熱對(duì)比測(cè)定和讀取器的制造方法
【專利摘要】公開了一種結(jié)合熱對(duì)比讀取器使用的測(cè)定。在所述測(cè)定中，測(cè)試試條包括如果樣品中存在目標(biāo)分析物則可以發(fā)生熱響應(yīng)的材料。所述熱對(duì)比讀取器包括殼體，具有用于在測(cè)試位置處接收測(cè)試試條的開口；能量源，針對(duì)測(cè)試位置；以及熱傳感器，針對(duì)測(cè)試位置。熱傳感器配置為：如果目標(biāo)分析物存在于樣品中，則當(dāng)在測(cè)試位置處激發(fā)熱源時(shí)，感測(cè)測(cè)試試條的發(fā)熱。熱傳感器可以使用與傳感器輸出相耦接并被配置為提供診斷輸出的診斷電路，提供傳感器輸出。診斷輸出可以根據(jù)傳感器輸出，指示患者的診斷狀況。本公開還包括檢測(cè)目標(biāo)分析物的方法以及包括側(cè)向流測(cè)定和熱對(duì)比讀取器的試劑盒。
【專利說(shuō)明】熱對(duì)比測(cè)定和讀取器

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于在樣品中檢測(cè)分析物的測(cè)定和讀取器。更具體地，本發(fā)明涉及基 于熱對(duì)比進(jìn)行操作的測(cè)定和讀取器。

【背景技術(shù)】
[0002] LFA (側(cè)向流測(cè)定或側(cè)向流免疫測(cè)定，也稱作快速診斷測(cè)試--RDT或生物測(cè)定） 技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境內(nèi)外都得到了廣泛的應(yīng)用。在典型的測(cè)定中，向測(cè)試試條施加來(lái)自患者 的流體樣品。樣品與測(cè)試試條上的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，導(dǎo)致試條光學(xué)上改變特性。人們可 以觀察到視覺(jué)指示，例如，使用家庭妊娠測(cè)試。然而，可以使用測(cè)定讀取器來(lái)獲得更準(zhǔn)確的 讀數(shù)。例如，這種讀取器可以包括光學(xué)敏感傳感器，相較于人類觀察者，能夠以更可重復(fù) 的方式更準(zhǔn)確地感測(cè)光學(xué)變化。在于2007年11月20日授權(quán)的Polito等人的美國(guó)專利 No. 7, 297, 529中示出了典型的測(cè)定讀取器的一個(gè)示例。
[0003] 快速識(shí)別疾病的能力支持及時(shí)治療，并改善結(jié)果。這種可能性增加了對(duì)快速醫(yī)療 點(diǎn)診斷設(shè)備或系統(tǒng)的開發(fā)和使用，所述快速醫(yī)療點(diǎn)診斷設(shè)備或系統(tǒng)能夠在來(lái)源豐富環(huán)境和 資源有限環(huán)境中進(jìn)行生物分子檢測(cè)。LFA便宜、簡(jiǎn)單、便攜和魯棒，因此令LFA在醫(yī)療、農(nóng)業(yè) 和非處方個(gè)人使用中很常見(jiàn)，例如，用于妊娠測(cè)試。LFA還被廣泛地用于大量傳染病，例如， 瘧疾、AIDS相關(guān)的隱球菌腦膜炎、肺炎球菌性肺炎以及最近的結(jié)核病。
[0004] 盡管一些LFA的分析性能可與基于實(shí)驗(yàn)室的方法相媲美，然而大多數(shù)LFA的分析 靈敏度（備選地，稱作檢測(cè)極限）在HlM到μΜ的范圍，該靈敏度明顯低于其它分子技術(shù)（例 如，酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA))。因此，當(dāng)抗原水平較低時(shí)，LFA并非特別有助于病理過(guò)程的早 期檢測(cè)。由于基于微流體、生物條形碼和酶的測(cè)定技術(shù)可能可以在nM到pM的范圍內(nèi)進(jìn)行 檢測(cè)，所以研究關(guān)注于開發(fā)這些測(cè)定技術(shù)，以便在抗原檢測(cè)中獲得更高的靈敏度。然而，所 有這些方法仍處于開發(fā)階段，沒(méi)有證實(shí)能夠以可靠、經(jīng)濟(jì)有效的方式執(zhí)行所述方法以由終 端用戶在醫(yī)療站點(diǎn)中使用。
[0005] 眾所周知，材料的光、熱和電特性在納米尺度上大幅改變。具體地，可以將金屬納 米顆粒的增強(qiáng)的光熱特性用于：惡性腫瘤的熱切割、檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞、光熱基因轉(zhuǎn)染、增 強(qiáng)化學(xué)療法的治療效率以及用于跟蹤納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種熱對(duì)比測(cè)定讀取器。所述熱對(duì)比測(cè)定讀取器包括：能 量源；傳感器；I/O電路；以及開口，用于接收測(cè)定試條。讀取器被配置為當(dāng)在測(cè)定試條的測(cè) 試區(qū)域上激活能量源時(shí)將傳感器結(jié)果轉(zhuǎn)換為輸出信號(hào)。
[0007] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種包括測(cè)定系統(tǒng)的測(cè)定試劑盒（kit)。所述測(cè)定試劑盒 包括：樣品墊；測(cè)試試條；納米顆粒，與分析物結(jié)合分子綴合；測(cè)試區(qū)域；對(duì)照區(qū)域；以及吸 收墊，配置為當(dāng)施加樣品時(shí)進(jìn)行流體連通。所述試劑盒還包括熱對(duì)比測(cè)定讀取器。
[0008] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)樣品中的分析物的方法，所述方法包括：在將測(cè) 定系統(tǒng)的測(cè)試試條與樣品接觸之后，向能量源暴露測(cè)定系統(tǒng)中的測(cè)試試條的測(cè)試區(qū)域。樣 品由于毛細(xì)管作用而移動(dòng)通過(guò)所述測(cè)試試條，所述測(cè)定系統(tǒng)包括：納米顆粒，與在樣品中結(jié) 合分析物的分析物結(jié)合分子綴合；以及測(cè)試區(qū)域，包括捕獲分子。所述方法還包括通過(guò)傳感 器測(cè)量在測(cè)試區(qū)域中產(chǎn)生的熱，以檢測(cè)測(cè)試區(qū)域中存在或不存在所述分析物。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1是示出了側(cè)向流測(cè)定測(cè)試試條和讀取系統(tǒng)的簡(jiǎn)化圖。
[0010] 圖2A是便攜式測(cè)定讀取器的簡(jiǎn)化框圖。
[0011] 圖2B是臺(tái)式測(cè)定讀取器的簡(jiǎn)化框圖。
[0012] 圖3是圖2A的測(cè)定讀取器的簡(jiǎn)化框圖。
[0013] 圖4A和4B是示出了 LFA相對(duì)于時(shí)間的熱量響應(yīng)的圖。
[0014] 圖5是示出了在熱對(duì)比測(cè)定中使用金納米顆粒（GNP)的圖。
[0015] 圖6是示出了熱對(duì)比如何增強(qiáng)現(xiàn)有免疫色譜側(cè)向流測(cè)定對(duì)隱球菌抗原（CrAg)的 檢測(cè)的圖。高濃度下信號(hào)的穩(wěn)定階段是由于LFA的高劑量鉤狀效應(yīng)。虛線示出了來(lái)自對(duì)照 樣品的背景。
[0016] 圖7A是針對(duì)不同納米顆粒形狀的納米顆粒濃度相對(duì)于溫度變化的圖。
[0017] 圖7B是針對(duì)不同材料的溫度變化的圖。
[0018] 圖8A是hCG(人體絨毛膜促性腺激素）的熱對(duì)比測(cè)定的結(jié)果的圖片示意表示。
[0019] 圖8B是hCG的熱對(duì)比測(cè)定的結(jié)果的圖。
[0020] 圖9是瘧疾抗原的熱對(duì)比測(cè)定的結(jié)果的圖。
[0021] 圖IOA和圖IOB是示出了使用SAR的圖。
[0022] 圖11是使用SAR的hCG的熱對(duì)比測(cè)定的結(jié)果的圖。
[0023] 圖12A、12B和12C是分別示出了在CrAg量桿、hCG量桿和合成GNP內(nèi)的GNP的多 分散性的圖。
[0024] 圖13是示出了均勻尺寸的合成GNP的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明涉及結(jié)合熱對(duì)比讀取器使用的測(cè)定系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及用于使用熱對(duì)比測(cè) 定和讀取系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)樣品中的分析物的方法。本發(fā)明包括測(cè)定測(cè)試試條，所述測(cè)定測(cè)試試 條展示出響應(yīng)于暴露給樣品中可能存在的特定目標(biāo)化合物而改變的熱特性。本發(fā)明包括用 于讀取這種測(cè)試試條的熱特性的讀取器。下文更詳細(xì)地討論了本發(fā)明的多個(gè)方面。
[0026] 熱對(duì)比測(cè)定系統(tǒng)是配置為結(jié)合熱對(duì)比讀取器運(yùn)作的測(cè)定。有利地，可以將熱對(duì)比 測(cè)定系統(tǒng)用于檢測(cè)樣品中的分析物，與使用視覺(jué)讀取器的測(cè)定相比，所述熱對(duì)比測(cè)定的分 析物可以具有更低的濃度。熱對(duì)比測(cè)定系統(tǒng)可以是對(duì)多種樣品中的分析物的高靈敏度檢測(cè) 系統(tǒng)。有利地，與使用視覺(jué)檢測(cè)方法的相似LFA相比，能夠?qū)崿F(xiàn)在更早階段檢測(cè)疾病或狀 況。此外，所述方法的簡(jiǎn)單性支持終端用戶方便并準(zhǔn)確地使用該系統(tǒng)。所述系統(tǒng)非常適合 醫(yī)療點(diǎn)設(shè)施和資源有限環(huán)境。這里所述的實(shí)施例涉及可以用于擴(kuò)展臨床使用的LFA的靈敏 度、動(dòng)態(tài)范圍和量化的熱對(duì)比測(cè)定系統(tǒng)。
[0027] 本發(fā)明還包括試劑盒，其中所述試劑盒包括這里所述的熱對(duì)比讀取器和測(cè)定系 統(tǒng)?？梢酝ㄟ^(guò)終端用戶使用所述試劑盒以使用測(cè)定系統(tǒng)處理所需樣品，然后使用熱對(duì)比讀 取器檢測(cè)目標(biāo)分析物和/或目標(biāo)分析物的量。試劑盒可以包括與使用所述試劑盒相關(guān)的指 令。
[0028] 本發(fā)明總體上涉及納米顆粒的激光激發(fā)，然而應(yīng)認(rèn)識(shí)到電磁激發(fā)的其它實(shí)施例也 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這里所指的納米顆粒的激光（或光）激發(fā)是指激發(fā)納米顆粒以產(chǎn)生能 夠由紅外或其它熱傳感器讀取的熱，應(yīng)理解其它實(shí)施例也是有可能的并仍在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。將與傳感器輸出相耦接的診斷電路配置為根據(jù)傳感器輸出提供對(duì)患者的診斷狀況的診 斷輸出指示。
[0029] 可以將這里所述的測(cè)定系統(tǒng)用于使用與分析物結(jié)合分子綴合的納米顆粒，檢測(cè)樣 品中的目標(biāo)分析物。具體地，可以有效地使用測(cè)定中的納米顆粒，將輸入光轉(zhuǎn)換為熱。在測(cè) 定中，將膜與可能包含分析物的樣品相接觸。當(dāng)樣品移動(dòng)通過(guò)所述膜時(shí)（通常由于毛細(xì)管 作用），與分析物結(jié)合分子綴合的納米顆粒結(jié)合目標(biāo)分析物以形成納米顆粒/分析物絡(luò)合 物。這里所用的"納米顆粒/分析物絡(luò)合物"是指與分析物結(jié)合分子綴合的納米顆粒，所述 分析物結(jié)合分子已經(jīng)結(jié)合了來(lái)自樣品的分析物。納米顆粒/分析物絡(luò)合物繼續(xù)移動(dòng)通過(guò)所 述膜，移向包含結(jié)合所需分析物的捕獲分子的測(cè)試區(qū)域。通過(guò)捕獲分子結(jié)合納米顆粒/分 析物絡(luò)合物，并將其保留在測(cè)試區(qū)域。然后可以將這里所述的熱對(duì)比讀取器用于檢測(cè)存在 或不存在所述分析物。此外，熱對(duì)比讀取器還可以量化在測(cè)試區(qū)域中存在的分析物（即，樣 品）的量。熱對(duì)比讀取器通常包括熱源和如下文所述配置的熱傳感器。
[0030] 測(cè)定系統(tǒng)（即，LFA)通常包括：樣品墊；膜；納米顆粒，與分析物結(jié)合分子綴合；以 及針對(duì)分析物的捕獲分子。LFA系統(tǒng)還可以包括：綴合墊；吸收墊；背襯墊；測(cè)試區(qū)域；對(duì)照 區(qū)域；和/或所有這些組件的組合。測(cè)試區(qū)域通常包括分析物捕獲分子。對(duì)照區(qū)域可以包 括例如對(duì)照抗體等對(duì)照分子。綴合墊通常包括與分析物結(jié)合分子綴合的納米顆粒。
[0031] 這里所用的"膜"是指使用膜和一個(gè)或多個(gè)試劑檢測(cè)樣品中的目標(biāo)分析物的測(cè)試 設(shè)備或試條?？梢钥商鎿Q地使用"膜"和"測(cè)試試條"。
[0032] 可以結(jié)合熱對(duì)比讀取器使用的測(cè)定包括側(cè)向流測(cè)定。用于執(zhí)行側(cè)向流測(cè)定的多 種配置在本領(lǐng)域是公知的，例如在Kaylor等人的美國(guó)專利公開US 2003/0119202和Mehra 等人的美國(guó)專利公開NO.US2010/0136566中描述了所述配置，通過(guò)引用將所述專利合并于 此。圖1示出了一個(gè)示例實(shí)施例，用于執(zhí)行側(cè)向流測(cè)定的其它配置是本領(lǐng)域所公知的，并也 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0033] 圖1是示出了根據(jù)本發(fā)明的側(cè)向流測(cè)定測(cè)試和讀取系統(tǒng)98的示例實(shí)施例的簡(jiǎn)化 圖。測(cè)試試條100包括樣品墊102,配置為接收來(lái)自患者的樣品104。毛細(xì)管作用導(dǎo)致樣品 104從樣品墊102沿箭頭所示方向向吸收墊108流動(dòng)。樣品104流經(jīng)綴合墊110并流經(jīng)膜 112,直到到達(dá)測(cè)試區(qū)域114。還提供了分離的對(duì)照區(qū)域116。測(cè)試試條100、樣品墊102、吸 收墊108、綴合墊110、測(cè)試區(qū)域114和對(duì)照區(qū)域116都是流體連通的。這里所述的"流體連 通"是指液體在所述材料或表面之間流動(dòng)或行進(jìn)的能力。
[0034] 如圖1的插圖所示，測(cè)試區(qū)域的示例實(shí)施例可以包括與在測(cè)試區(qū)域114處和抗原 相結(jié)合的單克隆抗體關(guān)聯(lián)的金納米顆粒?？梢酝ㄟ^(guò)施加能量120引起測(cè)試區(qū)域114發(fā)熱， 來(lái)確定結(jié)合在測(cè)試區(qū)域114內(nèi)的結(jié)合金納米顆粒的量。針對(duì)測(cè)試區(qū)域114的熱傳感器122 測(cè)量測(cè)試區(qū)域114的發(fā)熱，所述發(fā)熱與納米顆粒的量相關(guān)，從而與測(cè)試區(qū)域114中存在的抗 原的量相關(guān)。如下文詳細(xì)所述，可以將這種方法用于診斷患者的狀況。能量120可以是引 起測(cè)試區(qū)域114發(fā)熱的任何形式的能量。可以將能量源120和傳感器122容納在一個(gè)單元 中。備選地,可以分離地容納能量源120和傳感器122。
[0035] 在如圖1插圖所述的實(shí)施例中，將分析物結(jié)合分子和捕獲分子示出為單克隆抗 體。分析物結(jié)合分子和捕獲分子可以是相同類型的分子，即，抗體。在這種情況下，優(yōu)選地， 它們?cè)诓煌课唤Y(jié)合分析物，換言之，分析物結(jié)合分子和捕獲分子優(yōu)選地不結(jié)合分析物的 相同部位或表位。備選地，分析物結(jié)合分子和捕獲分子可以是兩種不同分子，但是二者能夠 在不同部位結(jié)合分析物。
[0036] 在上述示例實(shí)施例中，在將試條浸入臨床標(biāo)本或與臨床標(biāo)本相接觸之后，涂覆抗 體的GNP由于毛細(xì)管作用在硝化纖維素試條內(nèi)移動(dòng)。當(dāng)存在目標(biāo)抗原時(shí)，目標(biāo)抗原與涂覆 單克隆抗體的GNP相結(jié)合。當(dāng)通過(guò)膜上識(shí)別抗原-抗體-GNP絡(luò)合物的抗體將這種結(jié)合絡(luò) 合物捕獲時(shí)，結(jié)合絡(luò)合物停止通過(guò)毛細(xì)作用在"量桿"上移動(dòng)。這導(dǎo)致在LFA測(cè)試區(qū)域114 處累積GNP，產(chǎn)生陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果。由于GNP的尺寸可以設(shè)計(jì)為遷移通過(guò)膜112的孔，可以方 便地向GNP涂覆抗體，以及GNP與可見(jiàn)光具有強(qiáng)烈地反應(yīng)，從而產(chǎn)生便于可視化的深色，因 此將GNP用于LFA?？梢詫⑴c其它光波長(zhǎng)的光具有強(qiáng)烈反應(yīng)的GNP用于熱對(duì)比檢測(cè)，例如， 在近紅外下具有最大光吸收的金納米棒。
[0037] 圖2A是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例實(shí)施例的便攜式測(cè)定讀取器200的簡(jiǎn)化框圖。讀 取器200包括在其中具有開口 204的殼體202,配置為在狹槽或支架206中接收LFA 100。 在圖2A中，激光220產(chǎn)生導(dǎo)向LFA 100的測(cè)試區(qū)域中的能量120。在圖2A中，能量可以是 例如可見(jiàn)光或近紅外光，使用備選的透鏡222將光聚焦于測(cè)試區(qū)域。如上所述，導(dǎo)向納米顆 粒的可見(jiàn)光或近紅外光可以引起納米顆粒發(fā)熱。使用例如紅外傳感器的傳感器122對(duì)其進(jìn) 行檢測(cè)?？梢詫y(cè)試結(jié)果顯示在顯示器230上,顯示器230可以包括例如IXD顯示器。顯 示器可以提供定量輸出或定性輸出，例如，簡(jiǎn)單的通過(guò)/失敗指示。提供了備選的用戶輸入 232。例如，所述輸入可以是允許操作員發(fā)起測(cè)試的單個(gè)按鈕，或可以是更復(fù)雜的輸入，例如 數(shù)字鍵盤或具有數(shù)字鍵盤，所述數(shù)字鍵盤允許操作員更新參數(shù)，例如，由設(shè)備200使用的閾 值。所述輸入232可以是顯示器230上的覆層，以提供觸摸屏。
[0038] 如下文所詳述，通過(guò)電子電路240控制設(shè)備200的操作。例如，所述設(shè)備可以包括 微處理器、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、I/O電路等。提供了電源242。優(yōu)選地，電源242是便攜式電源，例 如，電池等。備選地，可以通過(guò)與其它電源的連接或使用太陽(yáng)能電池等，來(lái)對(duì)所述電源進(jìn)行 再充電。
[0039] 附加地，設(shè)備200包括如下文所詳述的輸入/輸出（I/O)電路310。I/O電路310 允許將設(shè)備200收集的數(shù)據(jù)傳輸或提供給其它設(shè)備。例如，可以收集并向中心位置或云服 務(wù)器發(fā)送測(cè)試結(jié)果，以便進(jìn)行后續(xù)評(píng)估。
[0040] 圖2B是以"臺(tái)式"結(jié)構(gòu)配置的測(cè)定讀取器200的簡(jiǎn)化框圖。在圖2B的配置中，標(biāo) 識(shí)為PC的計(jì)算機(jī)用于執(zhí)行測(cè)試。PC 260通過(guò)I/O電路262耦接到激光器220和紅外傳感 器122。例如，I/O電路262可以包括數(shù)模轉(zhuǎn)換器、模數(shù)轉(zhuǎn)換器、可切換輸出等。典型地，圖 2B所示的PC 260的計(jì)算能力比便攜式設(shè)備中可用的計(jì)算能力強(qiáng)。這樣可以允許執(zhí)行附加 測(cè)試或更高級(jí)的測(cè)試。
[0041] 盡管可以采用任何合適的組件，然而在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述源220包括激光 器，例如，532nm綠色激光器（即，LRS-0532-PFM_00200-03,LaserGlow Technologies Inc)。 聚焦光學(xué)器件222可以包括例如平凸式聚焦透鏡。適合的紅外傳感器包括紅外攝像機(jī)（A20 或E30, FLIR Inc)或紅外傳感器（MLX90614, Melexis)。然而，本發(fā)明不限于這種配置。 [0042] 圖3是設(shè)備200的簡(jiǎn)化框圖，包括根據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器302中的指令進(jìn)行操作的微 處理器300。微處理器300通過(guò)激活能量源電源302來(lái)控制能量源220。通過(guò)向模數(shù)轉(zhuǎn)換 器304提供輸出的熱傳感器122檢測(cè)LFA(圖3未示出）的發(fā)熱。提供了可選的試條傳感 器306。可以將試條傳感器306配置為檢測(cè)狹槽206中是否存在LFA 100,從而允許微控制 器300激活能量源220并開始測(cè)試。
[0043] 圖3示出了與電源242相連的可選的再充電電路308。這可以允許例如使用外部 電源、太陽(yáng)能電池、機(jī)械曲柄等,對(duì)電源242進(jìn)行再充電。
[0044] 輸入/輸出電路310還示出為與微處理器300相耦接。這可以包括任何類型的輸 入或輸出設(shè)備，包括顯示器、鍵盤或手動(dòng)輸入、音頻輸出、數(shù)字輸出，例如USB或Ethernet連 接、RF (射頻）或IR(紅外）輸入和/或輸出、蜂窩數(shù)據(jù)連接、Ethernet連接等。示例RF連 接包括但不限于BLUETOOTH?連接，或其它短距離通信技術(shù)、WIFI連接等。蜂窩電話 連接允許設(shè)備使用蜂窩電話網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行通信，以傳輸數(shù)據(jù)和/或提供可選語(yǔ)音通信。所述數(shù) 據(jù)可以包括測(cè)試結(jié)果和地理信息（GPS位置），以收集關(guān)于傳染病的時(shí)空信息。
[0045] 使用I/O 310允許將通過(guò)設(shè)備200收集的數(shù)據(jù)發(fā)送到其它位置。例如，當(dāng)在現(xiàn)場(chǎng) 使用時(shí)，設(shè)備200可以將測(cè)試結(jié)果回傳到中心數(shù)據(jù)庫(kù)?？梢酝ㄟ^(guò)任何適合的技術(shù)來(lái)進(jìn)行這 種傳輸。例如，可以通過(guò)Internet連接、經(jīng)由蜂窩網(wǎng)絡(luò)等來(lái)發(fā)送所述數(shù)據(jù)。所述連接可以 需要物理的有線連接或可以使用WIFI、Bluet 〇〇th等進(jìn)行無(wú)線連接。此外，I/O可以用于更 新存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器302中的信息。例如，可以更新編程指令、校準(zhǔn)信息或其它數(shù)據(jù)。I/O 310 還可以用于使用顯示器230和/或輸入232與遠(yuǎn)程的操作員進(jìn)行通信。
[0046] 在操作期間，將LFA 100(圖3未示出）置于殼體202中，例如，通過(guò)狹槽204(如 圖2所示）。由微處理器300響應(yīng)于來(lái)自試條傳感器306的信號(hào)或一些其它觸發(fā)（例如，使 用輸入/輸出電路310的手動(dòng)輸入），發(fā)起測(cè)試過(guò)程。在一個(gè)配置中，提供并通過(guò)微控制器 300控制可選步進(jìn)電機(jī)307。步進(jìn)電機(jī)307可以用于令LFA 100在設(shè)備200中的移動(dòng)自動(dòng) 化。如果需要監(jiān)控LFA 100在設(shè)備200中的位置，則可以使用多個(gè)試條傳感器306或其它 配置。微處理器300向能量源200施加電力，從而加熱LFA 100。通過(guò)傳感器122感測(cè)發(fā)熱 響應(yīng)，并使用模數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)換器304將發(fā)熱響應(yīng)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)?；谶@種數(shù)字化的信號(hào)，微 處理器300使用輸入/輸出電路310提供指示測(cè)試結(jié)果的輸出。
[0047] 此外，圖3示出了反饋傳感器303,布置在源220的路徑中以便感測(cè)所施加的能量 的強(qiáng)度。通過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器305將來(lái)自反饋傳感器303的輸出提供給處理器300。例如，傳感 器303可以是用于感測(cè)來(lái)自激光器220的輸出的強(qiáng)度的光傳感器?？梢詫⒃撔畔⒂糜谛?zhǔn) 所述設(shè)備的操作并校準(zhǔn)感測(cè)的熱量。此外，可以將反饋用于診斷目的，以便檢測(cè)輸出微弱信 號(hào)或完全失靈的源220
[0048] 由微處理器使用存儲(chǔ)器302,以短期或長(zhǎng)期存儲(chǔ)信息。例如，可以將設(shè)備200的尋 址信息320存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器302中。所述地址可以是例如唯一識(shí)別或半唯一識(shí)別設(shè)備200的 地址，可以包括但不限于互聯(lián)網(wǎng)協(xié)議（IP)地址、Mac地址或其它地址格式。還可以將存儲(chǔ)器 302用于存儲(chǔ)校準(zhǔn)信息，所述校準(zhǔn)信息可以用于校準(zhǔn)從傳感器122接收到的數(shù)據(jù)。可以以 多種方式確定校準(zhǔn)信息，例如包括：在制造設(shè)備期間使用電路310的輸入，或基于使用LFA 100 (例如，使用圖1所示的校準(zhǔn)區(qū)域116)執(zhí)行的校準(zhǔn)。這種校準(zhǔn)信息可以向由傳感器122 提供的讀數(shù)提供基線或其他類型的偏移。存儲(chǔ)器302還包括用于控制微處理器300的操作 的操作指令324。
[0049] 圖4A和4B是示出了當(dāng)施加能量120時(shí)LFA 100的發(fā)熱響應(yīng)Ts的圖。發(fā)熱量到 達(dá)由Rm指示的最大值。此外，如圖4A和4B所示，所述響應(yīng)的斜率開始成最陡上升，緩慢地 平穩(wěn)到最大等級(jí)R M。微處理器300通過(guò)分析對(duì)所施加能量信號(hào)的發(fā)熱響應(yīng)而操作為診斷電 路。例如，可以使用簡(jiǎn)單的閾值等級(jí)，其中將最大響應(yīng)與閾值等級(jí)進(jìn)行比較?？梢詫⑵涮峁?為輸出，例如，基于比較的"通過(guò)/失敗"輸出。此外，可以基于最大響應(yīng)等級(jí)來(lái)提供定量輸 出。這種定量輸出可以示出在測(cè)試位置114(圖1所示）處捕獲到的金納米顆粒的量。這 可以與抗原的量相關(guān)，從而與患者內(nèi)疾病的進(jìn)度相關(guān)。
[0050] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，診斷是基于響應(yīng)的輪廓的。例如，如圖4A和4B所示，示出 了響應(yīng)的初始斜率?；谒龀跏夹甭?，有可能外推R m的值，而不必允許加熱到所述最大 值?？梢詫⑦@種技術(shù)用于加快測(cè)試過(guò)程的速度。此外，還可以將所述信息用于驗(yàn)證傳感器 122檢測(cè)到的R m值。例如，如果外推出的RM值明顯不同于測(cè)量的RM值，則可能指示了組件 故障、測(cè)試試條受損或測(cè)量中的一些其它誤差。此外，如上所述，校準(zhǔn)信息可以用于改善測(cè) 量的準(zhǔn)確度。例如，校準(zhǔn)信息可以提供基線響應(yīng)，基線響應(yīng)與所述響應(yīng)信號(hào)比較。因此，可 以基于校準(zhǔn)信息調(diào)整響應(yīng)閾值等級(jí)。
[0051] 能量源220可以是任何適合的能量源。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，能量源220包括激 光器。在本領(lǐng)域中公知的多種激光器用作熱源，所述多種激光器可以是例如連續(xù)波激光器、 脈沖波激光器或尺寸縮小的激光器?？梢酝ㄟ^(guò)使用更高功率的激光器和/或針對(duì)不同濃度 的GNP調(diào)諧激光功率以便擴(kuò)展動(dòng)態(tài)范圍，來(lái)增加熱對(duì)比靈敏度。激光器可以發(fā)射可見(jiàn)范圍 中的光。還可以使用發(fā)射近紅外區(qū)域的光的激光器。通常，選擇并調(diào)諧激光器，以最大化納 米顆粒中的吸收，同時(shí)最小化來(lái)自背景材料的干涉?？梢愿淖?cè)贚FA系統(tǒng)中使用的激光功 率的量，所述激光功率的量取決于測(cè)定的成分。在示例實(shí)施例中，激光功率在大約5W和50W 之間（連續(xù)波激光器）。然而可以在其它實(shí)施例中使用更高或更低的能量等級(jí)。例如，脈沖 激光器內(nèi)可以施加更低的總能量但是更高的能量密度。由于下文所述背景吸收的降低，可 以使用更高的激光功率，以進(jìn)一步改善靈敏度和信號(hào)強(qiáng)度。
[0052] 通常，膜和背襯包括具有最小光吸收的材料。背景發(fā)熱限制了使用更高能量來(lái)獲 得更高信號(hào)強(qiáng)度的能力。通過(guò)選擇具有最小光吸收的材料，可以降低背景熱讀數(shù)，以確保熱 檢測(cè)來(lái)自于測(cè)試區(qū)域中的納米顆粒，而不是來(lái)自測(cè)定系統(tǒng)的材料。LFA系統(tǒng)中的膜通常是包 含多個(gè)空隙或孔的多孔材料。通常，液體可以由于毛細(xì)管作用流經(jīng)這些空隙或孔。多孔材 料可以由自然物質(zhì)或合成物質(zhì)構(gòu)成。在LFA系統(tǒng)中使用的適合多孔材料可以包括例如硝化 纖維素、聚偏二氟乙烯（PVDF)、聚乙烯、尼龍、醋酸纖維素、聚酯、聚醚砜（PES)、聚砜等。優(yōu) 選實(shí)施例使用具有最小光吸收的膜。還可以使用本領(lǐng)域公知的其它多孔材料。多種背襯在 本領(lǐng)域是公知的，主要提供對(duì)LFA的結(jié)構(gòu)支撐。為了熱對(duì)比檢測(cè)，具有最小光吸收的材料優(yōu) 選為這里所述LFA的背襯。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，背襯可以由玻璃或塑料（例如，聚苯乙 烯）構(gòu)成。樣品墊可以由多種材料制成，例如包括聚酯、聚丙烯酸、其他聚合材料或玻璃纖 維。綴合墊和吸收墊可以由例如纖維素材料等構(gòu)成。
[0053] 金屬納米顆粒在受到光學(xué)激發(fā)時(shí)產(chǎn)生熱。該產(chǎn)生熱是由于在從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的躍 遷期間金屬介質(zhì)界面處的表面等離子體導(dǎo)致的?？梢酝ㄟ^(guò)下式描述由GNP產(chǎn)生的熱量：
[0054] Q = NQnano= NC absI 式⑴其中總發(fā)熱（Q，w/m3)是單個(gè) GNP (QnaJ (寫為 GNP 濃度（N，#/m3)、GNP吸收截面面積（m2)和激光強(qiáng)度（W/m 2)的乘積）的組合貢獻(xiàn)。
[0055] 納米顆?？梢园ǘ喾N材料、形狀和尺寸。納米顆粒可以是金納米顆粒、銀納米顆 粒、銅納米顆粒、鉬納米顆粒、錯(cuò)納米顆粒、鎘納米顆粒、合成顆粒（即，銀和金）、石墨烯納 米顆粒等。在優(yōu)選實(shí)施例中，LFA測(cè)定系統(tǒng)包括金納米顆粒。還可以采用其他類型的納米 顆粒，且仍在本說(shuō)明的范圍內(nèi)。在備選實(shí)施例中，可以使用兩個(gè)或多個(gè)類型的納米顆粒的組 合。納米顆粒的組合可以用于識(shí)別多種分析物，或放大或增強(qiáng)信號(hào)。
[0056] 納米顆?？梢园ǘ喾N尺寸，通常納米顆粒必須能夠通過(guò)膜。優(yōu)選地，納米顆粒的 直徑的范圍可以從IOnm到200nm。對(duì)納米顆粒尺寸的選擇和優(yōu)化部分地取決于能量吸收。 對(duì)于將激光器作為能量源并具有金納米顆粒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所謂的等離子體共振的物 理現(xiàn)象增強(qiáng)了光學(xué)吸收效率，因此增強(qiáng)了熱產(chǎn)生?？梢允褂弥睆礁哌_(dá)約IOOnm的金納米顆 粒。更大尺寸是可用的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)也可以使用并包括更大尺寸。在一些實(shí)施 例中，尺寸大約為40-80nm的GNP具有較高的吸收效率（定義為Q abs= C abs/A，其中Cabs是 吸收橫截面面積，A是顆粒的投影橫截面面積），因此，從產(chǎn)生熱的角度，所述尺寸的GNP是 優(yōu)選的。
[0057] 可以在這里所述的LFA系統(tǒng)中使用多種形狀的納米顆粒，都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 納米顆?？梢允抢缂{米球、納米棒、納米殼、納米立方體、納米膽體、納米棱錐體、納米星 形體等。在優(yōu)選實(shí)施例中，納米顆粒是納米球、納米棒和/或納米殼。可以使用這些形狀 的納米顆粒中的任何納米顆粒。具有最高光學(xué)吸收效率的納米顆粒是優(yōu)選的，所述最高光 學(xué)吸收效率相對(duì)其他特性在測(cè)定中發(fā)揮作用。對(duì)于具有非球形的顆粒，可以使用有效半徑 (具有等同體積的球體）來(lái)計(jì)算吸收效率。
[0058] 如針對(duì)CrAg和hCG量桿的圖12A-C和13所示，不好控制在現(xiàn)有LFA中使用的GNP 的多分散性。對(duì)多分散性的更好控制導(dǎo)致更均勻的納米顆粒尺寸分布。這可以導(dǎo)致熱對(duì)比 檢測(cè)的更小標(biāo)準(zhǔn)偏差，因此，改善了信號(hào)穩(wěn)定性和一致性。更均勻的納米顆粒還可以給予更 高的光學(xué)吸收并熱產(chǎn)生。例如，具有不同尺寸的GNP在不同波長(zhǎng)處具有峰值吸收。對(duì)于多分 散的GNP群體，較少的GNP將在峰值吸收波長(zhǎng)處產(chǎn)生熱，因此，降低了所產(chǎn)生的熱的量。在 納米顆粒的樣品中，與納米顆粒簇相比，良好分散的均勻尺寸的納米顆粒是優(yōu)選的。納米顆 粒的簇集會(huì)導(dǎo)致納米顆粒的更不均勻的吸收?？蛇x地，可以對(duì)納米顆粒進(jìn)行涂覆以便降低 簇集，從而增加吸收的均勻性。如果存在涂層，則優(yōu)選地，所述涂層不降低納米顆粒內(nèi)的吸 收能力。
[0059] 納米顆粒的尺寸分布可以改變。在一些實(shí)施例中，至少大約60%的納米顆粒在納 米顆粒的平均直徑的+/-IOnm的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，至少大約70%的納米顆粒在納米顆粒的 平均直徑的+/_5nm的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，至少大約70%的納米顆粒在納米顆粒的平均直徑 的+/-3nm的范圍內(nèi)。再優(yōu)選地，至少大約75%的納米顆粒在納米顆粒的平均直徑的+/-3nm 的范圍內(nèi)。這些范圍外的納米顆粒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0060] 可以根據(jù)具體測(cè)定、具體納米顆粒、分析物結(jié)合分子等，改變LFA系統(tǒng)中使用的納 米顆粒的量或濃度。通常，納米顆粒的量可以大約在I-IOOyg的量級(jí)上。還可以使用該范 圍外的納米顆粒，并仍在本發(fā)明的范圍內(nèi)。對(duì)于一個(gè)實(shí)施例，CrAg測(cè)定使用每LFA大約4 μ g GNP。根據(jù)結(jié)合分子的結(jié)合親和性、患者樣品中目標(biāo)分析物的濃度范圍以及其它因素，所用 的納米顆粒的量可以高于或低于指定范圍。
[0061] 可以確定多種樣品中的分析物，通?？梢允侨魏晤愋偷囊后w樣品。樣品可以是生 物樣品、化學(xué)樣品、環(huán)境樣品、食物樣品等。生物樣品可以包括例如血液、血漿、血清、尿液、 汗液、膽汁、腦脊液、糞便、陰道分泌物、唾液等。還可以分析其它生物樣品，并都在本發(fā)明的 范圍內(nèi)?？梢灾苯邮褂镁哂蟹治鑫锏臉悠罚蚴褂孟♂寗┫♂尵哂蟹治鑫锏臉悠?。稀釋劑 可以是多種溶液，通常是本領(lǐng)域所公知的。在示例實(shí)施例中，稀釋劑是鹽水溶液。
[0062] 可以使用本說(shuō)明書的方法和設(shè)備檢測(cè)多種分析物。目標(biāo)分析物可以是蛋白質(zhì)、多 肽、核酸、半抗原、化學(xué)物等。分析物還可以包括：治療性藥物，濫用藥物，激素，維生素，葡萄 糖蛋白質(zhì)，抗體，類固醇，細(xì)菌或細(xì)菌感染，真菌，病毒，寄生蟲，細(xì)菌的成分和產(chǎn)物、過(guò)敏原、 抗原等。分析物還可以包括感興趣化合物的衍生物或代謝物。
[0063] 在一些實(shí)施例中，分析物可以與疾病相關(guān)聯(lián)，例如，瘧疾、TB等。在其它實(shí)施例 中，分析物可以與生理或病理狀況相關(guān)聯(lián)，例如，妊娠。分析物的示例包括：隱球菌抗原 (CrAg)、瘧疾抗原、結(jié)核抗原、人體絨毛膜促性腺激素（hCG)、人類促黃體激素（hLH)、人促 卵泡激素（hFSF)、前列腺特異抗原（PSA)、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎抗體、HIV抗原、A族 鏈球菌、葡萄球細(xì)菌屬、STD、惡性瘧原蟲（P. Falciparum)、發(fā)熱板等。
[0064] 分析物結(jié)合分子和捕獲分子可以是能夠結(jié)合目標(biāo)分析物的任何分子。在一些實(shí)施 例中，分析物結(jié)合分子和捕獲分子是生物宏分子，例如，抗體或抗體的一部分。這些分子還 可以是受體、配體、多核苷酸、多肽、糖肽、脂蛋白質(zhì)、核蛋白質(zhì)、核苷酸、適體等。在一個(gè)示例 實(shí)施例中，所述分析物結(jié)合分子和捕獲分子是抗體。在一些實(shí)施例中，分析物結(jié)合分子與捕 獲分子相同。在其它實(shí)施例中，分析物結(jié)合分子與捕獲分子不同。
[0065] 用于將納米顆粒與分析物結(jié)合分子綴合或耦合的多種方法在本領(lǐng)域是公知技術(shù)， 所述多種方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通常，允許在高溫、高濕度或低濕度和/或輻射條件下改 善穩(wěn)定性的綴合化學(xué)是優(yōu)選的。化學(xué)結(jié)合是指使用將顆粒與分析物結(jié)合分子相鏈接的化學(xué) 官能團(tuán)和/或分子。一個(gè)示例是在顆粒表面上放置羧酸，以允許通過(guò)碳化二亞胺介導(dǎo)分子 與抗體上的胺基官能團(tuán)相鏈接。綴合可以包括被動(dòng)吸收。被動(dòng)吸收在本領(lǐng)域是公知的，例 如在US 2010/0136566中對(duì)其進(jìn)行了公開，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用合并與此。
[0066] 在本領(lǐng)域中公知多種液體調(diào)劑和噴灑技術(shù)，將捕獲分子沉積到膜。可以使用這些 技術(shù)中的任何技術(shù)，優(yōu)選的是引起捕獲分子更好吸收性和穩(wěn)定性的噴灑技術(shù)。還可以將與 分析物結(jié)合分子綴合的納米顆粒噴灑到綴合墊上。在示例實(shí)施例中，來(lái)自BioDotTM的多種 液體調(diào)劑儀器可以用于這些目的。
[0067] 本說(shuō)明書還包括檢測(cè)樣品中的分析物的方法。通過(guò)使用這里所述的熱對(duì)比技術(shù)， 可以明顯改善LFA分析靈敏度，可能大于視覺(jué)檢測(cè)方法的靈敏度的10, 000倍。
[0068] 所述方法包括：將樣品與樣品墊相接觸，允許液體由于毛細(xì)管作用流經(jīng)所述膜。與 分析物結(jié)合分子綴合的納米顆粒響應(yīng)于樣品應(yīng)用而通過(guò)毛細(xì)管作用在所述膜內(nèi)移動(dòng)。當(dāng)存 在目標(biāo)分析物時(shí)，目標(biāo)分析物與綴合的納米顆粒相結(jié)合。當(dāng)測(cè)試區(qū)域中的捕獲分子識(shí)別并 結(jié)合納米顆粒/分析物絡(luò)合物時(shí)，納米顆粒/分析物絡(luò)合物停止穿過(guò)所述膜。這導(dǎo)致在LFA 的測(cè)試區(qū)或區(qū)域處積累納米顆粒/分析物絡(luò)合物。所述方法還包括通過(guò)首先向例如激光器 的能量源暴露測(cè)試區(qū)域，然后通過(guò)傳感器測(cè)量從測(cè)試試條產(chǎn)生的熱量，來(lái)使用熱對(duì)比讀取 器檢測(cè)并量化測(cè)試區(qū)域中分析物的量。傳感器產(chǎn)生的輸出指示了是否存在目標(biāo)分析物和/ 或目標(biāo)分析物的量。
[0069] 所述方法還可以包括檢測(cè)多種分析物?？梢酝ㄟ^(guò)具有多個(gè)測(cè)試區(qū)域來(lái)檢測(cè)多種分 析物，其中每個(gè)測(cè)試區(qū)域具有不同的捕獲分子。因此，第一納米顆粒/分析物絡(luò)合物結(jié)合到 具有結(jié)合第一分析物的第一捕獲分子的測(cè)試區(qū)域1，其中第二納米顆粒/分析物絡(luò)合物結(jié) 合到具有結(jié)合第二分析物而不是第一分析物的第二捕獲分子的測(cè)試區(qū)域2。這樣，可以通過(guò) 配置為包括多個(gè)測(cè)試區(qū)域，來(lái)將LFA系統(tǒng)擴(kuò)展為識(shí)別多種分析物。還可以使用具有不同開 始位置的多種納米顆粒，檢測(cè)多種分析物。納米顆?？梢跃哂胁煌Y合以及不同的分析物 結(jié)合分子。這些納米顆?？梢哉{(diào)諧為不同地流經(jīng)所述膜。多種分析物可以在相同樣品或不 同樣品中。在一些實(shí)施例中，可以在相同測(cè)試區(qū)域中測(cè)試多種分析物。對(duì)多種分析物的檢 測(cè)導(dǎo)致識(shí)別對(duì)應(yīng)測(cè)試區(qū)域中的每種分析物，優(yōu)選地，分析物的定量數(shù)量。在一些實(shí)施例中， 還可以在一個(gè)測(cè)試區(qū)域中檢測(cè)和/或積累量化多種分析物。例如，使用在不同激光波長(zhǎng)處 進(jìn)行吸收的不同顆粒，這允許使用具有對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的激光激發(fā)進(jìn)行多路復(fù)用。
[0070] 所述方法還可以包括通過(guò)使用對(duì)不同納米顆粒的次級(jí)受控流動(dòng)，放大所述信號(hào)。 在一個(gè)示例實(shí)施例中，可以通過(guò)使用銀染色法或次級(jí)結(jié)合納米顆粒，放大來(lái)自具有主要金 納米顆粒的LFA的信號(hào)。在銀染色法的過(guò)程中，金納米顆?？梢宰鳛槌珊它c(diǎn)，以在表面上生 長(zhǎng)銀殼。在次級(jí)納米顆粒結(jié)合的過(guò)程中，次級(jí)納米顆粒結(jié)合到捕獲目標(biāo)分析物的第一顆粒， 以便放大信號(hào)。
[0071] 本方法還包括量化測(cè)試區(qū)域中存在的分析物的量。對(duì)膜的熱變化的測(cè)量可以與測(cè) 試區(qū)域中存在的分析物的量相關(guān)。有利地，LFA系統(tǒng)可以不僅提供存在或不存在分析物，而 且還提供在膜（因此，樣品）中存在的分析物的等級(jí)。這特別有利于確定患者的疾病、傳染 病或狀況的程度。
[0072] 在向能量源暴露測(cè)試區(qū)域之后，可以通過(guò)測(cè)量所述膜的測(cè)試區(qū)域內(nèi)的熱變化或溫 度，來(lái)檢測(cè)分析物的存在和分析物的量。備選地，還可以測(cè)量溫度變化的初始速率，以確定 吸收率（SAR)。SAR可以用于確定測(cè)試區(qū)域中存在的分析物的量。SAR實(shí)際上是上式1中 的Q。它涉及當(dāng)通過(guò)例如激光器的能量源對(duì)納米顆粒進(jìn)行激發(fā)時(shí)納米顆粒發(fā)出的熱能的量 (W/m 3)。如式1所示，它與激光能量密度和納米顆粒的數(shù)目成正比，所述納米顆粒的數(shù)目直 接涉及分析物中抗原的量。
[0073] 除了改善分析靈敏度之外，還可以對(duì)LFA進(jìn)行存檔以便將來(lái)分析。不同于其他檢 測(cè)方法，使用熱對(duì)比系統(tǒng)不存在信號(hào)損失。在熒光測(cè)量中，有機(jī)熒光團(tuán)經(jīng)歷光漂白。一些色 度測(cè)量中，染料可能由于光化裂解而隨著時(shí)間失去它們的信號(hào)。在執(zhí)行測(cè)定的兩個(gè)星期之 后進(jìn)行的熱對(duì)比讀數(shù)可能幾乎相同。有利地，這允許在現(xiàn)場(chǎng)處理醫(yī)療點(diǎn)LFA，并安排到中心 實(shí)驗(yàn)室，針對(duì)熱對(duì)比讀數(shù)來(lái)處理相同LFA系統(tǒng)。換言之，不必在樣品運(yùn)行之后立即測(cè)量分析 物信號(hào)?？梢远啻螠y(cè)量信號(hào)，例如，在完成測(cè)定之后立即測(cè)量并且在隨后的時(shí)間測(cè)量。所述 方法還可以包括向能量源暴露測(cè)試區(qū)域，在將測(cè)定試條與樣品接觸后12小時(shí)、24小時(shí)或更 長(zhǎng)時(shí)間之后，測(cè)量測(cè)試區(qū)域中的分析物。
[0074] 隱球菌病是所有AIDS相關(guān)機(jī)會(huì)性傳染中死亡的主要原因之一，并且是在非洲成 年人患腦膜炎的最常見(jiàn)原因，每年在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致多于500, 000人死亡。通常通過(guò)培養(yǎng) 液、墨汁或CrAg測(cè)試的組合（連續(xù)兩倍稀釋）（即，CrAg滴定度，定義為當(dāng)執(zhí)行兩倍連續(xù)稀 釋時(shí)最末的陽(yáng)性測(cè)試）半定量地診斷隱球菌性腦膜炎。
[0075] 本說(shuō)明書包括用于檢測(cè)和量化CrAg抗原的方法。所述方法包括：將樣品與樣品墊 相接觸，允許液體由于毛細(xì)管作用流經(jīng)膜。與CrAg結(jié)合分子綴合的納米顆粒響應(yīng)于施加樣 品，通過(guò)毛細(xì)管作用在所述膜內(nèi)移動(dòng)。當(dāng)存在CrAg時(shí)，CrAg與綴合的納米顆粒相結(jié)合。當(dāng) 測(cè)試區(qū)域中的捕獲分子識(shí)別并結(jié)合納米顆粒/CrAg絡(luò)合物時(shí)，納米顆粒/CrAg絡(luò)合物停止 穿過(guò)所述膜。這樣導(dǎo)致在LFA的測(cè)試區(qū)域處積累納米顆粒/CrAg絡(luò)合物?？梢酝ㄟ^(guò)首先向 例如激光器的能量源暴露測(cè)試區(qū)域，然后通過(guò)熱傳感器測(cè)量從測(cè)試試條產(chǎn)生的熱，來(lái)將所 述熱對(duì)比系統(tǒng)用于檢測(cè)并量化測(cè)試區(qū)域中CrAg的量。
[0076] 圖6示出了與色度檢測(cè)相比，熱對(duì)比產(chǎn)生32倍的分析靈敏度提高，其中對(duì)數(shù)線性 斜率高達(dá)通過(guò)乳膠凝集（R 2 = 0. 98)產(chǎn)生的等同濃度為1 : 1024的CrAg滴定度。在所述 1 : 1024滴定度以上，存在大劑量"鉤狀"效應(yīng)，降低了視覺(jué)強(qiáng)度以及熱強(qiáng)度到達(dá)平穩(wěn)狀態(tài)。 可以通過(guò)改變對(duì)測(cè)定的稀釋或改變測(cè)定的工程，來(lái)克服這個(gè)問(wèn)題。此外，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化這 些納米顆粒的尺寸以便降低方差系數(shù)，來(lái)改善測(cè)定的測(cè)定間精度。為了進(jìn)行比較，在具有隱 球菌腦膜炎的患者中觀察到的中值CrAg滴定度通常為1 : 1024到1 : 2048。然而，盡管 有HIV治療，對(duì)于CrAg滴定度>1 : 8,在具有亞臨床疾病（以100%靈敏度和96%特異性， 預(yù)示后來(lái)發(fā)展為隱球菌腦膜炎）的無(wú)體征患者中，存在大約幾個(gè)星期到幾個(gè)月的亞急性潛 伏期。在具有晚期AIDS的人群中進(jìn)行血清CrAg篩查和預(yù)防性的抗真菌治療防止朝著癥狀 性腦膜炎的臨床進(jìn)展。由于在尿液中可檢測(cè)CrAg，因此有可能進(jìn)行非侵入性篩查，然而尿液 比血液中CrAg的濃度低22倍。因此，通過(guò)熱對(duì)比改善LFA靈敏度，這可以實(shí)現(xiàn)對(duì)AIDS的 無(wú)體征患者的非侵入性篩查，量化CrAg負(fù)擔(dān)以便進(jìn)行危險(xiǎn)分層的能力。
[0077] 本說(shuō)明書包括用于檢測(cè)和量化hCG抗原的方法。所述方法包括：將樣品與樣品墊 相接觸，允許液體由于毛細(xì)管作用流經(jīng)膜。與hCG結(jié)合分子綴合的納米顆粒響應(yīng)于施加樣 品，通過(guò)毛細(xì)管作用在所述膜內(nèi)移動(dòng)。當(dāng)存在hCG時(shí)，hCG與綴合的納米顆粒相結(jié)合。當(dāng)測(cè) 試區(qū)域中的捕獲分子識(shí)別并結(jié)合納米顆粒/hCG絡(luò)合物時(shí)，納米顆粒/hCG絡(luò)合物停止穿過(guò) 所述膜。這樣導(dǎo)致在LFA的測(cè)試區(qū)域處積累納米顆粒/hCG絡(luò)合物?？梢酝ㄟ^(guò)首先向例如 激光器的能量源暴露測(cè)試區(qū)域，然后通過(guò)熱傳感器測(cè)量從測(cè)試試條產(chǎn)生的熱，來(lái)將所述熱 對(duì)比系統(tǒng)用于檢測(cè)并量化測(cè)試區(qū)域中hCG的量。
[0078] 本說(shuō)明書包括用于檢測(cè)和量化瘧疾抗原的方法。所述方法包括：將樣品與樣品墊 相接觸，允許液體由于毛細(xì)管作用流經(jīng)膜。與瘧疾抗原結(jié)合分子綴合的納米顆粒響應(yīng)于施 加樣品，通過(guò)毛細(xì)管作用在所述膜內(nèi)移動(dòng)。當(dāng)存在瘧疾抗原時(shí)，瘧疾抗原與綴合的納米顆粒 相結(jié)合。當(dāng)測(cè)試區(qū)域中的捕獲分子識(shí)別并結(jié)合納米顆粒/瘧疾抗原絡(luò)合物時(shí)，納米顆粒/ 瘧疾抗原絡(luò)合物停止穿過(guò)所述膜。這樣導(dǎo)致在LFA的測(cè)試區(qū)域處積累納米顆粒/瘧疾抗原 絡(luò)合物。可以通過(guò)首先向例如激光器的能量源暴露測(cè)試區(qū)域，然后通過(guò)熱傳感器測(cè)量從測(cè) 試試條產(chǎn)生的熱，來(lái)將所述熱對(duì)比系統(tǒng)用于檢測(cè)并量化測(cè)試區(qū)域中瘧疾抗原的量。
[0079] 本說(shuō)明書包括用于檢測(cè)和量化TB抗原的方法。所述方法包括：將樣品與樣品墊 相接觸，允許液體由于毛細(xì)管作用流經(jīng)膜。與TB抗原結(jié)合分子綴合的納米顆粒響應(yīng)于施加 樣品，通過(guò)毛細(xì)管作用在所述膜內(nèi)移動(dòng)。當(dāng)存在TB抗原時(shí)，TB抗原與綴合的納米顆粒相結(jié) 合。當(dāng)測(cè)試區(qū)域中的捕獲分子識(shí)別并結(jié)合納米顆粒/TB抗原絡(luò)合物時(shí)，納米顆粒/TB抗原 絡(luò)合物停止穿過(guò)所述膜。這樣導(dǎo)致在LFA的測(cè)試區(qū)域處積累納米顆粒/TB抗原絡(luò)合物?？?以通過(guò)首先向例如激光器的能量源暴露測(cè)試區(qū)域，然后通過(guò)熱傳感器測(cè)量從測(cè)試試條產(chǎn)生 的熱，來(lái)將所述熱對(duì)比系統(tǒng)用于檢測(cè)并量化測(cè)試區(qū)域中TB抗原的量。
[0080] 示例
[0081] 示例I-GNP的合成與分析
[0082] 金納米顆粒（GNP)合成：如Perault等和Neha等在Frens G.中所述（參照Frens G. Nat. Phys. Sci. 1973 ;Perrault, Steven D.等 Nano Letters 20099(5) 1909-1915 ;Neha B. Shah 等 Molecular Pharmaceutics20129 (8) 2146-2155)，通過(guò)氯金酸的還原法合成 30nm GNP，接著涂覆聚乙二醇（PEG)以保持水溶液中的穩(wěn)定性。通過(guò)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、原 子發(fā)光光譜、動(dòng)態(tài)光散射和TEM來(lái)執(zhí)行GNP的特征化，以確保成功合成并量化濃度和尺寸。 準(zhǔn)備滴定濃度的GNP水溶液，將每個(gè)溶液的10 μ L作為液滴轉(zhuǎn)移到載玻片。然后，用來(lái)自CW 激光器（532nm，Millennia Vs，二極管泵浦）的激光束照射液滴1分鐘，從而誘發(fā)GNP發(fā)熱。 在激光照射期間，安裝在樣品上方一定角度的紅外攝像機(jī)（FLIR ThermoVision? A20)遠(yuǎn)程 測(cè)量溫度改變。根據(jù)熱圖像確定并繪制每個(gè)樣品的最大溫度改變。
[0083] 將溶液中GNP的熱對(duì)比與視覺(jué)對(duì)比進(jìn)行比較。準(zhǔn)備一系列不同濃度的GNP。將 10 μ L的GNP溶液置于顯微鏡載片上。為了進(jìn)行視覺(jué)分析，通過(guò)數(shù)字?jǐn)z像機(jī)拍攝照片，隨后 用Image J對(duì)所述圖像進(jìn)行分析。為了進(jìn)行熱量分析，用激光（0· 5W，532nm)照射GNP溶液， 通過(guò)紅外攝像機(jī)記錄溫度變化。
[0084] 結(jié)果示出：相較于通過(guò)視覺(jué)對(duì)比的2. 5χ10η納米顆粒/mL，使用熱對(duì)比能夠檢測(cè)低 至2. 5x IO9納米顆粒/mL的GNP。這清楚地示出了熱對(duì)比檢測(cè)可以將整體分析靈敏度改善 100倍（圖5)。還將GNP的熱對(duì)比與使用標(biāo)準(zhǔn)微型酶標(biāo)儀的標(biāo)準(zhǔn)光密度測(cè)量（其原理廣泛 地用于微流體EL1SA)進(jìn)行比較。在相同樣品容量（10 μ L)的情況下，與光密度測(cè)量相比， 熱對(duì)比顯示出50倍的改善。通過(guò)使用較高功率的激光器和/或針對(duì)不同濃度的GNP調(diào)諧 激光功率以便擴(kuò)展熱對(duì)比的動(dòng)態(tài)范圍，有可能進(jìn)一步改善熱對(duì)比靈敏度。重要的是，還可以 通過(guò)調(diào)諧激光波長(zhǎng)以便更好地令納米顆粒（金納米棒）進(jìn)行吸收，增加靈敏度。
[0085] 示例2-檢測(cè)隱球菌抗原（CrAg)
[0086] 使用從I_y，Inc獲得的用于檢測(cè)隱球菌抗原（CrAg)的經(jīng)FDA批準(zhǔn)的LFA，檢測(cè) 熱對(duì)比相對(duì)于色度檢測(cè)（即，視覺(jué)對(duì)比）的分析性能，這在Qin等Angewandte Chemie 2012 中描述了。LFA的熱對(duì)比成像：隱球菌抗原LFA(Immy，Inc. Norman, 0K)，于2011年7月經(jīng) FDA批準(zhǔn)，檢測(cè)血清和腦脊液（CSF)中隱球菌物種絡(luò)合物（Cryptococcus neoformans和 Cryptococcus gatlii)的莢膜多糖抗原。對(duì)來(lái)自具有隱球菌腦膜炎患者的血清樣品進(jìn)行2 倍連續(xù)稀釋，以便評(píng)估檢測(cè)極限，作為CrAg滴定度。根據(jù)制造商的指示執(zhí)行所述測(cè)試。通 過(guò)用激光照射所述測(cè)試線1分鐘，來(lái)執(zhí)行熱對(duì)比。紅外攝像機(jī)記錄溫度變化。照射每個(gè)水 平測(cè)試帶上的三個(gè)點(diǎn)，測(cè)量平均最大溫度變化。在每個(gè)濃度下，操作三個(gè)單獨(dú)的LFA量桿。 圖6示出了所述結(jié)果。
[0087] 視覺(jué)對(duì)比量化：對(duì)于GNP小滴，通過(guò)數(shù)字?jǐn)z像機(jī)拍攝圖像。通過(guò)平板掃描儀（型 號(hào)：Visioneer Onetouch 7400)掃描所述量桿。分析感興趣區(qū)域（ROI)(即，小滴和量桿測(cè) 試帶）的平均灰度。還通過(guò)在530nm處由分光光度計(jì)連同Take3微型酶標(biāo)儀和Synergy HT 多模式微型酶標(biāo)儀（BioTek，Winooski，VT)，測(cè)量相同容量的GNP溶液（10 μ L)。
[0088] 將血清樣品LFA連續(xù)2倍稀釋的（通過(guò)乳膠凝集（Immy，Inc.)在I : 32768滴定 度處為陽(yáng)性）進(jìn)行比較。結(jié)果示出了熱對(duì)比確實(shí)比色度視覺(jué)檢測(cè)對(duì)LFA更敏感。圖6示出 了與色度檢測(cè)相比，熱對(duì)比產(chǎn)生改善了 32倍的分析靈敏度，其中對(duì)數(shù)線性斜率高達(dá)等同濃 度為1 : 1024的CrAg滴定度。在所述1 : 1024滴定度以上，存在大劑量"鉤狀"效應(yīng)，其 中降低視覺(jué)強(qiáng)度，熱量強(qiáng)度到達(dá)平穩(wěn)狀態(tài)。
[0089] 使用經(jīng)FDA批準(zhǔn)的隱球菌抗原（CrAg)LFA,看到通過(guò)熱對(duì)比將分析靈敏度改善了 32倍（圖6)，與此同時(shí)量化抗原濃度。在"具有讀取器的一次性RDT"模型中該增強(qiáng)的靈敏 度可以支持在資源有限的區(qū)域針對(duì)癥狀性和無(wú)體征CrAg+進(jìn)行CrAg篩查和量化，允許在先 前通過(guò)定性LFA未檢測(cè)到的患者中進(jìn)行有目標(biāo)的預(yù)防性抗真菌治療。
[0090] 示例3-改善LFA的分析靈敏度
[0091] 基于多種金納米顆粒（例如，棒、殼和球）的實(shí)驗(yàn)性測(cè)量的吸收橫截面面積，進(jìn)行 建模，以開發(fā)對(duì)LFA的分析靈敏度的進(jìn)一步改善。評(píng)估了包括金納米棒、納米殼和金納米 球的金納米顆粒。如圖7A所示，在等同激光功率和納米顆粒濃度的情況下，典型的納米棒 和納米殼相比于金納米球分別產(chǎn)生4. 6倍和36倍的熱。為了消除顆粒尺寸影響，通過(guò)顆粒 體積標(biāo)準(zhǔn)化吸收橫截面面積（Cabs),以對(duì)熱產(chǎn)生能力進(jìn)行更好的估計(jì)。用于進(jìn)行這種比較 的 GNP 的尺寸為：球 D = 30nm ;納米棒 D = 12. 7nm，L = 49. 5nm ;納米殼 DCOTe= 120nm(二 氧化娃），Dshell= 150nm(金）。標(biāo)準(zhǔn)化熱對(duì)比（ATsignal)和納米顆粒濃度。使用所述標(biāo)準(zhǔn) 化，在產(chǎn)生熱方面，金納米棒比金納米球和金納米殼的效率大約高一個(gè)量級(jí)（圖7A插圖）。 此外，目前的LFA(即，具有厚背襯材料的薄硝化纖維素膜）吸收大量激光能量（532nm)，產(chǎn) 生背景加熱或噪聲。因此，使用低吸收（即，高透射或反射）的背襯材料（例如，塑料或玻 璃），允許使用更高的激光強(qiáng)度（I)。基底吸收：用532nm激光照射空白的量桿以及塑料和 玻璃蓋玻片各1分鐘。通過(guò)紅外攝像機(jī)測(cè)量在激光照射期間的溫度變化并確定最大溫度改 變（參照?qǐng)D7B)。將較高吸收的納米顆粒和較低吸收的LFA背襯材料組合，這可以增加靈敏 度。應(yīng)注意，金納米棒與金納米球可以在不同的波長(zhǎng)下進(jìn)行有效吸收。
[0092] 可以通過(guò)將功率密度增加100倍（S卩，將激光功率從0. 01增加到1W)和使用吸收 率增加10倍（Cabs)的納米顆粒，來(lái)產(chǎn)生1000倍的熱對(duì)比增加。如上所述，可以通過(guò)降低背 景吸收來(lái)使用較高的激光功率。
[0093] 考慮到使用這里所述的改良示出的比視覺(jué)測(cè)試方法提高約10倍的改善，以及預(yù) 計(jì)相對(duì)視覺(jué)檢測(cè)方法的1000倍改善，可以將測(cè)定的分析靈敏度改善大約10, 〇〇〇倍。
[0094] 示例4-檢測(cè)hCG
[0095] 使用具有GNP的LFA來(lái)測(cè)試在樣品中hCG的存在（妊娠測(cè)試）。從Fi sher Scientific (Sure-Vue血清/尿液hCG測(cè)試試劑盒）購(gòu)買hCG LFA。
[0096] 如圖8A和8B所示，與視覺(jué)檢測(cè)相比，熱對(duì)比示出了對(duì)于hCG的存在的增強(qiáng)靈敏 度。使用熱對(duì)比示出了檢測(cè)極限的20倍提高。
[0097] 示例5-檢測(cè)痕疾
[0098] 還使用具有GNP的LFA來(lái)測(cè)試瘧疾抗原的存在。從Alere Inc (BinaxNOW?痕疾測(cè) 試）購(gòu)買瘧疾LFA。
[0099] 如圖9所示，與視覺(jué)檢測(cè)相比，熱對(duì)比示出了對(duì)于瘧疾抗原的存在的增強(qiáng)靈敏度。 使用熱對(duì)比示出了檢測(cè)極限的8倍提高。
[0100] 示例6-檢測(cè)TB
[0101] 使用具有GNP的LFA來(lái)測(cè)試TB的存在。Alere Inc (Determine?TB LAM快速測(cè)試） 制造TB LFA。結(jié)果示出在表格1中。熱對(duì)比度基于痰培養(yǎng)的參考標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)大多數(shù)的視覺(jué) 陰性的TB LFA( S卩，假陰性）。
[0102] 表格 1
[0103]

【權(quán)利要求】
1. 一種熱對(duì)比測(cè)定讀取器，包括：能量源；傳感器；I/O電路；W及開口，用于接收測(cè)定 試條；所述讀取器被配置為當(dāng)在測(cè)定試條的測(cè)試區(qū)域上激活能量源時(shí)將傳感器結(jié)果轉(zhuǎn)換為 輸出信號(hào)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的讀取器，其中所述能量源是激光器。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的讀取器，其中所述傳感器是紅外攝像機(jī)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的讀取器，其中所述測(cè)定試條的測(cè)試區(qū)域包括納米顆粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的讀取器，其中所述讀取器是臺(tái)式設(shè)備，將輸出信號(hào)顯示在臺(tái) 式設(shè)備的顯示器上。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的讀取器，其中所述讀取器是手持設(shè)備，將輸出信號(hào)顯示在手 持設(shè)備的顯示器上。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的讀取器，其中通過(guò)有線連接將所述輸出信號(hào)傳送到其它設(shè) 備。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的讀取器，其中通過(guò)無(wú)線連接將所述輸出信號(hào)傳送到其它設(shè) 備。
9. 一種測(cè)定試劑盒，包括： 測(cè)定系統(tǒng)，包括：樣品墊；測(cè)試試條；與分析物結(jié)合分子綴合的納米顆粒；測(cè)試區(qū)域；對(duì) 照區(qū)域；W及吸收墊，配置為當(dāng)施加樣品時(shí)進(jìn)行流體連通，W及 熱對(duì)比測(cè)定讀取器。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述納米顆粒包含銀、石墨帰、金及其組合。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述納米顆粒包括納米球、納米棒、納米殼及 其組合。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述測(cè)試試條包括硝化纖維素膜。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述熱對(duì)比讀取器系統(tǒng)包括能量源和傳感器。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述分析物是CrAg、TB抗原、hCG、拒疾抗原、 A族鏈球菌、葡萄球菌屬、STD、惡性拒原蟲、發(fā)熱板或其組合。
15. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述樣品是血液、血漿、尿液、唾液或其組合。
16. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述測(cè)試區(qū)域包括捕獲分子，其中所述測(cè)試區(qū) 域的捕獲分子與分析物結(jié)合分子相同。
17. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述測(cè)試區(qū)域包括捕獲分子，其中所述測(cè)試區(qū) 域的捕獲分子與和納米顆粒綴合的分析物結(jié)合分子不相同。
18. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中在一個(gè)測(cè)定系統(tǒng)中檢測(cè)多個(gè)不同分析物。
19. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中所述熱對(duì)比系統(tǒng)提供存在于樣品中的分析物 的定量數(shù)量。
20. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中能夠在施加樣品后至少約24小時(shí)之后，測(cè)量分 析物信號(hào)。
21. -種檢測(cè)樣品中的分析物的方法，包括： 在將測(cè)定系統(tǒng)的測(cè)試試條與樣品接觸之后，將測(cè)定系統(tǒng)中的測(cè)試試條的測(cè)試區(qū)域暴露 于能量源，其中所述樣品由于毛細(xì)管作用而移動(dòng)通過(guò)所述測(cè)試試條，所述測(cè)定系統(tǒng)包括：納 米顆粒，與結(jié)合樣品中的分析物的分析物結(jié)合分子綴合；W及測(cè)試區(qū)域，包括捕獲分子；W 及 通過(guò)傳感器測(cè)量在測(cè)試區(qū)域中產(chǎn)生的熱，w檢測(cè)測(cè)試區(qū)域中存在或不存在所述分析 物。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中檢測(cè)的分析物是CrAg、化抗原、hCG、拒疾抗原 或其組合。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述樣品是血液、尿液、唾液、血漿或其組合。
24. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中在一個(gè)測(cè)定系統(tǒng)中檢測(cè)多個(gè)不同分析物。
25. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述傳感器提供對(duì)存在于樣品中的分析物的定 量輸出。
26. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中不立即測(cè)量分析物信號(hào)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中通過(guò)使用銀放大來(lái)增強(qiáng)分析物信號(hào)。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK104471382SQ201380016094
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】約翰·C·比斯喬, 秦真鵬, 沃倫·錢, 塔涅爾·阿克 申請(qǐng)人:明尼蘇達(dá)大學(xué)董事會(huì)