賦予針對raf抑制劑的抗性的c-raf突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了具有突變體C-RAF序列的核酸和蛋白質(zhì)、鑒定有可能從聯(lián)合治療中獲益的患有癌癥的患者的方法、以及治療方法。
【專利說明】賦予針對RAF抑制劑的抗性的C-RAF突變體
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求于2012年3月28日遞交的美國臨時申請?zhí)?1/616，999和于2012年10月I日遞交的61/708，372的利益，其在此以全文引用的方式并入本文。
[0003]聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)
[0004]本發(fā)明受到政府資助，其由美國國立衛(wèi)生研究院授予，聯(lián)邦資助號DP2 0D002750。政府享有本發(fā)明的一定的權(quán)利。

【背景技術(shù)】
[0005]在50-70%的惡性黑素瘤中發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸激酶B-RAF (也稱為BRAF)中的癌基因突變。(Davies, H.et al., Nature 417，949 - 954 (2002).)黑素瘤被認為是皮膚癌的最致命的形式并且美國國家癌癥研究所已經(jīng)估計2012年預計有72，250新病例，其可導致美國大約9，180人死亡。臨床前研究已經(jīng)證實B-RAF(V600E)突變預測黑素瘤中促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導級聯(lián)的依賴性(Hoeflich，K.P.et al.，Cancer Res.69，3042 -3051(2009) ；McDermott, U.et al., Proc.Natl Acad.Sc1.USA 104, 19936 - 19941(2007)；Solit, D.B.et al.BRAF mutat1n predicts sensitivity to MEK inhibit1n.Nature439, 358 - 362(2006) ；ffan, P.T.et al., Cell 116, 855 - 867(2004) ；ffellbrock, C.etal.，Cancer Res.64，2338 - 2342(2004))——觀察到已經(jīng)在臨床試驗中成功驗證RAF或MEK 抑制劑(Flaherty, K.T.et al., N.Engl.J.Med.363, 809 - 819 (2010) ； Infante, J.R.et al., J.Clin.0ncol.28 (suppl.), 2503 (2010) ；Schwartz, G.K.et al., J.Clin.0ncol.27(suppl.), 3513(2009).)
[0006]最近，美國食品藥品管理局(FDA)批準了 Raf抑制劑威羅菲尼(Vemurafenib)(PLX4032)ο(Dummer et al., 2008 ；Infante et al., 2010 ；Joseph et al., 2010 ；Flahertyet al.，2010)然而，針對靶向癌癥治療劑的臨床反應(yīng)經(jīng)常受到新生抗性或獲得抗性混淆。(Engelman, J.A.et al., Science 316, 1039 - 1043(2007) ；Gorre, M.E.et al., Science293，876 - 880 (2001) ；Heinrich, Μ.C.et al.，J.Clin.0ncol.24，4764 - 4774 (2006)；Daub, H., Specht, K.&Ullrich, A.Nature Rev.Drug Discov.3, 1001 - 1010 (2004).)在臨床和體外背景下，最近該現(xiàn)象已被證明由以下方式所支配:或是由一個平行信號模塊(CRAF，C0T)的過表達(Montagut et al., Cancer Res 68:4853-4861 (2008) ；Johannessen etal., Nature 468:968-972 (2010)，平行信號通路(PDGFRb，IGF-1R)的激活(Nazarian etal., Nature 468:973-977 (2010) ；Villanueva et al., Cancer Cell 18:683-695 (2010),上游靶標(BRAF)的擴增(Shi et al.，Nat Commun 3:724 (2012)，靶標(p61BRAF)的刪除(Poulikakos et al., Nature 480:387-390 (2011)或是通過激活下游祀標或祀蛋白本身(Mek)的突變(Emery et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106:20411-20416(2009) ；ffagleet al., JCO 29:3085-3096(2011)。因此，仍然需要以下方法:用于以闡明用長效治療策略的“可藥用(druggable) ”靶標的方式鑒定抗性機理的新方法，用于鑒定有可能從治療策略中獲益的患者的新方法，以及以長效治療策略治療患者的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明涉及對癌癥治療的治療劑的抗性的開發(fā)和賦予對癌癥治療的抗性的靶標的鑒定。本發(fā)明還涉及用于促進長效治療策略和鑒定可以從該治療獲益的患者的平行藥物靶標的鑒定。
[0008]在一個方面，本發(fā)明提供編碼具有C-RAF活性的突變體C-RAF多肽的核酸分子。所述突變體C-RAF多肽包括與含有SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比至少一個氨基酸的取代，所述至少一個氨基酸的取代賦予對表達所述突變體RAF多肽的細胞上一種或多種RAF抑制劑的抗性。
[0009]在另一個方面，本發(fā)明提供一種表達載體。所述表達載體包括編碼具有C-RAF活性的突變體C-RAF多肽的核酸分子，其中所述突變體C-RAF多肽包括與含有SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比至少一個氨基酸的取代并且所述至少一個氨基酸的取代賦予對表達所述突變體C-RAF多肽的細胞上一種或多種RAF抑制劑的抗性。
[0010]在另一個方面，本發(fā)明提供一種宿主細胞。所述宿主細胞包括所述表達載體。
[0011]在另一個方面，本發(fā)明提供一種分離的具有C-RAF活性的突變體C-RAF多肽。所述突變體C-RAF多肽包括與含有SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比至少一個氨基酸的取代并且所述至少一個氨基酸的取代賦予對表達所述突變體RAF多肽的細胞上一種或多種RAF抑制劑的抗性。
[0012]在另一個方面，本發(fā)明提供一種抗體制劑。所述抗體制劑特異性結(jié)合本發(fā)明的分離的突變體C-RAF多肽。
[0013]在又一個方面，本發(fā)明提供一種治療患有癌癥的受試者的方法。所述方法包括從患者的癌癥細胞提取核酸，并測定編碼C-RAF多肽的至少一部分核酸分子的編碼C-RAF多肽的核酸分子中一個或多個突變的存在，所述突變在以下一個或多個位置與野生型C-RAF多肽相比改變所編碼的C-RAF多肽的一個或多個氨基酸處氨基酸殘基的身份(identity):104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和 554R。所述方法還包括當所述核酸分子包括與野生型C-RAF多肽相比在所述編碼C-RAF多肽的一個或多個氨基酸改變所述氨基酸殘基的核苷酸時給予所述受試者有效量的RAF抑制劑和有效量的第二抑制劑。
[0014]在另一個方面，本發(fā)明提供一種鑒定有可能從用RAF抑制劑和第二抑制劑聯(lián)合治療中獲益的患有癌癥的受試者的方法。所述方法包括從患者的癌癥細胞提取核酸，并測定編碼C-RAF多肽的至少一部分核酸分子。與野生型C-RAF多肽相比，編碼C-RAF多肽的核酸分子內(nèi)存在一個或多個突變，其在所編碼的C-RAF多肽的一個或多個氨基酸處改變氨基酸殘基的身份，突變位于選自以下組的一個或多個位置:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E和554R，意味著需要用RAF抑制劑和第二抑制劑治療所述受試者。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1顯示A375細胞中C-RAF突變體等位基因(BRAFV600E)對RAF抑制劑PLX4720的抗性。
[0016](A)顯示從PLX4720突變篩選得到C-RAF編碼序列的候選突變的平均變體得分。示出了高得分突變(>2% )的相應(yīng)氨基酸取代。(B)左圖:顯示C-RAF激酶結(jié)構(gòu)域(殘基340-618 ;灰色)(PDB編號:30MV)的晶體結(jié)構(gòu)，包括代表性的C-RAF抗性突變體(棒)以及結(jié)合的PLX4720的空間填充模型。還示出了 DFG基序和P-環(huán)。右圖:C-RAF結(jié)構(gòu)旋轉(zhuǎn)90°以暴露二聚體界面殘基R401(結(jié)構(gòu)由PyMOL渲染)。(C) C-RAF結(jié)構(gòu)域代表(CR，保守區(qū)；RBD, Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及CRD，富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域)描繪C-RAF抗性突變體(星號)和對C-RAF調(diào)控重要的三個絲氨酸殘基(圓形)的位置。
[0017]圖2顯示C-RAF抗性突變體的功能特征。
[0018](A)表達C-RAF(WT)和C-RAF(鑒定的等位基因)的A375細胞以劑量依賴的方式(0.08μΜ、0.4μΜ、2μΜ、5μΜ^Ρ 10 μ Μ)用 RAF 抑制劑 PLX4720 處理 90min。免疫印跡顯示pErkl/2、pMekl/2、C-RAF。α -微管蛋白用作上樣對照。(B)高表達抗性C-RAF突變體的Α375 細胞用 2μΜ 的 PLX4720 處理 16h。顯示 pMekl/2、pErkl/2、Mek、S259C-RAF、S338C_RAF、S62IC-RAF和肌動蛋白的水平。(C) A375和C-RAF抗性等位基因應(yīng)答于PLX4720和(D)威羅菲尼的生長抑制曲線。(E)高表達抗性C-RAF突變體的A375細胞用I μ M的Mek抑制劑AZD6244 處理 16h。顯示 pMekl/2、pErkl/2、Mek、S259C-RAF、S338C-RAF、S62IC-RAF 和肌動蛋白的水平。(F)A375和C-RAF抗性等位基因應(yīng)答于AZD6244和(G)Mek-GSK 1120212的生長抑制曲線。
[0019]圖3顯示C-RAF抗性突變體表現(xiàn)出與B-RAF增強的結(jié)合。
[0020](A)表達C-RAF抗性等位基因的293/T細胞和⑶表達C-RAF抗性等位基因的A375細胞用總C-RAF免疫沉淀。結(jié)合蛋白(B-RAF和14_3_3)的水平由免疫印跡進行評估。輸入(Input)裂解物(下圖)顯示 14-3-3、B-RAF、C-RAF、pMekl/2、pErkl/2、Mek、肌動蛋白和S259C-RAF、S338C-RAF和S621C-RAF(右上圖)。結(jié)果代表兩個以上獨立的實驗。
[0021 ] 圖4采用(S)-甲基1- (4- (3- (5-氯_2_氟_3_ (甲基磺酰氨基)苯基)_1_異丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯顯示C-RAF抗性等位基因的生化特性。
[0022](A)免疫印跡代表表達C-RAF抗性等位基因的A375細胞用ΙμΜ的PLX4720、
(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-異丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯和AZD6244處理16h的pMekl/2、pErkl/2、Mek、Erk和C-RAF水平。肌動蛋白用作上樣對照。(B)A375和C-RAF抗性等位基因應(yīng)答于PLX4720、(C)
(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-異丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯和(D)AZD6244的生長抑制曲線。
[0023]圖5顯示賦予對威羅菲尼(PLX4032)抗性的C-RAF抗性突變體。
[0024](A)A375和C-RAF抗性等位基因應(yīng)答于威羅菲尼(PLX4032)的生長抑制曲線。(B)在存在和不存在威羅菲尼16h的情況下，來自表達WT，S257P, P261T和G361A的A375細胞的提取物中C-RAF激酶活性。免疫印跡代表pMekl/2、pErkl/2、Mek、Erk和肌動蛋白。結(jié)果代表三個獨立的實驗。(C)A375和C-RAF抗性等位基因應(yīng)答于PLX4720、(D)AZD6244和(E)PLX4720和AZD6244的生長抑制曲線。
[0025]圖6顯示C-RAF抗性突變體的同源二聚化和激酶活性。
[0026](A)共表達His/V5標簽和Flag標簽的C-RAF抗性突變體48h的293T細胞與鎳(參見方法部分)免疫沉淀以拉下His標簽的C-RAF，并且Flag標簽的C-RAF用免疫印跡進行評估。輸入裂解物也采用檢測Flag-C-RAF、V5-C-RAF、總C-RAF、p-MEK、p_ERK和總ERK的抗體進行評估。(B)共表達His/V5標簽和Flag標簽的C-RAF抗性突變體的293T細胞用或者載體(DMSO)或者2 μ M的威羅菲尼處理lh，并且His/V5標簽的C-RAF如上述(A)所述的進行免疫沉淀。輸入裂解物采用識別C-RAF (S338)、p-MEK、p-ERK和肌動蛋白(上樣對照)的抗體免疫印跡。(C)體外C-Raf激酶活性在源自如下293T細胞的細胞提取物中測量:瞬時表達Flag標簽空載體(“C”)、野生型C-RAF ( “WT”)和攜帶抗性突變體S257P、P261T、G361A和E478K的C-RAF。分析在存在或不存在2 μ M威羅菲尼的情況下進行(參見方法部分)。輸入裂解物也采用檢測p-MEKl/2、p-ERKl/2、總ΜΕΚ、總ERK和肌動蛋白的抗體進行免疫印跡。(D)在存在和不存在2μ M威羅菲尼的情況下，在源自如下細胞的細胞提取物中測量體外C-Raf激酶活性:Α375細胞(B-RAFvkicie) ( “C”)和穩(wěn)定表達野生型C-RAF ( “WT”)和攜帶抗性突變體S257P、Ρ261Τ和G361A的Α375。對輸入裂解物采用識別p-MEKl/2、p-ERKl/2、總MEK、總ERK和肌動蛋白的抗體進行免疫印跡研究。所有結(jié)果代表三個獨立的實驗。
[0027]圖7顯示C-RAF抗性突變體的異源二聚化和14_3_3結(jié)合性質(zhì)。
[0028]⑷在不存在(_)或存在(+) 2 μ M威羅菲尼Ih情況下的瞬時表達所示C-RAF抗性突變體的293/Τ細胞與C-RAF免疫沉淀并且結(jié)合蛋白(B-RAF和14_3_3 ζ )(上圖)的水平由免疫印跡評估。輸入裂解物(下圖)顯示14-3-3 ζ、B-RAF、C-RAF、pMekl/2、pErkl/2、Mek、S338C-RAF和肌動蛋白。結(jié)果代表兩個以上獨立的實驗。(B)在不存在和存在2 μ M威羅菲尼16h情況下的穩(wěn)定表達所示C-RAF抗性突變體的A375細胞與C-RAF免疫沉淀并且結(jié)合蛋白(B-RAF和14-3-3 ζ )(上圖)的水平由免疫印跡評估。輸入裂解物與圖7Α相同的方法進行印跡。結(jié)果代表兩個以上獨立的實驗。
[0029]圖8顯示C-RAF抗性突變體要求MEK/ERK信號的二聚化。
[0030](A)表達或者Flag標簽、野生型C-RAF或所示C-RAF抗性突變體的構(gòu)建體在不存在(左)或存在(右)二聚化缺陷突變體R401H(粉)的情況下表達于293T細胞。裂解物采用識別p-MEK、p-ERK、總MEK或總C-RAF進行印跡。(B)共表達His標簽C-RAF抗性突變體的293/T細胞其自身和在二聚化缺陷(粉)相關(guān)情境中在不存在或存在威羅菲尼(2μΜ，lhr)的情況下培養(yǎng)。采用鎳珠進行免疫沉淀并且Flag標簽的C-RAF的水平由免疫印跡進行評估。還顯示了輸入裂解物與識別Flag-C-RAF、V5-C-RAF、總C-RAF、p_MEK、p_ERK、S338-C-RAF和肌動蛋白的抗體的印跡。
[0031]圖9顯示C-RAF抗性等位基因的生化特性
[0032](A)采用表達包含各種從隨機誘變篩選中出現(xiàn)的抗性等位基因的C-RAF的A375細胞比較表達于A375細胞中的pMek/pErk水平。微管蛋白作為陽性對照。(B)表達或者野生型C-RAF或者C-RAF抗性等位基因的A375細胞用Raf抑制劑PLX4720以所示劑量處理90分鐘。用抗P-ERK、p-MEK和總C-RAF的抗體進行免疫印跡研究。微管蛋白作為上樣對照。
[0033]圖10顯示同源二聚化和激酶活性。
[0034](A)共表達His/V5標簽的C-RAF抗性突變體48h的293/T細胞與His免疫沉淀并且Flag標簽的C-RAF相互作用用免疫印跡進行評估。輸入裂解物代表Flag-C-RAF、V5-C-RAF、C-RAF、pMek、pErk 和 Erk。(B) 293/T 細胞用二聚化缺陷 C-RAF 突變體 R401H 和看門突變T421N轉(zhuǎn)染并且在存在威羅菲尼(211|1)111的情況下檢測此1^/^4敏感性。T421N用作陰性對照并且G361A用作陽性對照。
[0035]發(fā)明詳述
[0036]本發(fā)明涉及癌癥治療的治療劑的抗性的開發(fā)和賦予癌癥治療抗性的靶標的鑒定。本發(fā)明還涉及用于促進長效治療策略和鑒定可以從該治療獲益的患者的平行藥物靶標的鑒定。
[0037]本發(fā)明的實踐將采用，除非另有說明，常規(guī)的分子生物學、免疫學、微生物學、細胞生物學和重組DNA技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。參見例如Sambrook, Fritsch和Maniatis, MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,(當前版本)；CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR B1LOGY(F.M.Ausubel et al.編著，(當前版本))；the series METHODSIN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) ；PCR 2:A PRACTICAL APPROACH (當前版本)；ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL和 ANIMAL CELL CULTURE (R.1.Freshney,編著(1987)).DNA Cloning:A Practical Approach, vol.1&II(D.Glover, ed.) ；01igonucleotideSynthesis (N.Gait,編著，當前版本)；Nucleic Acid Hybridizat1n(B.Hames&S.Higgins,編著，當前版本)！Transcript1n and Translat1n (B.Hames&S.Higgins, eds.,當前版本)!Fundamental Virology,第 2 版，vol.1&II (B.N.Fields 和 D.M.Knipe 編著)
[0038]促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)是一個關(guān)鍵的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，其調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導響應(yīng)于多種細胞外刺激物，包括生長因子、細胞因子和原癌基因。激活該途徑導致轉(zhuǎn)錄因子活化和基因表達的改變，這最終導致細胞功能的改變，包括細胞增殖、細胞周期調(diào)控、細胞存活、血管生成和細胞遷移。經(jīng)典的MAPK信號傳導是通過在細胞表面的受體酪氨酸激酶開始的，但許多其他細胞表面分子能夠激活MAPK級聯(lián)，包括整合素、異三聚體G蛋白以及細胞因子受體。
[0039]結(jié)合細胞表面受體的配體，例如，受體酪氨酸激酶，通常會導致受體的磷酸化。接頭蛋白Grb2與激活的受體的磷酸化的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且該結(jié)合募集鳥嘌呤核苷酸交換因子包括SOS-1和⑶C25至細胞膜。這些鳥嘌呤核苷酸交換因子與GTP酶Ras相互作用并激活GTP酶Ras。常見的Ras亞型包括K-Ras、N-Ras、H-Ras及其它亞型。Ras激活之后，絲氨酸/蘇氨酸激酶Raf (例如，A-Raf、B-Raf、C-Raf或Raf-1)通過與Ras相互作用被募集至細胞膜或以不依賴Ras的方式在細胞質(zhì)中，其中它經(jīng)歷構(gòu)象變化并結(jié)合例如14-3-3的支架蛋白(King et al., Nature 396 ; 180-183 (1998) ； Chaudhary et al., Curr B1l10:551-554(2000) ；Avruch et al., Endo Rev 56:127-156 (2001), Wellbrock et al., NatRev Mol Cell B1l 5:875-885(2004))。14-3-3結(jié)合并穩(wěn)定/激活CRAF是由例如負電荷調(diào)控區(qū)(N-區(qū))中的S338、Y341以及C端、激酶結(jié)構(gòu)域之外的S621激活殘基的磷酸化，和負電荷調(diào)控殘基例如CR2結(jié)構(gòu)域中的S259(圖1C)的去磷酸化以及進一步反應(yīng)其復雜調(diào)控的許多其它遍布整個蛋白的磷酸化位點所支配(Avruch et al., Id.(2001) ；ffellbrock etal., Id.(2004) ；Garnett et al.,Mol.Cel 120:963-969 (2005)) ? CRAF 的激活也被人工同源二聚體的形成所誘導(Avruch et al., Id.(2001) ；ffellbrock et al., Id., (2004).)
[0040]然后Raf被磷酸化。Raf通過磷酸化217和221位的兩個絲氨酸殘基直接激活MEKl和MEK2。激活后，MEKl和MEK2磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶Erkl和Erk2的酪氨酸(Tyr-185)和蘇氨酸(Thr-183)殘基，導致Erk激活。激活的Erk調(diào)節(jié)細胞質(zhì)中的許多靶標并且還移位入核，在那里它磷酸化大量調(diào)節(jié)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。Erk激酶有大量靶標，包括 EIk-1、c-Etsl、c-Ets2、p90RSKl、MNKl、MNK2、MSKl、MSK2 和 Τ0Β。雖然前面的通路是MAPK信號的經(jīng)典代表，MAPK通路與其它信號級聯(lián)之間有相當多的交叉對話。
[0041]MAPK信號傳導通路中的偏差對癌癥生物學具有顯著作用。Ras表達的改變常見于多種癌癥，并Ras中激活的突變也已確定。這些突變見于所有癌癥的高達30%，并且是在胰腺癌(90% )和結(jié)腸癌(50% )尤其常見。此外，已經(jīng)確定在黑素瘤和卵巢癌中激活的B-Raf突變。最常見的突變，BRAFv6cicie，導致下游MAP激酶通路的組成型激活并且是黑素瘤的細胞增殖、軟瓊脂生長和腫瘤異種移植物的形成所必需的。CRAF擴增已經(jīng)涉及前列腺癌和膀胱癌(Edwards et al., 2003 ；Simon et al.，2001),此外,在胃癌和毛細胞型星形細胞瘤中的染色體易位(Shimizu et al., 1986 ；Jones et al.，2009)。然而，CRAF突變在人類癌癥的發(fā)生率是1% (COSMIC)，這是由于其與BRAF相比低的基礎(chǔ)激酶活性(Maraiset al., Science 280:109-112(1997) ；Emuss et al., Cancer Res 65:9719-9726(2005)；Garnett et al.,Mol.Cell 20:963-969 (2005))?；趯APK的定義的在人類癌癥中過度激活的角色，用特異性抑制劑靶向MAPK通路的成分是一種有前途的癌癥治療方法。但是，患者可能有對這些有前途的治療方法的先天抗性或獲得抗性。賦予靶激酶突變抗性的鑒定、診斷和/或預后標記物和對這些有先天或獲得抗性的患者進行治療的療法在下文進行描述。
[0042]C-RAF 突變
[0043]雖然用例如PLX4032的RAF抑制劑的癌癥治療是一種有前途的治療方法，接受這種治療的患者經(jīng)常復發(fā)或無法響應(yīng)，其結(jié)果是患者的疾病發(fā)展。如本發(fā)明所述，本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)賦予對RAF抑制劑抗性的C-RAF中的突變，其中一些是目前處于臨床開發(fā)中的。在癌癥細胞中獲得這樣的突變使得患者的細胞對某些RAF抑制劑的治療具有抗性。在示例的實施方案中，本發(fā)明涉及對RAF抑制劑抗性的開發(fā)，其可以包括但不限于 RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX 4720、PLX4032、GDC-0879、ZM 336372 和(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-異丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。通過非限制性的例子，示例性的RAF抑制劑示于表I中。所述RAF抑制劑(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟_3_(甲基磺酰氨基)苯基)-1-異丙基-1H-批唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯被一般性及具體涉及到(本臨時申請的第50頁的表I的化合物9 ；PCT公開文本W(wǎng)02011/025927的第72頁上的化合物9。
[0044]賦予對本發(fā)明所述的RAF抑制劑抗性的C-RAF突變的臨床上的出現(xiàn)表明，RAF/MEK相關(guān)的依賴關(guān)系的生物相關(guān)性被維持，即使在惡性腫瘤的后期階段。因此，RAF抑制劑的失效引發(fā)許多惡性腫瘤中持續(xù)的腫瘤反應(yīng)，包括黑素瘤，可能表明在臨床上不理想的藥物效力或藥效學研究?；诒景l(fā)明所述的發(fā)現(xiàn)，涉及RAF-或MEK-驅(qū)動的腫瘤靶向藥物治療方式可能會受益于更有效的藥物、現(xiàn)有藥物的改變的給藥或組合RAF和MEK抑制作用。示例性RAF抑制劑包括，但不限于表I中列出的抑制劑。MEK抑制劑的非限制性的例子包括:AZD6244 ；C1-1040 ；PD184352 ;PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6_ 甲氧基-7-(3-嗎啉-4-基-丙氧基)-4- (4-苯氧基-苯氨基)-喹啉-3-腈和4- [3-氯-4- (1-甲基-1H-咪唑-2-基磺酰基)-苯氨基]-6-甲氧基-7- (3-嗎啉-4-基-丙氧基)-喹啉-3-腈。示例性MEK抑制劑顯示于表2。這些治療創(chuàng)新，與分層患者的強大的腫瘤基因組譜一起，應(yīng)當與“可藥用”原癌基因突變一起加快癌癥的個性化癌癥治療的出現(xiàn)。
[0045]表1:示例性的RAF抑制劑
[0046]

【權(quán)利要求】
1.一種編碼具有C-RAF活性的突變體C-RAF多肽的分離的核酸分子，其中所述突變體C-RAF多肽與包含SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比包含至少一個氨基酸取代，所述至少一個氨基酸取代賦予表達所述突變體C-RAF多肽的細胞針對一種或多種RAF抑制劑的抗性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述至少一個氨基酸取代發(fā)生于一個或多個氨基酸位置，所述位置選自:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和554R。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述至少一個取代選自:104E>K、257S>P、261P>T、356G>E、361G>A、427S>T、447D>N、469M>1、478E>K 和 554R>K。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述至少一個取代選自:257S、261P和361G。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的分離的核酸分子，其中所述RAF抑制劑選自:RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX 4720、PLX4032、GDC-0879、ZM 336372 和(S) -甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-異丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的分離的核酸分子，其中所述RAF抑制劑是PLX4032。
7.包含權(quán)利要求1所述的核酸的表達載體。
8.包含權(quán)利要求7所述的表達載體的宿主細胞。
9.一種具有C-RAF活性的分離的突變體C-RAF多肽，其中所述突變體C-RAF多肽與包含SEQ.1D.N0.2的野生型C-RAF多肽相比包含至少一個氨基酸取代，所述至少一個氨基酸取代賦予表達所述突變體C-RAF多肽的細胞針對一種或多種RAF抑制劑的抗性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的突變體C-RAF多肽，其中所述至少一個氨基酸取代發(fā)生于一個或多個氨基酸位置，所述位置選自:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E和 554R。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的突變體C-RAF多肽，其中所述至少一個取代選自:104E>K、257S>P、261P>T、356G>E、361G>A、427S>T、447D>N、469M>1、478E>K 和 554R>K。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的突變體C-RAF多肽，其中所述至少一個取代選自:257S、261P 和 361G。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項所述的突變體C-RAF多肽，其中所述RAF抑制劑選自以下組:RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX4720、PLX4032、⑶C-0879、ZM 336372 和(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-異丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求9-12任一項所述的突變體C-RAF多肽，其中所述RAF抑制劑是PLX4032。
15.一種特異性結(jié)合權(quán)利要求9的多肽的抗體制劑。
16.一種治療患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括: (a)從患者的癌癥細胞提取核酸； (b)測定編碼C-RAF多肽的至少一部分核酸分子的編碼C-RAF多肽的核酸分子中一個或多個突變的存在，所述突變在以下一個或多個位置與野生型C-RAF多肽相比改變所編碼的C-RAF多肽的一個或多個氨基酸處氨基酸殘基的身份，所述位置選自:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和 554R ；以及 (c)當所述核酸分子包含與野生型C-RAF多肽相比在所述編碼的C-RAF多肽的一個或多個氨基酸處改變所述氨基酸殘基的核苷酸時，給予所述受試者有效量的RAF抑制劑和有效量的第二抑制劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述第二抑制劑是MEK抑制劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述RAF抑制劑選自:RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX 4720、PLX4032、⑶C-0879、ZM 336372 和(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-異丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一項所述的方法，其中所述MEK抑制劑選自:CI_1040/PD184352、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEAl 19、6-甲氧基-7-(3-嗎啉-4-基-丙氧基)-4- (4-苯氧基-苯氨基)-喹啉-3-腈和4- [3-氯-4- (1-甲基-1H-咪唑-2-基磺?；?-苯氨基]-6-甲氧基-7- (3-嗎啉-4-基-丙氧基)-喹啉-3-腈。
20.根據(jù)權(quán)利要求16-19任一項所述的方法，其中所述癌癥選自以下組:黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、卵巢癌、肉瘤和甲狀腺癌。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-20任一項所述的方法，其中所述癌癥是RAF依賴的癌癥。
22.根據(jù)權(quán)利要求16-21任一項所述的方法，其中所述癌癥是黑素瘤。
23.一種鑒定有可能從用RAF抑制劑和第二抑制劑聯(lián)合治療中獲益的患有癌癥的受試者的方法，所述方法包括: (a)從患者的癌癥細胞提取核酸；以及 (b)測定編碼C-RAF多肽的至少一部分核酸分子； 其中一個或多個核苷酸的存在表明需要用RAF抑制劑和第二抑制劑治療所述受試者，所述一個或多個核苷酸使得編碼的突變體C-RAF多肽的一個或多個氨基酸處的氨基酸殘基的身份相對于野生型C-RAF多肽的一個或多個位置處的氨基酸發(fā)生改變，所述一個或多個氨基酸位置選自:104E、257S、261P、356G、361G、427S、447D、469M、478E 和 554R。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，進一步包括給予所述患者RAF抑制劑和第二抑制劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中改變編碼的突變體C-RAF多肽的一個或多個氨基酸處的氨基酸殘基的身份的一個或多個核苷酸的存在發(fā)生在一個或多個氨基酸位置，所述位置選自:104E>K、257S>P、261P>T、356G>E、361G>A、427S>T、447D>N、469M>1、478E>K 和 554R>K。
26.根據(jù)權(quán)利要求23-25任一項所述的方法，其中改變編碼的突變體C-RAF多肽的一個或多個氨基酸處的氨基酸殘基的身份的一個或多個核苷酸的存在發(fā)生在一個或多個氨基酸位置，所述位置選自:257S、261P和361G。
27.根據(jù)權(quán)利要求23-26任一項所述的方法，其中所述第二抑制劑是MEK抑制劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求23-26任一項所述的方法，其中所述MEK抑制劑選自:CI_1040/PD184352、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、6_ 甲氧基-7-(3-嗎啉-4-基-丙氧基)-4- (4-苯氧基-苯氨基)-喹啉-3-腈和4- [3-氯-4- (1-甲基-1H-咪唑-2-基磺酰基)-苯氨基]-6-甲氧基-7- (3-嗎啉-4-基-丙氧基)-喹啉-3-腈。
29.根據(jù)權(quán)利要求23-28任一項所述的方法，其中所述RAF抑制劑選自:RAF265、索拉非尼、SB590885、PLX 4720、PLX4032、⑶C-0879、ZM 336372 和(S)-甲基1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰氨基)苯基)-1-異丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶_2_基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。
30.根據(jù)權(quán)利要求23-29任一項所述的方法，其中所述癌癥選自:黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、卵巢癌、肉瘤和甲狀腺癌。
31.根據(jù)權(quán)利要求23-30任一項所述的方法，其中所述癌癥是RAF依賴的癌癥。
32.根據(jù)權(quán)利要求23-31任一項所述的方法，其中所述癌癥是黑素瘤。
33.根據(jù)權(quán)利要求23-32任一項所述的方法，其中所述受試者具有包含在B-RAF中突變的癌癥細胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求23-33任一項所述的方法，其中所述患者具有包含B-RAFV6°°e突變的癌癥細胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求23-34任一項所述的方法，其中測定所述核酸包括對所述核酸測序。
【文檔編號】G01N33/574GK104204806SQ201380014747
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月28日
【發(fā)明者】C·埃默里, R·安東尼, L·A·加拉韋 申請人:達娜-法勃腫瘤研究所公司