中m/z143.0341為環(huán)丁二酸的分子離子峰[M-H]-。由此表明:LC-MS同樣無法對雙環(huán)鉑溶液進(jìn)行有效地定性分析。對照例3流動注射-質(zhì)譜分析鑒于液相色譜分離會破壞雙環(huán)鉑分子內(nèi)的氫鍵,因此嘗試采用流動注射進(jìn)樣,從而直接對雙環(huán)鉑水溶液(雙環(huán)鉑針劑)進(jìn)行分析。結(jié)果表明:雙環(huán)鉑水溶液在正離子模式下僅檢測到卡鉑的分子離子峰[372.0543],而在負(fù)離子模式下觀察到雙環(huán)鉑[m/z514.0917]和環(huán)丁二酸[m/z143.0375]的分子離子峰。由此可見,色譜分離會破壞雙環(huán)鉑超分子氫鍵簇集體,因此無法區(qū)分雙環(huán)鉑水溶液與卡鉑和環(huán)丁二酸的混合溶液;采用流動注射進(jìn)樣后直接質(zhì)譜分析能夠在負(fù)離子模式下獲得雙環(huán)鉑的準(zhǔn)確分子量,因此其僅適用于對雙環(huán)鉑的準(zhǔn)確分子量進(jìn)行測定,不適合對雙環(huán)鉑水溶液中的雙環(huán)鉑進(jìn)行定性檢測。對照例4毛細(xì)管電泳(CZE)一、儀器和參數(shù)采用AgilentG1602A毛細(xì)管電泳儀;電壓:+20kV;毛細(xì)管內(nèi)徑:75μm;紫外/二極管陣列監(jiān)測器。二、水相CZE分離配制四份20mM的pH為7.05左右的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液,向其中三份緩沖液中分別添加β-環(huán)糊精(β-CD)、羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)和羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD),該四種緩沖液作為毛細(xì)管電泳分離緩沖液;開啟電泳儀后,分別用1M的NaOH、0.1M的NaOH、水、上述四種緩沖液依次沖洗毛細(xì)管柱,進(jìn)樣后在電壓為20KV、柱溫為25℃下對樣品1至樣品4進(jìn)行分離。結(jié)果表明,在上述各分離條件下(即各緩沖液),雙環(huán)鉑與卡鉑的出峰時間均一致,未發(fā)現(xiàn)有分離跡象,卡鉑、雙環(huán)鉑、卡鉑和雙環(huán)鉑的物理混合物的出峰時間均在7.42min左右,并且雙環(huán)鉑與卡鉑的物理混合物的峰面積約為卡鉑和雙環(huán)鉑的峰面積之和。三、非水CZE分離(NACE)配制20mMNH4Ac的乙腈溶液,用乙酸調(diào)節(jié)pH至7左右后作為毛細(xì)管電泳分離緩沖液,按照上述方法對樣品1至樣品4進(jìn)行分離。結(jié)果表明,在上述分離條件下,雙環(huán)鉑與卡鉑未發(fā)現(xiàn)有分離跡象。四、膠束毛細(xì)管電泳分離(MEKC)配制20mM的十二烷基磺酸鈉(SDS)水溶液作為毛細(xì)管工作緩沖液,按照上述方法對樣品1至樣品4進(jìn)行分離。結(jié)果表明,在上述分離條件下,雙環(huán)鉑與卡鉑未發(fā)現(xiàn)有分離跡象。綜上所述,采用三種模式的毛細(xì)管電泳對各樣品進(jìn)行分離時,各樣品均未出現(xiàn)分離現(xiàn)象,且雙環(huán)鉑和卡鉑的出峰時間一致,其進(jìn)一步說明雙環(huán)鉑由于超分子內(nèi)相對共價鍵較弱的氫鍵存在,在電場能量環(huán)境作用下解離為卡鉑和環(huán)丁二酸。最后應(yīng)說明的是:以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案,而非對其限制;盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改,或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換;而這些修改或者替換,并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。
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