新型超靈敏性elisa方法的建立的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具有高檢測靈敏度的新型ELISA方法，其檢測靈敏度可達(dá)現(xiàn)有ELISA方法的100倍，本發(fā)明使用更為靈敏的新型的熒光底物取代傳統(tǒng)ELISA方法中的化學(xué)顯色底物，并且選擇高效穩(wěn)定的可催化所述熒光底物產(chǎn)生發(fā)光效應(yīng)的酶作為標(biāo)記酶，實(shí)現(xiàn)使底物的發(fā)光效應(yīng)達(dá)到可檢測水平所需的酶量最少，本發(fā)明還使用生物兼容性良好的金納米顆粒偶聯(lián)鏈霉親和素系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)的放大效應(yīng)，綜合這三方面的改進(jìn)措施，最終實(shí)現(xiàn)ELISA方法檢測靈敏度的大幅度提高。
【專利說明】新型超靈敏性ELISA方法的建立
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫學(xué)檢測方法，尤其地涉及一種新的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA),是一種基于抗原抗體間特異性反應(yīng)建立的用于檢測樣品中抗原或抗體的免疫學(xué)檢測方法，該方法具有簡潔、快速、靈敏等特點(diǎn)。自從Engvall和Perlmann于1971年發(fā)明以來該方法得到了迅猛的發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于各種抗原抗體的檢測。其基本原理是將酶分子共價(jià)偶聯(lián)在抗體或抗抗體分子上，這種偶聯(lián)不改變抗體的免疫學(xué)特性以及酶的催化活性，酶標(biāo)抗體再與吸附在固相載體上的抗原或抗體特異性結(jié)合，加入酶底物溶液后，底物在標(biāo)記酶的催化下產(chǎn)生顏色反應(yīng)，根據(jù)顏色反應(yīng)的強(qiáng)弱來判斷樣品中抗原或抗體的含量。ELISA方法集酶催化反應(yīng)的靈敏性和抗原抗體間結(jié)合的特異性于一體，從而賦予了此方法高靈敏性和高特異性。
[0003]以抗原抗體間特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的免疫學(xué)定量檢測方法始于1959年由Yalow和Berson[2]發(fā)明的用放射性同位素標(biāo)記來檢測胰島素的放射免疫試驗(yàn)。此后科學(xué)工作者在研究此類方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然該方法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在用于標(biāo)記的同位素對人身傷害性大，而且需要復(fù)雜的檢測設(shè)備等缺點(diǎn)，因此大大限制了此方法的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。1971年,Engval I和Perlmann用堿性磷酸酶代替放射性同位素標(biāo)記抗體定量檢測了血清中的免疫球蛋白，成功地建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，自此免疫血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)入了酶標(biāo)記時(shí)代。酶標(biāo)記法較之前有明顯的優(yōu)點(diǎn)，首先該標(biāo)記為共價(jià)標(biāo)記，具有較好的穩(wěn)定性，可保持?jǐn)?shù)月至數(shù)年有效。其次，酶催化反應(yīng)為顯色反應(yīng)，讀數(shù)時(shí)僅需要廉價(jià)簡單的光學(xué)儀器。再次，酶催化反應(yīng)具有高效性，所以保證了 ELISA方法的高度靈敏性，這也是該方法一個(gè)顯著的特點(diǎn)。用于標(biāo)記的酶應(yīng)該具備下特性:在不破壞抗原抗體結(jié)合的溫度和PH條件下具有高度的酶活性；能夠以簡易敏感的方法檢出；能夠被大量地高度純化，且保持可溶性和穩(wěn)定性；應(yīng)具有能夠與抗原抗體共價(jià)結(jié)合的活性基團(tuán)，并且結(jié)合后不影響其催化活性以及抗原抗體的結(jié)合活性；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)[3]。目前應(yīng)用較多的有辣根過氧化物酶(HRP)、脲酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用最為廣泛。HRP最常用的可溶性顯色底物為聯(lián)苯二胺(OPD)和四甲基聯(lián)苯胺(ΤΜΒ)，其中，TMB是一種優(yōu)于OPD的新型HRP色原底物。在HRP和H2O2的存在下，OPD氧化而聚合成2，2’ 一二氨基偶氮苯，ρΗ=1.0時(shí)，最大吸收波長492nm ；TMB氧化產(chǎn)生聯(lián)苯醌，最大吸收波長450nm。
[0004]由于ELISA方法的諸多優(yōu)點(diǎn)，自建立以來得到了迅速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，僅在1976年就有報(bào)道稱[4]，在當(dāng)時(shí)的條件下已建立了 19種抗原28種抗體的ELISA檢測方法。至今，該方法可檢測的抗原抗體早已數(shù)不勝數(shù)。隨著科技的進(jìn)步ELISA方法已實(shí)現(xiàn)了高通量和自動化檢測，同時(shí)檢測靈敏度也成為了眾多研究者和使用者關(guān)心的問題。在過去的幾十年科研工作者在如何提高ELISA檢測靈敏度上做出了巨大的努力，Kato等于1977年[5]建立了檢測鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的非競爭性夾芯(“三明治”)ELISA方法，并且運(yùn)用純化抗體和抗體絞鏈區(qū)偶聯(lián)技術(shù)，降低了背景值，檢測靈敏性得到了顯著的提高。阻礙ELISA方法靈敏性提高的主要因素是酶標(biāo)抗體的非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的高背景值，而降低背景值最簡單有效的方法是，減小固相載體的表面積，為了解決這一問題，Ruan等于1987年[6]應(yīng)用微球技術(shù)建立了微小型“三明治”酶聯(lián)免疫試驗(yàn)，在夾芯ELISA的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了靈敏度。Hashida等又于1988年m建立了一種新型的“三明治”轉(zhuǎn)移酶聯(lián)免疫試驗(yàn)方法，通過結(jié)合-洗脫-再結(jié)合的步驟，提高了特異性結(jié)合率，顯著地降低了背景值，又一次提高了 ELISA方法的檢測靈敏性。此后，提高靈敏性的研究主要集中在改進(jìn)“三明治”轉(zhuǎn)移酶聯(lián)免疫試驗(yàn)方法以及將微小型“三明治”酶聯(lián)免疫試驗(yàn)和“三明治”轉(zhuǎn)移酶聯(lián)免疫試驗(yàn)相結(jié)合來提高靈敏性上，包括抗原、抗體以及半抗原的檢測技術(shù)M。1999年Ishikawat9]等應(yīng)用“三明治”轉(zhuǎn)移酶聯(lián)免疫試驗(yàn)和微小型“三明治”酶聯(lián)免疫試驗(yàn)相結(jié)合的方法建立了 HIV-lp24抗原的超敏感檢測技術(shù)，使抗原的檢測濃度低至pg/mL級。但是，無論微小型“三明治”酶聯(lián)免疫試驗(yàn)還是“三明治”轉(zhuǎn)移酶聯(lián)免疫試驗(yàn)的試驗(yàn)步驟都較普通的夾芯ELISA法繁瑣，而且這些方法每檢測一種抗原都需要標(biāo)記該抗原的一種甚至兩種抗體，所以這兩種方法沒有得到廣泛的應(yīng)用，只有特殊要求的檢測才會采用。相比之下，夾芯ELISA操作簡單、快捷、標(biāo)記一種抗抗體就能夠檢測多種抗原，并且標(biāo)記的抗抗體容易被商品化，靈敏度能夠達(dá)到一般的檢測要求，所以，該方法得到了廣泛接受和應(yīng)用，并且沿用至今，并已商品化為多種抗原的檢測試劑盒。此外，用熒光底物替代顯色底物來提高檢測靈敏性也有報(bào)道[1°]，熒光底物(以堿性磷酸酶為例)較顯色底物敏感至少百倍。
[0005]自上世紀(jì)80年代納米技術(shù)出現(xiàn)以來，由于其良好的生物兼容性，衍生出納米生物學(xué)分支，將納米粒子引入生物學(xué)研究領(lǐng)域，并已有學(xué)者將其應(yīng)用于檢測方法中來[11]，Nam使用微磁球、探針DNA芯片技術(shù)和銀染相結(jié)合的方法(簡稱BCA法)使前列腺特異性蛋白(PSA)的最低可檢測濃度降至lfg/mL (I X 10-18g/mL),與此前傳統(tǒng)的PSA檢測試劑盒相比靈敏性提高了 IO5倍。Nam等人于2004年又用該技術(shù)建立了檢測DNA的方法[12]，靈敏性達(dá)到與PCR方法相當(dāng)?shù)乃?10個(gè)拷貝)。在隨后的幾年里，基于BCA方法又出現(xiàn)了多種蛋白的超靈敏性檢測方法。Ambrosi等[13]用金納米偶聯(lián)酶標(biāo)抗體的方法將檢測乳腺癌的ELISA方法檢測靈敏性提高了一倍。Tang等[14’15]于2007和2010年建立HIV_lp24抗原檢測的BCA法使P24抗原的可檢測濃度達(dá)到0.lpg/mL，與傳統(tǒng)的ELISA方法相比靈敏性提高了 100倍，可提前3天檢測到病人體內(nèi)的p24抗原。由此可見納米顆粒在檢測方法中應(yīng)用的廣闊前景。
[0006]夾芯ELISA方法是目前最為常用的抗原和抗體的檢測手段，該方法具有操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。其基本原理是，檢測抗體時(shí)，把相應(yīng)的抗原分子包被在聚苯乙烯固相載體上，加入被檢測樣品，孵育，洗滌，加入酶標(biāo)抗抗體，再孵育、洗滌，然后加入酶底物顯色，在酶標(biāo)儀上讀取數(shù)據(jù)，根據(jù)底物顯色反應(yīng)的強(qiáng)弱來判斷被檢樣品中抗體的含量；檢測抗原時(shí)，把針對該抗原的抗體分子包被在固相載體上，加入被檢樣品，孵育，洗滌，再加入被檢抗原的另一種抗體(二抗)，孵育，洗滌，加入酶標(biāo)抗二抗的抗體，再孵育、洗滌，最后加入酶底物顯色，讀數(shù)，根據(jù)顏色反應(yīng)的強(qiáng)弱來判斷樣品中抗原的含量。
[0007]雖然夾芯ELISA方法敏感性高，但隨著生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和光學(xué)檢測領(lǐng)域的發(fā)展，簡單快捷的ELISA方法的敏感性依然亟待提高，尤其在醫(yī)學(xué)臨床診斷方面，痕量病原微生物抗原的早期檢測，對某些疾病尤其是傳染病的早期診斷及時(shí)治療以提高治愈率、盡早抑制病原體的傳播具有重要意義。而現(xiàn)行ELISA方法中應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP),其底物為OPD或TMB顯色反應(yīng)底物,該顯色底物的靈敏度(在現(xiàn)有的條件下能夠檢測到顯色反應(yīng)所需的最低酶濃度，酶濃度越高靈敏度越低)要遠(yuǎn)低于熒光底物[1°]，這為ELISA方法靈敏性的進(jìn)一步提高提供了理論基礎(chǔ)。此外，被標(biāo)記的抗抗體(MW:75kd)和HRP酶(MW:40kd)的分子大小相近，故每個(gè)抗抗體分子上偶聯(lián)的酶分子個(gè)數(shù)較少，若被檢樣品中目的分子含量極少，隨抗抗體結(jié)合到固相上的酶濃度便達(dá)不到顯色底物的靈敏度，從而限制了 ELISA方法靈敏性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種具有高檢測靈敏度的新型ELISA方法，其檢測靈敏度可達(dá)現(xiàn)有ELISA方法的100倍，本發(fā)明的改進(jìn)之處在于:首先，使用更為靈敏的新型的熒光底物取代傳統(tǒng)ELISA方法中的化學(xué)顯色底物。其次，選擇高效穩(wěn)定的可催化所述熒光底物產(chǎn)生發(fā)光效應(yīng)的酶作為標(biāo)記酶，實(shí)現(xiàn)使底物的發(fā)光效應(yīng)達(dá)到可檢測水平所需的酶量最少。再次，應(yīng)用生物兼容性良好的金納米顆粒偶聯(lián)鏈霉親和素系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)的放大效應(yīng)，綜合這三方面的改進(jìn)措施，最終實(shí)現(xiàn)ELISA方法檢測靈敏度的大幅度提高(圖1)。
[0009]本發(fā)明的具有高檢測靈敏度的新型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，其特征在于，使用核酸酶作為標(biāo)記酶，使用由通過核酸分子連接的淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)組成的核酸分子水解熒光底物作為所述酶的底物，并使用可檢測熒光的儀器檢測所述酶催化所述底物產(chǎn)生的熒光來測量待測樣品中目標(biāo)物水平。
[0010]具體地，本發(fā)明的高靈敏度ELISA方法包括以下步驟:
[0011](a)使待測樣品與固定化至固體支持物上的捕捉試劑接觸并一起孵育，然后除去所述待測樣品，其中所述待測樣品中的目標(biāo)物被所述捕捉試劑捕獲形成目標(biāo)物-捕捉試劑復(fù)合物，
[0012](b)將連接有核酸酶的結(jié)合試劑加入到所述固體支持物中并孵育，然后除去所述結(jié)合試劑，其中所述結(jié)合試劑與步驟(a)中形成的目標(biāo)物-捕捉試劑復(fù)合物相結(jié)合，
[0013](c)將核酸分子水解熒光底物加入到所述固體支持物中并孵育，
[0014](d)使用可檢測熒光的儀器檢測熒光來測量待測樣品中目標(biāo)物水平，
[0015]其中，所述核酸分子水解熒光底物由通過核酸分子連接的淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)組成，核酸分子完整時(shí)淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)接近，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光由淬滅基團(tuán)吸收，整個(gè)分子不能被檢測到熒光。當(dāng)核酸分子被核酸酶水解后淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光不能被淬滅基團(tuán)吸收，從而使光檢測系統(tǒng)檢測到熒光信號。所述核酸分子可以是RNA (核糖核酸)或DNA (脫氧核糖核酸)，優(yōu)選DNA。所述核酸分子可以為任意序列，也可以為單鏈或雙鏈。所述核酸分子的長度可以為2bp以上，優(yōu)選15bp以上，最大為約50bp，更優(yōu)選為30bp。
[0016]所述熒光基團(tuán)可以選自本領(lǐng)域已知的熒光基團(tuán)，例如JOE (2，7 —二甲基一 4，5 —二氯一 6 —羧基熒光素)、FAM (羧基熒光素)、TET (四氯-6-羧基熒光素)等。JOE熒光產(chǎn)量高，PH敏感性弱，與淬滅基團(tuán)IAbFQ接近時(shí)熒光淬滅完全，背景值低。優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為J0E。
[0017]所述淬滅基團(tuán)可以選自本領(lǐng)域已知的淬滅基團(tuán),例如IAbFQ (1wa Black突光淬滅劑，美國 Integrated DNA Technologies 公司)、BHQl (Black Hole Quencher-1,黑洞淬滅劑-1)、TAMRA (6-羧基四甲基若丹明)等。上述熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)可自由組合成熒光基團(tuán)淬滅基團(tuán)對，只要淬滅基團(tuán)的最大吸收波段落在熒光基團(tuán)的最大發(fā)射波段即可，所述熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)組合例如FAM-TAMRA、TET-BHQl、JOE-1AbFQ等，優(yōu)選J0E_IAbFQ。
[0018]所述核酸酶可選擇已知的可催化核酸分子水解的任何酶,優(yōu)選TurboNuclease核酸酶。核酸酶可催化所述核酸分子水解熒光底物中的核酸分子水解，使得淬滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離，產(chǎn)生發(fā)光效應(yīng)。TurboNuclease核酸酶是Serratia macescens (沙雷菌屬)的一種胞外核酸內(nèi)切酶，對核酸具有高效的水解活性，對核酸的種類和序列無特異性，可以將單鏈和雙鏈的DNA或RNA徹底切割成l_4bp的寡聚核苷酸。該酶的高效水解特性保證了ELISA方法的高度敏感性。
[0019]所述TurboNuclease核酸酶與本發(fā)明方法步驟(b)所述的結(jié)合試劑可直接連接，或者所述TurboNuclease核酸酶與所述結(jié)合試劑通過本領(lǐng)域已知的生物素_親和素放大系統(tǒng)相連接。例如，可使用生物化的結(jié)合試劑與所述目標(biāo)物-捕捉試劑復(fù)合物相結(jié)合，然后加入鏈霉親和素，鏈霉親和素與所述生物素化的結(jié)合試劑結(jié)合，然后加入生物素化的TurboNuclease核酸酶，其與所述鏈霉親和素結(jié)合，最后加入核酸分子水解熒光底物，通過使用可檢測熒光的儀器例如熒光定量PCR儀檢測所產(chǎn)生的熒光來測量待測樣品中目標(biāo)物水平。
[0020]另外，使用生物兼容性較好的金納米顆粒，與鏈霉親和素偶聯(lián)后可連接上數(shù)十個(gè)酶分子，從而以增加結(jié)合酶量的形式產(chǎn)生放大效應(yīng)，增加熒光產(chǎn)量，進(jìn)一步提高靈敏性。
[0021]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的ELISA方法中靈敏度的提高僅涉及ELISA中的生物素-親和素放大系統(tǒng)以及標(biāo)記酶-底物檢測系統(tǒng)，特別是標(biāo)記酶-底物檢測系統(tǒng)，而與具體檢測所使用的抗體/抗原種類以及抗體/抗原與生物素/親和素或固體支持物的連接方式或順序無關(guān)，因此本發(fā)明的高靈敏度ELISA方法可用于檢測任何傳統(tǒng)ELISA方法可以檢測的物質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1.經(jīng)典ELISA與本發(fā)明新型ELISA方法原理比較示意圖。
[0023]圖2.使用新型ELISA方法(A)與經(jīng)典ELISA方法(B)以及無金納米顆粒的新型ELISA方法(C)檢測抗HIV-lgpl20單抗時(shí)靈敏度的比較。
[0024]圖3.使用新型ELISA方法(A)與經(jīng)典ELISA方法(B)檢測抗EV71VP1單抗時(shí)靈敏度的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下通過實(shí)施例來說明本發(fā)明的ELISA方法相對于傳統(tǒng)ELISA方法的靈敏度的提高，但應(yīng)理解，實(shí)施例僅為示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。
[0026]實(shí)施例
[0027]本文實(shí)施例中用到的實(shí)驗(yàn)材料及試劑等如下:
[0028]實(shí)驗(yàn)材料:
[0029]儀器:ELISA酶標(biāo)板(JET BIOFIL, FEP-101-896，中國)，酶標(biāo)儀(BioTek, ELx800,美國)，熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad，Chromo4System, CFB-3240，美國)，PCR 八連管(Bio-Rad,TLS0801，美國)。
[0030]試劑:熒光底物5，_/5IAbFQ/GCG GAT CCC GCC TCT TGA GGC GGG ATC CGC (SEQID NO:1)/3J0E —N/-3’ (IO^4M, Integrated DNA Technologies，美國)，Tris (三羥甲基氨基甲烷，Genview，77-86-1，美國)，TMB (天根，PA107，中國)，氯化鎂(Sigma，7786-30-3，美國)，鏈霉親和素(Invitrogen,貨號S888), 40nm金納米顆粒-鏈霉親和素(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，中國)，生物素化 TurboNuclease (0.27mg/mL, Accelagen, N0103M,美國)，HIV-lgpl20 (1.86mg/mL,杜克大學(xué)人類疫苗研究所，美國)，生物素化抗HIV-lgpl20單抗(3B3,0.83mg/mL,杜克大學(xué)人類疫苗研究所，美國)，生物素化HRP (2.5mg/mL, Invitrogen,43-20-40，美國)。BSA (牛血清白蛋白Genview，9048-46-8，美國)，脫脂奶粉(伊利，中國)。EV71VP1蛋白(腸道病毒71型VPl蛋白，1.2mg/mL,由本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)[16]保存)，生物素化抗EV71VP1的186&亞型單抗(2!12，0.81mg/mL,由本實(shí)驗(yàn)室制備[17’18]保存)。[0031]溶液:TurboNuclease反應(yīng)緩沖液:50mM Tris-HCl 和 ImM MgCl2,pH=8.0。憐酸鹽緩沖液(PBS):130mM NaCl、3mM KClUOmM Na2HP4,2mM KH2PO4, ρΗ=7.4。碳酸鹽緩沖液:15mMNa2CO3, 35mM NaHCOyTurboNuclease 酶反應(yīng)緩沖液:50mM ρΗ8.0 的 Tris-HCl 和 ImM MgCl20
[0032]實(shí)施例1使用本發(fā)明的新型ELISA方法檢測抗HIV_lgpl20單抗
[0033]實(shí)駘步驟:
[0034]一、ELISA酶標(biāo)板的包被。
[0035]1.將HIV-lgpl20用包被液(碳酸鹽緩沖液，ρΗ9.6)稀釋至2 μ g/mL，加入至ELISA酶標(biāo)板孔中，100 μ L/孔。置于4°C，18h。
[0036]2.室溫下，甩凈孔內(nèi)溶液，拍干。加入含2%0 (體積)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平搖床上搖5min，甩凈孔內(nèi)洗滌液，拍干。重復(fù)洗滌5次。
[0037]3.加入200 μ L/孔的含5% (質(zhì)量體積比)脫脂奶粉的PBS，置于37°C，4h。
[0038]4.室溫下,甩凈孔內(nèi)溶液,拍干。加入含2%0 (體積)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平搖床上搖5min，甩凈孔內(nèi)洗滌液，拍干。重復(fù)洗滌5次。真空包裝，_20°C保存，待用。
[0039]二、ELISA 試驗(yàn)。
[0040]1.向包被好的ELISA板中加入100 μ L/孔的PBS，置于室溫lOmin，甩凈。
[0041]2.用含1%(質(zhì)量體積比)BSA的PBS對生物素化3B3單抗(抗HIV_lgpl20，0.83mg/mL)進(jìn)行10倍系列稀釋，將稀釋倍數(shù)分別為104、105、106、107、108、109、1010的3B3單抗以100 μ I/孔加入至ELISA板中，設(shè)置加入含1% (質(zhì)量體積比)BSA的PBS而不加入3Β3單抗的孔作為陰性對照，置于37°C孵育1.5h。
[0042]3.室溫下，甩凈孔內(nèi)溶液，拍干。加入含2%0 (體積)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平搖床上搖5min，甩凈孔內(nèi)洗滌液，拍干。重復(fù)洗滌5次。
[0043]4.用含1%(質(zhì)量體積比)BSA的PBS稀釋40nm金納米顆粒-鏈霉親和素至0.05nM,以50 μ L/孔加入至ELISA板，置于370C 40min。
[0044]5.室溫下，甩凈孔內(nèi)溶液，拍干。加入含2%0 (體積)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平搖床上搖5min，甩凈孔內(nèi)洗滌液，拍干。重復(fù)洗滌5次。
[0045]6.用含1%(質(zhì)量體積比)BSA的PBS稀釋生物素化的TurboNuclease酶至0.27 μ g/mL,以100 μ L/孔加入至ELISA板，設(shè)置加入含1% (質(zhì)量體積比)BSA的PBS而不加入TurboNuclease酶的孔作為空白對照，置于37°C 40min。
[0046]7.室溫下，甩凈孔內(nèi)溶液，拍干。加入含2%0 (體積)Tween_20的PBS，250 μ L/孔，置于水平搖床上搖5min，甩凈孔內(nèi)洗滌液，拍干。重復(fù)洗滌5次。
[0047]8.用TurboNuclease酶反應(yīng)緩沖液稀釋熒光底物至0.5 X IO^6M,以50 μ L/孔加入至ELISA板，置于37°C孵育lh。
[0048]9.將ELISA板中的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PCR八連管內(nèi)，用熒光定量PCR儀，讀取熒光值。
[0049]試驗(yàn)結(jié)果及分析:
[0050]將熒光值> 2.1倍陰性對照均值判斷為陽性，熒光值< 2.1倍陰性對照均值判斷為陰性。新型ELISA檢測結(jié)果如圖2 (A)所示，陰性對照的平均值為0.104±0.002 (均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，故熒光值> 0.22的稀釋度為陽性，熒光值< 0.22的稀釋度為陰性。本實(shí)驗(yàn)中IO6倍稀釋的熒光值為0.448，為陽性；107倍稀釋的熒光值為0.213，為陰性。所以該新型ELISA方法檢測靈敏性可達(dá)到IO6倍稀釋(對應(yīng)的3B3單抗?jié)舛葹?.86 X 10_6mg/ml )。
[0051]實(shí)施例2使用經(jīng)典ELISA方法檢測抗HIV_lgpl20單抗
[0052]在與實(shí)施例1相同的試驗(yàn)條件下，使用生物素化HRP (使用濃度2.5Xl(T5mg/ml)替代生物素化TurboNuc I ease，使用TMB顯色底物(使用濃度0.05g/L)替代熒光底物，使用無金納米顆粒的鏈霉親和素(使用濃度5X 10_4mg/ml)替代40nm金納米顆粒-鏈霉親和素，按實(shí)施例1所述步驟進(jìn)行經(jīng)典ELISA方法靈敏度檢測。
[0053]試驗(yàn)結(jié)果如圖2 (B)所示，陰性對照的平均值為0.082±0.001，所以當(dāng)OD值>
0.17時(shí)的稀釋度為陽性，OD值< 0.17時(shí)的稀釋度為陰性，此次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IO4倍稀釋的OD值為0.884，為陽性；105倍稀釋的OD值為0.138，為陰性。所以經(jīng)典ELISA方法檢測靈敏性只達(dá)到IO4倍稀釋(對應(yīng)的3B3單抗?jié)舛葹?.86X l(T4mg/ml)，比本發(fā)明的新型ELISA方法低了兩個(gè)數(shù)量級。
[0054]實(shí)施例3使用無金納米顆粒的新型ELISA方法檢測抗HIV_1 gpl20單抗
[0055]在與實(shí)施例1相同的試驗(yàn)條件下，使用無金納米顆粒的鏈霉親和素(使用濃度5X l(T4mg/ml)替代40nm金納米顆粒-鏈霉親和素，按實(shí)施例1所述步驟進(jìn)行不使用金納米顆粒的新型ELISA方法的靈敏度檢測。
[0056]試驗(yàn)結(jié)果如圖2 (C)所示，陰性對照的平均值為0.103±0.001，所以當(dāng)熒光值> 0.22時(shí)的稀釋度為陽性，熒光值< 0.22時(shí)的稀釋度為陰性，此次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IO5倍稀釋的熒光值為0.625，為陽性；106倍稀釋的熒光值為0.20，為陰性，所以使用本發(fā)明的TurboNuclease酶及核酸分子水解突光底物而不使用金納米顆粒的新型ELISA方法的靈敏性達(dá)到IO5倍稀釋(對應(yīng)的3B3單抗?jié)舛葹?.86X l(r5mg/ml)，相對于經(jīng)典ELISA方法提高了一個(gè)數(shù)量級。
[0057]實(shí)施例4使用新型ELISA和經(jīng)典ELISA方法檢測抗EV71VP1單抗時(shí)靈敏度的比較
[0058](I)在與實(shí)施例1相同的試驗(yàn)條件下，使用EV71VP1蛋白和生物素化抗EV71VP1單抗，將抗EV71VP1單抗分別稀釋IO1UO2UO3' 104、105、106、107、IO8、IO9和101°倍，按照實(shí)施例1所述步驟使用新型ELISA方法檢測抗EV71VP1單抗，結(jié)果如圖3 (A)所示，陰性對照的平均值為0.112±0.002，按照熒光值> 2.1倍陰性對照均值判斷為陽性，熒光值< 2.1倍陰性對照均值判斷為陰性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，此次實(shí)驗(yàn)中IO6倍稀釋的熒光值為0.618，為陽性；107倍稀釋的熒光值為0.20，為陰性，所以使用新型ELISA方法檢測抗EV71VP1單抗時(shí)靈敏度達(dá)到IO6倍稀釋。
[0059](2)在與實(shí)施例1相同的試驗(yàn)條件下，使用生物素化HRP (使用濃度2.5X 10—5mg/ml)替代生物素化TurboNuclease，使用TMB顯色底物(使用濃度0.05g/L)替代熒光底物，使用無金納米顆粒的鏈霉親和素(使用濃度5X10—4mg/ml)替代40nm金納米顆粒-鏈霉親和素，使用EV71VP1蛋白和生物素化抗EV71VP1單抗，將抗EV71VP1單抗分別稀釋1O102^103、104、105、106、107、108、IO9和1O10倍，按實(shí)施例1所述步驟使用經(jīng)典ELISA方法檢測抗EV71VP1 單抗。
[0060]結(jié)果如圖3 (B)所示，陰性對照的平均值為0.098±0.002，按照OD值>2.1倍陰性對照均值判斷為陽性，OD值< 2.1倍陰性對照均值判斷為陰性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，此次實(shí)驗(yàn)中IO4倍稀釋的熒光值為0.687，為陽性；IO5倍稀釋的熒光值為0.18，為陰性，所以使用經(jīng)典ELISA方法檢測抗EV71VP1單抗時(shí)靈敏度達(dá)到IO4倍稀釋。
[0061]由以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明的新型ELISA方法靈敏度可達(dá)經(jīng)典ELISA方法的100倍，同時(shí)也證明本發(fā)明的新型ELISA方法可適用于以高靈敏度檢測任何傳統(tǒng)ELISA方法可以檢測的物質(zhì)。
[0062]參考文獻(xiàn):
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【權(quán)利要求】
1.一種酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，其特征在于，使用核酸酶作為標(biāo)記酶，使用由通過核酸分子連接的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)組成的核酸分子水解熒光底物作為所述酶的底物，并使用可檢測熒光的儀器檢測所述酶催化所述底物產(chǎn)生的熒光來測量待測樣品中目標(biāo)物的水平。
2.權(quán)利要求1的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，包括以下步驟: (a)使待測樣品與固定化至固體支持物上的捕捉試劑接觸并一起孵育，然后除去所述待測樣品，其中所述待測樣品中的目標(biāo)物被所述捕捉試劑捕獲形成目標(biāo)物-捕捉試劑復(fù)合物； (b)將連接有核酸酶的結(jié)合試劑加入到所述固體支持物中并孵育，然后除去所述結(jié)合試劑，其中所述結(jié)合試劑與步驟(a)中形成的目標(biāo)物-捕捉試劑復(fù)合物相結(jié)合； (c)將核酸分子水解熒光底物加入到所述固體支持物中并孵育； Cd)使用可檢測熒光的儀器檢測熒光來測量待測樣品中目標(biāo)物的水平。
3.權(quán)利要求2的方法，其中，所述核酸酶與所述結(jié)合試劑通過生物素-親和素放大系統(tǒng)相連接。
4.權(quán)利要求3的方法，其中，所述核酸酶和結(jié)合試劑分別與生物素相連，它們通過偶聯(lián)有鏈霉親和素的金納米顆粒連接。
5.權(quán)利要求2的方法，其中，所述捕捉試劑是抗原，所述結(jié)合試劑是抗體；或者所述捕捉試劑是抗體，所述結(jié)合試劑是抗原。
6.權(quán)利要求1-5之一的方法，其中，所述熒光基團(tuán)為JOE、FAM或TET，所述淬滅基團(tuán)為IAbFQ、BHQl 或 TAMRA。
7.權(quán)利要求6的方法，其中，所述熒光基團(tuán)為J0E，所述淬滅基團(tuán)為IAbFQ。
8.權(quán)利要求1-5之一的方法,其中,所述核酸酶為TurboNuclease核酸酶。
9.權(quán)利要求8的方法，其中，所述核酸分子的長度為2bp以上，最大為50bp。
10.權(quán)利要求9的方法，其中，所述核酸分子的長度為30bp。
【文檔編號】G01N21/64GK103513027SQ201310455146
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】高峰, 姜春來, 范培虎, 孔維 申請人:長春百克生物科技股份公司