鮮葉切片及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了鮮葉切片及其制備方法和用途，其中該方法包括：（1）剪切鮮葉片；（2）采用純凈水漂洗經(jīng)過剪切的鮮葉片；（3）切取葉塊，該葉塊包含中脈，面積為3mm×5mm；（4）利用不銹鋼直鏟頭鑷子夾住該葉塊，使之直立，記住葉片正反面，以不銹鋼雙面刀片沿鑷子鏟頭內(nèi)側(cè)垂直切下，以便得到厚度小于0.1mm優(yōu)選為50-100μm的均勻的材料；（5）利用直尖頭鑷子將材料平展放在滴有純凈水的載玻片上，蓋上蓋玻片，以便獲得鮮葉切片。該方法，成本低、簡單快速、易操作，且不使用任何化學(xué)藥劑，不會對葉片生理功能造成損害，不會對葉片生理功能造成損害，切片中的葉肉組織鮮活，從而有利于后續(xù)的觀測研究。
【專利說明】鮮葉切片及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及鮮葉切片及其制備方法和用途，具體地，涉及制備鮮葉切片的方法、鮮葉切片及其在利用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究葉片氣孔動態(tài)變化中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]目前制備鮮葉切片的方法，普遍需要使用化學(xué)藥劑進行染色、固定，然而其所涉及的物理化學(xué)變化劇烈，不可避免地會對葉片生理功能造成損害，從而制備的切片的結(jié)構(gòu)及生理功能與鮮葉差別較大，在切片應(yīng)用中例如用于激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究氣孔動態(tài)變化時，無法真實反映鮮葉的特征，從而無法滿足實驗要求。
[0003]因而，現(xiàn)階段的制備鮮葉切片的方法仍有待改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠快速有效地制備對葉片生理功能損害較少的鮮葉切片的方法。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種制備鮮葉切片的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟:
[0006](I)剪切鮮葉片；
[0007]( 2 )采用純凈水漂洗經(jīng)過剪切的鮮葉片；
[0008](3)于盛有薄層純凈水的培養(yǎng)皿中切取葉塊，所述葉塊包含中脈，所述葉塊的面積為 3mmX5mm ；
[0009](4)利用規(guī)格為6 X IOmm的不銹鋼直鏟頭鑷子夾住所述葉塊，使之直立,記住所述葉片正反面，以不銹鋼雙面刀片沿所述鑷子鏟頭內(nèi)側(cè)垂直切下，以便得到厚度小于0.1mm優(yōu)選為50-100 iim的均勻的材料，其中，垂直下切時，適度貼緊鏟頭；
[0010](5)利用直尖頭鑷子將所述材料平展放在滴有純凈水的載玻片上，蓋上蓋玻片，以便獲得鮮葉切片。
[0011]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的制備鮮葉切片的方法，成本低、簡單快速、易操作，且不使用任何化學(xué)藥劑，將葉片在不失水的條件下快速制片，不會發(fā)生劇烈的物理化學(xué)變化，因而不會對葉片生理功能造成損害，進而能夠最大限度地降低鮮葉類試驗材料處理過程中對后續(xù)觀測實驗的結(jié)果造成影響。并且，當(dāng)將制備獲得的鮮葉切片用于激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究葉片氣孔動態(tài)變化時，能夠在葉肉組織處于鮮活的狀態(tài)下進行觀察。根據(jù)本發(fā)明的實施例，將根據(jù)本發(fā)明的方法制備獲得的鮮葉切片用于激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究葉片氣孔動態(tài)變化，觀測到的鮮葉切片的細胞內(nèi)葉綠體熒光清晰，且保衛(wèi)細胞及其周圍細胞的形狀、活性狀態(tài)、空間分布狀況均能夠得到很好的觀察。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的方法所適用的植物種類不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述鮮葉來源于選自盆栽報春石斛(D.primulinum)、金釵石斛(D.nobile)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、長壽花(K.blossfeldiana)和大葉落地生根(K.daigremontiana)的至少一種。即本發(fā)明的方法尤其適用于盆栽報春石斛(D.primulinum)、金釵石斛(D.nobile)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、長壽花(K.blossfeldiana)和大葉落地生根(K.daigremontiana)。由此，制備獲得的鮮葉切片能夠有效用于激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究相應(yīng)植物的葉片氣孔動態(tài)變化。
[0013]需要說明的是，本發(fā)明的方法對制片技術(shù)的熟練程度要求非常高。熟練程度越好，制備地越快，獲得的鮮葉切片質(zhì)量越好。根據(jù)本發(fā)明的實施例，于40s內(nèi)完成所有步驟。由此，制備獲得的鮮葉切片，葉片生理功能不會被損害，切片中的葉肉組織鮮活，有利于后續(xù)的觀測研究。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種鮮葉切片。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該鮮葉切片是通過前面所述的制備鮮葉切片的方法制備獲得的。如前所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將該鮮葉切片用于激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究葉片氣孔動態(tài)變化，能夠保證在葉肉組織處于鮮活的狀態(tài)下進行觀察，觀測到的鮮葉切片的細胞內(nèi)葉綠體熒光清晰，且保衛(wèi)細胞及其周圍細胞的形狀、活性狀態(tài)、空間分布狀況均能夠得到很好的觀察。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的實施例，針對本發(fā)明的鮮葉切片，所述鮮葉來源的植物種類不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述鮮葉來源于選自盆栽報春石斛(D.primulinum),金釵石斛(D.nobile)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、長壽花(K.blossfeldiana)和大葉落地生根(K.daigremontiana)的至少一種。由此,制備獲得的鮮葉切片能夠有效用于激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究相應(yīng)植物的葉片氣孔動態(tài)變化。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了前面所述的鮮葉切片在利用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究葉片氣孔動態(tài)變化中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明的鮮葉切片用于激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究葉片氣孔動態(tài)變化，能夠保證在葉肉組織處于鮮活的狀態(tài)下進行觀察，觀測到的鮮葉切片的細胞內(nèi)葉綠體熒光清晰，且保衛(wèi)細胞及其周圍細胞的形狀、活性狀態(tài)、空間分布狀況均能夠得到很好的觀察，觀測結(jié)果真實、可靠。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的鮮葉切片尤其適用于激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究盆栽報春石斛(D.primulinum)>金釵石斛(D.nobiIe)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、長壽花(K.blossfeldiana)和大葉落地生根(K.daigremontiana)的葉片的氣孔動態(tài)變化。
[0017]其中，需要說明的是，由于在激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺上加裝有微量步進馬達，其可驅(qū)動載物臺在掃描過程中上下(沿著Z軸)步進移動，以使物鏡聚焦于樣品的不同層面上，獲取該層的光學(xué)切片，從而可以得到細胞或組織各個橫斷面的一系列連續(xù)光學(xué)切片，即實現(xiàn)了 “顯微CT”。這些光學(xué)切片可以用于樣品立體結(jié)構(gòu)觀察和圖像的三維重建。所以用于激光掃描共聚焦顯微鏡觀測的鮮葉切片不能太薄或太厚，太薄得到的連續(xù)光學(xué)切片不能反映細胞在Z軸上的相互空間關(guān)系；如果太厚又不利于觀察，而50-100微米最佳。因此，本發(fā)明的制備鮮葉切片的方法尤其適用于激光掃描共聚焦顯微鏡相關(guān)觀測方面的研究。并且，該方法不使用任何化學(xué)藥劑，葉片在不失水的條件下快速制片，沒有劇烈的物理化學(xué)變化對葉片生理功能造成損害，因此最大限度地降低了試驗材料處理過程中對實驗結(jié)果造成的影響，并且能夠在葉肉組織處于鮮活狀態(tài)下觀察，其細胞內(nèi)葉綠體熒光清晰，保衛(wèi)細胞及其周圍細胞的形狀、活性狀態(tài)、空間分布狀況均能夠得到很好的觀察。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，采用Leica TCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡進行所述研究。由此，效率高，獲得的光學(xué)切片效果好，有利于葉片氣孔動態(tài)變化的觀察和研究。
[0019]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0021]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀測到的本發(fā)明制備獲得的報春石斛的鮮葉切片的氣孔復(fù)合體的形態(tài)圖；
[0022]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀測到的本發(fā)明制備獲得的大葉落地生根的鮮葉切片的氣孔復(fù)合體的形態(tài)圖；
[0023]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀測到的本發(fā)明制備獲得的金釵石斛的鮮葉切片的氣孔復(fù)合體的形態(tài)圖；
[0024]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀測到的本發(fā)明制備獲得的鼓槌石斛的鮮葉切片的氣孔復(fù)合體的形態(tài)圖；
[0025]圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀測到的本發(fā)明制備獲得的長壽花的鮮葉切片的氣孔復(fù)合體的形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0026]下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0027]實施例1
[0028]試驗材料:盆栽報春石斛(D.primulinum)；
[0029]金釵石斛(D.nobile)；
[0030]鼓植石斛(D.chrysotoxum)；
[0031]長壽花(K.blossfeldiana);
[0032]大葉落地生根(K.daigremontiana)。
[0033]儀器:LeicaTCS SP5 型激光掃描共聚焦顯微鏡(Confocal Laser ScanningMicroscope, CLSM,簡稱共聚焦顯微鏡)
[0034]熒光顯微鏡(LeicaDMI6000CS)
[0035]方法:
[0036]首先，根據(jù)本發(fā)明的制備鮮葉切片的方法，按照以下步驟制備上述各植物材料的鮮葉切片:
[0037]迅速剪切L1-C0R-6400 (即美國L1-COR公司生產(chǎn)的便攜式光合作用測定儀)測定過的上述植物材料的葉片(測定光合作用的目的在于確定試驗材料的的生理活動狀態(tài)，待測植物材料的表觀光合作用速率只要不是負值，就可以用于制作切片)，過純凈水漂洗，于盛有薄層純凈水的培養(yǎng)皿中切取葉塊，葉塊包含中脈，葉塊面積為3mmX5mm，以直鏟頭鑷子(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司，EZ34A - SA)輕輕夾住葉塊，使之直立，記住葉片正反面；以超級藍不銹鋼雙面刀片(白金涂層；上海吉列有限公司制造)鋒利刀片沿鏟形鑷內(nèi)側(cè)切下，得到厚度小于0.1mm均勻的材料；以直尖頭鑷子(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司，EZ3-SA)將材料平展放在滴有純凈水的載玻片上，蓋上蓋玻片，其中，以上過程在40s內(nèi)完成，以盡可能減少氣孔變化。
[0038]由此，獲得上述各植物材料的鮮葉切片。
[0039]然后，將上述各植物材料的鮮葉切片進行上鏡觀察，結(jié)果見圖1-圖5。其中，圖1-圖5分別顯示了激光掃描共聚焦顯微鏡下觀測獲得的報春石斛、大葉落地生根、金釵石斛、鼓槌石斛和長壽花的鮮葉切片的氣孔復(fù)合體的形態(tài)圖。由圖1-圖5可知，本試驗制備獲得的報春石斛、大葉落地生根、金釵石斛、鼓槌石斛和長壽花的鮮葉切片均非常便于觀測，且其細胞內(nèi)葉綠體熒光清晰，保衛(wèi)細胞及其周圍細胞的形狀、活性狀態(tài)、空間分布狀況清楚，有利于葉片氣孔動態(tài)變化的觀測研究。由此，表明不使用任何化學(xué)藥劑的本發(fā)明的方法，不會對葉片生理功能造成損害，切片中的葉肉組織鮮活，從而有利于后續(xù)的觀測研究。
[0040]在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
[0041]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【權(quán)利要求】
1.一種制備鮮葉切片的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)剪切鮮葉片； (2)采用純凈水漂洗經(jīng)過剪切的鮮葉片； (3)于盛有薄層純凈水的培養(yǎng)皿中切取葉塊，所述葉塊包含中脈，所述葉塊的面積約為3mmX 5mm ； (4)利用規(guī)格為6X IOmm的高度精密的不銹鋼直鏟頭鑷子夾住所述葉塊，使之直立，記住所述葉片正反面，以不銹鋼雙面刀片沿所述鑷子鏟頭內(nèi)側(cè)垂直切下，以便得到厚度約小于0.1mm優(yōu)選為50-100 的均勻的材料，其中，垂直下切時，適度貼緊鏟頭； (5)利用直尖頭鑷子將所述材料平展放在滴有純凈水的載玻片上，蓋上蓋玻片，以便獲得鮮葉切片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，于40s內(nèi)完成所有步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述鮮葉來源于選自盆栽報春石斛(D.primulinum)、金欽石斛(D.nobile)、鼓植石斛(D.chrysotoxum)、長壽花(K.blossfeldiana)和大葉落地生根(K.daigremontiana)的至少一種。
4.一種鮮葉切片，其是通過權(quán)利要求1-3任一項所述的方法制備獲得的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鮮葉切片，其特征在于，所述鮮葉來源于選自盆栽報春石斛(D.primulinum)、金釵石斛(D.nobile)、鼓槌石斛(D.chrysotoxum)、長壽花(K.blossfeldiana)和大葉落地生根(K.daigremontiana)的至少一種。
6.權(quán)利要求4或5所述的鮮葉切片在利用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)研究葉片氣孔動態(tài)變化中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，采用LeicaTCS SP5型激光掃描共聚焦顯微鏡進行所述研究。
【文檔編號】G01N1/28GK103499477SQ201310478941
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】任建武, 白偉嵐, 胡青, 姚洪軍, 沙海峰 申請人:北京林業(yè)大學(xué)