阻斷KIF17-m Lin10-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及阻斷KIF17-m?Lin10-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒及制備方法。本發(fā)明包括KIF17、接頭蛋白mLin10-PDZ1、接頭蛋白mLin2、mLin7、NR2B、KIF17；其中，KIF17是始動(dòng)單元，接頭蛋白mLin10-PDZ1是第一連接單元，接頭蛋白mLin2是第二連接單元，接頭蛋白mLin7是第三連接單元，NR2B是被捆綁單元。本發(fā)明解決了單一或聯(lián)合阻斷其中的一條或幾條通路并不能有效阻斷NR2B在樹突膜的表達(dá)上調(diào)的缺陷。本發(fā)明結(jié)構(gòu)清楚，作用機(jī)制明確，能夠較為完善的調(diào)制NR2B介導(dǎo)的痛覺過敏反應(yīng)。與多數(shù)一般有機(jī)小分子藥物相比，肽類藥物試劑盒具有活性高、用藥劑量小、毒副作用低、代謝終產(chǎn)物為氨基酸等突出特點(diǎn)；與蛋白類相比，小肽幾乎沒有免疫原性；可化學(xué)合成，產(chǎn)品純度高，質(zhì)量可控。
【專利說明】阻斷KIF1 7-m L i n10-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及阻斷KIF17-m LinlO-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒及制
備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在本發(fā)明之前，在醫(yī)學(xué)界對(duì)疼痛的研究表明，NR2B信號(hào)分子及其上下游各種蛋白激酶通路在疼痛的產(chǎn)生以及維持過程中發(fā)揮著重要作用，如EphBR-Src-NR2B通路、Cdk5-ERKl/2-NR2B 通路、NR2B_CaMKII 通路、NR2B-nN0S 通路、PKA-NR2B 通路、PKC-NR2B 通路等。研究表明這些通路間相互調(diào)控，共同形成了一個(gè)網(wǎng)絡(luò)。單一或聯(lián)合阻斷其中的一條或幾條通路并不能有效阻斷NR2B在樹突膜的表達(dá)上調(diào)，加上其特異性差，使得不良反應(yīng)較大，治療疼痛的效果也不十分理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制阻斷KIF17-m LinlO_NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒及制備方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0005]阻斷KIF17-m LinlO-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒，其主要技術(shù)特征在于包括KIF17、接頭蛋白mLinlO-PDZl、接頭蛋白mLin2、mLin7、NR2B、KIF17 ;其中，KI F17是始動(dòng)單元，接頭蛋白mLinlO-PDZl是第一連接單元,接頭蛋白mLin2是第二連接單元,接頭蛋白mLin7是第三連接單元，NR2B是被捆綁單元；。
[0006]所述KIF17觸發(fā)后與第一連接單元接頭蛋白mLinlO-PDZl結(jié)合組成結(jié)合體,結(jié)合體進(jìn)一步與第二連接單元接頭蛋白mLin2及第三連接單元接頭蛋白mLin7結(jié)合成更大的結(jié)合體，其中第三連接單元接頭蛋白mLin7發(fā)生構(gòu)型變化，與被捆綁單元NR2B緊密結(jié)合。
[0007]本發(fā)明的另一技術(shù)方案是:
[0008]阻斷KIF17-m LinlO-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒制備方法，其步驟在于:
[0009](I)采用Trizol抽提疼痛模型大鼠尾靜脈血清中的總RNA，再利用RT-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增包含KIF17、Mintl、NR2B cDNA的主要免疫表位多肽和截短多肽的基因片斷；
[0010](2)將擴(kuò)增的基因片斷插入提取的正常大鼠細(xì)胞內(nèi)；
[0011](3)利用數(shù)學(xué)模型篩選法和理性數(shù)據(jù)庫篩選法，結(jié)合蛋白質(zhì)和配體相互作用的MJ矩陣和隱馬可夫模型的規(guī)則，為蛋白質(zhì)KIF17篩選小肽抑制劑RC-13。
[0012](4)采用N1-NTA樹脂層析純化，最終獲得高純度的重組小肽，制備成阻斷KIF17-mLinlO-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒。
[0013]本發(fā)明的有益效果是，結(jié)構(gòu)清楚，作用機(jī)制明確，相對(duì)于之前單一通路的阻滯無法達(dá)到疼痛信號(hào)的網(wǎng)絡(luò)式阻滯，能夠較為完善的調(diào)制NR2B介導(dǎo)的痛覺過敏反應(yīng)。與多數(shù)一般有機(jī)小分子藥物相比，肽類藥物試劑盒具有活性高、用藥劑量小、毒副作用低、代謝終產(chǎn)物為氨基酸等突出特點(diǎn)；與蛋白類相比，小肽幾乎沒有免疫原性；可化學(xué)合成，產(chǎn)品純度高，質(zhì)量可控。
[0014]本發(fā)明的其他具體優(yōu)點(diǎn)和效果將在下面繼續(xù)說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1——本發(fā)明的機(jī)制原理圖。
[0016]圖中各標(biāo)號(hào)與名稱之間對(duì)應(yīng)關(guān)系如下:
[0017]NR2B(1)、mLin7(2)、mLin2(3)、mLinlO ⑷、鈣 /鈣調(diào)蛋白(5)、KI F17(6)、CaMKII (7)、微管(8)、PSD95 (9)、PDZl (10)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明的技術(shù)思路是:
[0019]一種驅(qū)動(dòng)蛋白17競爭性小肽抑制劑RC-13，通過競爭性與Mintl-PDZl結(jié)構(gòu)域結(jié)合，“搶占” KIF17尾部C-末端的作用位點(diǎn)，使驅(qū)動(dòng)蛋白17尾部C-末端和銜接蛋白Mintl的特異性結(jié)合受到限制，影響神經(jīng)元內(nèi)含NR2B亞基的NMDA受體翻譯后的正常轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使得定位于突觸后膜的NR2B量減少，疼痛信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱。
[0020]下面是具體說明:
[0021]如圖1所示，試劑盒包括KIF17(6)、接頭蛋白mLinl0(4)-PDZl(10)、接頭蛋白mLin2(3)、mLin7(2)、NR2B(1)KIF17(6)。
[0022]其中，KI F17(6)是始動(dòng)單元；接頭蛋白mLinlO (4)-PDZl (10)是第一連接單元；接頭蛋白mLin2(3)是第二連接單元；mLin7 (2)是第三連接單元；NR2B (I) KIF17 (6)是捆綁單
J Li ο
[0023]試劑盒制備方法:
[0024]采用Trizol提取疼痛模型大鼠尾靜脈200 μ I血清總RNA，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用巢式PCR擴(kuò)增KIF17、Mintl、NR2B基因片斷。PCR反應(yīng)條件為:94°C-30秒，550C -30秒，72°C -60秒，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0 %瓊脂糖凝膠電泳后檢測到大小約639bp的條帶。瓊脂糖凝膠回收純化是使用北京天根生化科技有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按照說明書操作即可。
[0025]通過T-A克隆原理，將純化的PCR產(chǎn)物插入提取正常大鼠的細(xì)胞內(nèi)，利用數(shù)學(xué)模型篩選法和理性數(shù)據(jù)庫篩選法，結(jié)合蛋白質(zhì)和配體相互作用的MJ矩陣和隱馬可夫模型的規(guī)貝丨J，為蛋白質(zhì)KIF17篩選小肽抑制劑RC-13。因此，獲得的阻斷KIF17-m LinlO-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒。
[0026]本發(fā)明的應(yīng)用過程說明:
[0027]KIF17(6)的尾部和接頭蛋白mLinlO (4)-PDZl (10)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，mLinlO (4)再依次結(jié)合接頭蛋白1111^112(3)、1111^117(2)，1111^117(2)再與 NR2B(1)結(jié)合。裝載了 NR2B(1)的KIF17(6)沿著微管(8)由負(fù)極向正極移動(dòng)，到達(dá)樹突末端的時(shí)候，KIF17(6)的絲氨酸1029被鈣/鈣調(diào)蛋白(5)依賴的CaMKII (7)磷酸化，釋放出NR2B (I)，NR2B (I)在PSD95 0)的作用下被錨定到細(xì)胞膜上。箭頭所示:此小肽主要作用是干擾KIF17(6)與mLinlO (4) -PDZl (10)結(jié)構(gòu)域之間的作用。
[0028]競爭性小肽抑制劑RC-13，通過競爭性與Mintl-PDZl結(jié)構(gòu)域結(jié)合，“搶占"KIF17尾部C-末端的作用位點(diǎn)，使驅(qū)動(dòng)蛋白17尾部C-末端和銜接蛋白Mintl的特異性結(jié)合受到限制，影響神經(jīng)元內(nèi)含NR2B亞基的NMDA受體翻譯后的正常轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使得定位于突觸后膜的NR2B量減少。
【權(quán)利要求】
1.阻斷KIF17-mLinlO-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒，其特征在于包括KIF17、接頭蛋白mLinlO-PDZl、接頭蛋白mLin2、mLin7、NR2B、KIF17 ;其中，KIF17是始動(dòng)單元，接頭蛋白mLinlO-PDZl是第一連接單元,接頭蛋白mLin2是第二連接單元,接頭蛋白mLin7是第三連接單元，NR2B是被捆綁單元。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的阻斷KIF17-mLinlO-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒，其特征在于KIF17觸發(fā)后與第一連接單元接頭蛋白mLinlO-PDZl結(jié)合組成結(jié)合體,結(jié)合體進(jìn)一步與第二連接單元接頭蛋白mLin2及第三連接單元接頭蛋白mLin7結(jié)合成更大的結(jié)合體,其中第三連接單元接頭蛋白mLin7發(fā)生構(gòu)型變化，與被捆綁單元NR2B緊密結(jié)合。
3.一種如權(quán)利要求1所述的阻斷KIF17-m LinlO-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒制備方法，其步驟在于: (1)采用Trizol抽提疼痛模型大鼠尾靜脈血清中的總RNA，再利用RT-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增包含KIF17、Mintl、NR2B cDNA的主要免疫表位多肽和截短多肽的基因片斷； (2)將擴(kuò)增的基因片斷插入提取的正常大鼠細(xì)胞內(nèi)； (3)利用數(shù)學(xué)模型篩選法和理性數(shù)據(jù)庫篩選法，結(jié)合蛋白質(zhì)和配體相互作用的MJ矩陣和隱馬可夫模型的規(guī)則，為蛋白質(zhì)KIF17篩選小肽抑制劑RC-13 ； (4)采用N1-NTA樹脂層析純化，最終獲得高純度的重組小肽，制備成阻斷KIF17-mLinlO-NR2B轉(zhuǎn)運(yùn)通路的試劑盒。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103529219SQ201310472617
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】馬正良, 顧小萍, 孫玉娥 申請(qǐng)人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院