本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別涉及蛋白的檢測(cè)技術(shù)，特別涉及帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
急性早幼粒細(xì)胞白血病（acutepromyeolicleukemia,APL）是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，是急性髓細(xì)胞白血病的一個(gè)特殊類型，發(fā)病迅速，致死率高，在FAB分型系統(tǒng)中被定義為M3型。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，約97％的APL發(fā)生特征性的t(15;17)(15q22;17q21)染色體易位，形成早幼粒細(xì)胞白血病-維甲酸受體α融合基因（PML-RARα）。該基因表達(dá)的PML-RARα融合蛋白是APL發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。但PML-RARα融合蛋白并非始終以整體的形式發(fā)揮作用。Lane等[2]發(fā)現(xiàn)，中性白細(xì)胞彈性蛋白酶(NeutrophilElastase，NE)可將PML-RARα融合蛋白裂解成52KDa的PML(NLS-)和61KDa的NLS-RARα兩種變異蛋白。并且已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，PML-RARα轉(zhuǎn)染入在早期髓細(xì)胞中，很容易發(fā)展成為APL白血病細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)染入晚期髓細(xì)胞，結(jié)果卻不能發(fā)展為APL細(xì)胞。Lane等的后繼研究也表明，在不含NE的早期髓細(xì)胞中，單純導(dǎo)入的PML-RARα未被裂解，其發(fā)生APL的概率僅為2%～3%，遠(yuǎn)低于富含NE的早期髓細(xì)胞。因此我們可以通過檢測(cè)血細(xì)胞中的切割產(chǎn)物NLS-RARα蛋白，為早期診斷APL提供依據(jù),本研究就是初步探討NLS-RARα蛋白的檢測(cè)方法，為以后運(yùn)用于臨床奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是基于上述現(xiàn)有技術(shù)，并針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足進(jìn)行改進(jìn)發(fā)明的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供一種帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，該方法準(zhǔn)確度高，精度高。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，所述方法為激光共聚焦法，將染色后的靶細(xì)胞置于激光共聚焦顯微鏡的適應(yīng)波長(zhǎng)的熒光通道中，所述染料方式可以為FITC-AnnexinV/DAPI雙染色，捕獲靶細(xì)胞中各部位的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，對(duì)靶細(xì)胞各部位熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以判斷靶細(xì)胞中帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的存在。所述熒光通道為藍(lán)綠雙色熒光通道，所述適應(yīng)波長(zhǎng)是指：藍(lán)光的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm,在600nm波長(zhǎng)以上觀察。綠光的激發(fā)波長(zhǎng)為543nm,在600nm波長(zhǎng)以上觀察。進(jìn)一步，所述的帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，所述靶細(xì)胞為HL-60或急性早幼粒細(xì)胞白血病病人血中性粒細(xì)胞。進(jìn)一步，所述的帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，還設(shè)置有陰性對(duì)照組和/或空白對(duì)照組。主要是檢測(cè)HL-60細(xì)胞或病人血中性粒細(xì)胞中NLS-RARα的表達(dá)及定位，以K562細(xì)胞中野生型RARα的表達(dá)及定位作陰性對(duì)照。進(jìn)一步，所述的帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，所述靶細(xì)胞被制成切片，具體為：取靶細(xì)胞涂片，并用多聚甲醛進(jìn)行固定，再對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行透膜處理，得切片。進(jìn)一步，所述的帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行染色，具體為：用RARα特異性抗體與所述靶細(xì)胞結(jié)合，再用FITC-AnnexinV標(biāo)記的熒光二抗孵育。進(jìn)一步，所述的帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，所述RARα特異性抗體為兔抗人RARα的多克隆抗體；所述RARα特異性抗體和所述熒光二抗按1:200的體積比稀釋。進(jìn)一步，所述的帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，在激光共聚焦法之前，還包括預(yù)實(shí)驗(yàn)Ⅰ，所述預(yù)實(shí)驗(yàn)為采用Westernblotting驗(yàn)證HL-60細(xì)胞中的NE酶，中性白細(xì)胞彈性蛋白酶(NeutrophilElastase，NE)可將PML-RARα融合蛋白裂解成52KDa的PML(NLS-)和61KDa的NLS-RARα兩種變異蛋白。NE的這一特異性切割在APL的發(fā)生發(fā)展中起到了非常重要的作用。NE酶的檢測(cè)方式具體為：分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的目的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，RIPA裂解后提取細(xì)胞總蛋白，定量稱取，進(jìn)行SDS-PADE電泳，以半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉，加入兔抗人NE多抗，所述兔抗人NE多抗作1:500體積稀釋，進(jìn)行洗膜，并加入羊抗兔二抗孵育，然后洗膜，于暗室化學(xué)發(fā)光顯影成像判斷NE酶是否存在，以β-actin作為對(duì)照。進(jìn)一步，所述的的帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，在激光共聚焦法之前，還包括預(yù)實(shí)驗(yàn)Ⅱ，所述預(yù)實(shí)驗(yàn)為采用Westernblotting驗(yàn)證帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白，具體為：分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞，用試劑盒提取胞核蛋白，定量稱取，進(jìn)行SDS-PADE電泳，以半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉，加入兔抗人RARα多抗，所述多抗作1:500體積稀釋，進(jìn)行洗膜，并加入羊抗兔二抗孵育，所述羊抗兔二抗作1:1000倍體積稀釋，然后洗膜，于暗室化學(xué)發(fā)光顯影成像判斷帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白是否存在，以HistoneH3作為對(duì)照。其中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組涂片的熒光強(qiáng)度平均值為正常對(duì)照組切片的Z值的平均值的Y倍及以上時(shí)，判定為所述靶細(xì)胞中存在帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白;所述Y為1.40除以0.42的值；所述Z值等于目的條帶灰度值（光強(qiáng)度）除以核內(nèi)參灰度值（光強(qiáng)度）的值。進(jìn)一步，所述的帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，在激光共聚焦法同時(shí)，還包括平行實(shí)驗(yàn)，所述平行實(shí)驗(yàn)采用了細(xì)胞熒光免疫法，具體為：A制備涂片取靶細(xì)胞涂片，并用多聚甲醛進(jìn)行固定，再對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行透膜處理，得切片；B熒光染色對(duì)步驟A所得切片封閉處理后，用RARα抗體與切片上的所述靶細(xì)胞共孵育，形成復(fù)合物，用熒光二抗與所述復(fù)合物孵育至充分結(jié)合，得熒光染色切片；C熒光強(qiáng)度的獲取和分析在熒光顯微鏡下掃描熒光染色切片，每張所述切片選取熒光表達(dá)最強(qiáng)的視野觀察，視野數(shù)具有統(tǒng)計(jì)數(shù)意義，并由計(jì)算機(jī)掃描軟件分析結(jié)果。進(jìn)一步，所述的帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白的檢測(cè)方法，所述平行實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置有實(shí)驗(yàn)組、正常對(duì)照組；步驟C中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組切片的熒光強(qiáng)度平均值為正常對(duì)照組切片的熒光強(qiáng)度平均值的X倍及以上時(shí)，判定為所述靶細(xì)胞中存在帶核定位信號(hào)的維甲酸受體α蛋白;所述X為0.8600±0.04084除以0.2933±0.04726的值。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明以HL-60細(xì)胞為急性早幼粒細(xì)胞白血病的模型，成功建立一種集合檢測(cè)NLS-RARα蛋白的方法，該方法集成了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)為一體，為APL的早期診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)提供了新思路，為進(jìn)一步研究APL的臨床診斷和治療奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1為Westernblot驗(yàn)證HL-60細(xì)胞中的NE酶，其中，1：HL-60組；2：K562組。圖2為Westernblot檢測(cè)HL-60細(xì)胞中的NLS-RARα蛋白；其中，1：HL-60組；2：K562組。圖3為細(xì)胞免疫熒光圖，其中，A:HL-60細(xì)胞PI染色的胞核；B:HL-60細(xì)胞中FITC染色區(qū)域；C:A與B融合圖；D:K562細(xì)胞PI染色的胞核；E:K562細(xì)胞中FITC染色區(qū)域;F:D與E融合圖。圖4為激光共聚焦結(jié)果，其中，A:HL-60細(xì)胞PI染色的胞核；B:HL-60細(xì)胞中FITC染色區(qū)域；C:A與B融合圖；D:K562細(xì)胞PI染色的胞核；E:K562細(xì)胞中FITC染色區(qū)域;F:D與E融合圖。圖5為PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖，其中，M：DNAmarker(DL2000)；1-2：HL-60組；3-4：K562組。圖6為患者和正常人中性粒細(xì)胞western的結(jié)果的分析圖。圖7為患者和正常人中性粒細(xì)胞共聚焦顯微鏡圖片熒光強(qiáng)度的結(jié)果的分析圖。具體實(shí)施方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(第三版，谷鴻喜等著，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社有限公司)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。下述各實(shí)施例中，涉及到的主要試劑為：HL-60、K562細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源庫；培養(yǎng)HL-60細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；培養(yǎng)K562細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；總RNA提取試劑盒、高保真TaqDNA多聚酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Invtrogen公司；所有引物均有上海生工生物工程有限公司合成；細(xì)胞漿核蛋白提取試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、核染料DAPI購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗人NE多抗，兔抗人RARα多抗購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司；兔抗人HistoneH3抗體購(gòu)自Bioworld公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)施例中，涉及一些常規(guī)的手段，具體如下：HL-60細(xì)胞用含20％優(yōu)質(zhì)胎牛血清的GIBCO-1640的培養(yǎng)基，于37℃，5％CO2，飽和濕度孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每1-2d換液傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。K562細(xì)胞用含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的HYCLONE-1640的培養(yǎng)基，于37℃，5％CO2，飽和濕度孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每1-2d換液傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。K562細(xì)胞的培養(yǎng)條件是：置于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的Hyclone-1640的培養(yǎng)基，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每1～2d換液傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)Ⅰ：western-blotting法驗(yàn)證HL-60細(xì)胞中NE酶分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞，RIPA裂解后提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法定量，分別取60μg蛋白，進(jìn)行SDS-PADE電泳，以半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉4h后，加入兔抗人NE多抗（5%脫脂奶粉1:500稀釋），4℃8h。洗膜：用TBST洗2次，每次10min，再用TBS洗10min.加入羊抗兔二抗（5%脫脂奶粉1：1000稀釋），37℃孵育1h，然后洗膜（步驟同上）。于暗室化學(xué)發(fā)光顯影成像。以β-actin作為對(duì)照。HL-60組在29kda附近出現(xiàn)了與NE蛋白分子量大小相近的特異性條帶，而K562組細(xì)胞在相同位置未出現(xiàn)條帶。說明HL-60組細(xì)胞含有NE酶，能發(fā)生融合蛋白被切割的情況。而K562細(xì)胞不含NE酶。以β-actin作為對(duì)照。見圖1。預(yù)實(shí)驗(yàn)Ⅱ：western-blotting法檢測(cè)HL-60中NLS-RARα蛋白分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，K562細(xì)胞，按說明書分別提取胞核蛋白，用BCA法定量，分別取100μg蛋白，進(jìn)行SDS-PADE電泳，以半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉4h后，加入兔抗人RARα多抗（5%脫脂奶粉1:500稀釋），4℃8h。洗膜：用TBST洗2次，每次10min，再用TBS洗10min.加入羊抗兔二抗（5%脫脂奶粉1：1000稀釋），37度孵育1h，然后洗膜（步驟同上），最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色和成像分析。以HistoneH3作為對(duì)照。HL-60組在蛋白分子量約69kda處出現(xiàn)了與NLS-RARα蛋白分子量大小相近的特異性條帶，而K562組細(xì)胞在相同位置未出現(xiàn)條帶。說明可以通過Westernblotting檢測(cè)HL-60細(xì)胞中NLS-RARα蛋白的表達(dá)情況。以HistoneH3作為對(duì)照，其蛋白分子量約20kda。見圖2。分別取病人（急性早幼粒細(xì)胞白血病患者）和正常人的中性粒細(xì)胞作為檢測(cè)標(biāo)本，參照預(yù)實(shí)驗(yàn)Ⅱ的方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目的條帶的灰度值進(jìn)行分析，具體結(jié)果詳見表1，所述表1的數(shù)據(jù)分析表詳見圖6。表1：western的結(jié)果平行實(shí)驗(yàn)：免疫熒光法檢測(cè)經(jīng)FITC-AnnexinV/DAPI雙染色的HL60細(xì)胞中NLS-RARα的表達(dá)及定位分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞，用PBS洗三次，各取15μl涂片；用4%的多聚甲醛固定20min后，PBS漂洗三次；再用0.1%triton透膜處理10min。10%山羊血清室溫封閉30min，加上兔抗人RARα抗體（封閉血清1:200），4℃過夜。PBS洗3次，加上FITC-AnnexinV標(biāo)記的熒光二抗（封閉血清1:200），37度孵育1h。PBS洗3次，加入核染色液DAPI5min，PBS漂洗3次，用70%甘油封固，熒光顯微鏡下觀察拍照。HL-60細(xì)胞中FITC染色區(qū)域與胞核PI染色幾乎重疊，說明NLS-RARα蛋白在HL-60中主要在胞核內(nèi)表達(dá)。K562細(xì)胞中FITC染色區(qū)域明顯大于胞核PI染色區(qū)域，且胞核區(qū)域染色較淺，說明野生型RARα蛋白在K562中主要在胞漿表達(dá)。見圖3。分別取病人（急性早幼粒細(xì)胞白血病患者）和正常人的中性粒細(xì)胞作為檢測(cè)標(biāo)本，參照上述平行方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)靶部位的灰度值進(jìn)行分析，具體結(jié)果詳見表2，所述表2的數(shù)據(jù)分析表詳見圖7。表2熒光顯微鏡結(jié)果表2中，目的指的是顯微鏡下的綠色熒光的量（包括胞漿和胞核），核指的是核區(qū)域的綠色熒光的量。采用spss17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)分析，t值為-15.880，病人組為0.8600±0.04084，正常人組為0.2933±0.04726，p<0.05，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明病人組蛋白表達(dá)與正常人相比主要在胞核。激光共聚焦檢測(cè)經(jīng)FITC-AnnexinV/DAPI雙染色的HL60細(xì)胞中NLS-RARα的表達(dá)及定位制作片子方法與免疫熒光相同，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)NLS-RARα蛋白在HL-60和K562細(xì)胞胞漿胞核的表達(dá)情況。以藍(lán)綠雙色熒光通道掃描觀察。藍(lán)光的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm,在600nm波長(zhǎng)以上觀察。綠光的激發(fā)波長(zhǎng)為543nm,在600nm波長(zhǎng)以上觀察。每張切片選取熒光表達(dá)最強(qiáng)的10個(gè)視野觀察并由計(jì)算機(jī)掃描軟件LASAFlite進(jìn)行掃描分析。HL-60細(xì)胞中FITC染色區(qū)域與胞核PI染色幾乎重疊，說明NLS-RARα蛋白在HL-60中主要在胞核內(nèi)表達(dá)。K562細(xì)胞中FITC染色區(qū)域明顯大于胞核PI染色區(qū)域，說明野生型RARα蛋白在K562中在胞漿胞核皆有表達(dá)。如圖4。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：PCR法驗(yàn)證HL-60中的PML-RARα融合基因Trizol法分別提取HL-60、K562細(xì)胞的總RNA，取2μl測(cè)濃度。分別取RNA各500ng逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別取1.5μlcDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR。前期實(shí)驗(yàn)參照胡秀秀等人“重組腺病毒Ad-NLS-RARα的構(gòu)建及其在K562細(xì)胞中的表達(dá)”。已知PML-RARα基因的CDS序列，設(shè)計(jì)引物如下，PML-RARα-F：5’-aggaggcagagagagtgaagg-3’，PML-RARα-R：5’-gtcctgacagacaaagcaagg-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物500bp。PCR反應(yīng)體系:25μl，含cDNA1.5μl，上下游引物各0.5μl，PremixTaq酶12.5ul，用滅菌水補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火56.5℃30s，延伸72℃2min5s，共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物各10μl經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳儀拍照觀察。HL-60組特異性條帶位于約500bp處，大小符合預(yù)期；而K562組在相同位置未出現(xiàn)條帶。說明HL-60細(xì)胞存在PML-RARα融合基因，而K562細(xì)胞不存在PML-RARα融合基因。見圖5。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。