一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及反相分離含雜質(zhì)氨基酸的方法，主要解決現(xiàn)有通過柱前衍生對(duì)十八種復(fù)合氨基酸進(jìn)行定量測(cè)定的方法存在成本高和對(duì)設(shè)備要求高的技術(shù)問題。本發(fā)明包括以下步驟：（1）配制分析所需的流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，流動(dòng)相A為三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為三氟乙酸乙腈溶液，超聲波混勻；（2）將配制好的流動(dòng)相接入色譜系統(tǒng)，檢查高效液相色譜的各個(gè)系統(tǒng)，確保儀器正常，設(shè)置色譜條件，然后按照梯度的起始濃度平衡色譜柱；（3）將N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸以及這2物質(zhì)的混合物用乙腈溶解，過濾后獲得單個(gè)樣品液和混合液待用；（4）色譜系統(tǒng)平衡好后，分別吸取混合溶液和2個(gè)樣品液進(jìn)入色譜系統(tǒng)，采集色譜數(shù)據(jù)并對(duì)色譜圖進(jìn)行面積歸一法積分。
【專利說明】一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及反相分離含雜質(zhì)氨基酸的方法，特別涉及一種利用C18固定相來分離主鏈氨基帶9-荷甲氧羰基保護(hù)的L-亮氨酸(Fmoc-L-Leu-ΟΗ)和9-荷甲氧羰基保護(hù)的L-異亮氨酸(Fmoc-L-1le-OH)，利用高效液相色譜儀和反相色譜條件，以水/三氟乙酸和乙腈/三氟乙酸為流動(dòng)相，采用梯度洗脫的方式分離上述2種保護(hù)氨基酸，并能準(zhǔn)確給出結(jié)果。

【背景技術(shù)】
[0002]由于多肽藥物的諸多優(yōu)點(diǎn)，越來越多的制藥企業(yè)投入人力和財(cái)力到多肽藥物的研發(fā)中去，國內(nèi)的相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展也很迅速，目前國內(nèi)已有多種上市的多肽藥物或者即將上市的多肽藥物，這些包括亮丙瑞林，胸腺α 1，曲普瑞林，艾塞那肽等等，這些具體治療效果的多肽幾乎都是使用固相合成法來合成的，而固相合成法中使用最多的氨基酸原料是氨基端用9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸。目前上市的大部分藥物多肽序列中都會(huì)使用到N- (9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸或N- (9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸這2種保護(hù)氨基酸，如果N- (9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸含有Ν-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸雜質(zhì)或者N-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸含有N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸雜質(zhì)都會(huì)影響到多肽的使用效果，因此需要一種快速，簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)的測(cè)試方法。
[0003]目前報(bào)道的文獻(xiàn)或者專利主要涉及基礎(chǔ)氨基酸的分離，主要采用氨基酸經(jīng)2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生,然后使用醋酸鈉為水相，甲醇為有機(jī)相，相應(yīng)的文獻(xiàn)為分析生物化學(xué)[Morton R.C.; Gerber G.Ε.，Anal.B1chem., 170(1988) 220.]，還有一篇文獻(xiàn)是中國化學(xué)學(xué)報(bào)[Shang, Zhen-Hua;Guo, Wei ; Jiang, Hui ; Zhou, Ling-Mo, ChineseJournal of Chemistry, 13(1995) 163]。這是一篇關(guān)于亮氨酸和異亮氨酸通過2,4-二硝基氟苯柱前衍生后使用醋酸緩沖鹽-乙腈體系為流動(dòng)相分離的文獻(xiàn)。還有一篇中國專利CN1053128A公開了十八種復(fù)合氨基酸注射液的高效液相色譜分析方法，也是通過柱前衍生對(duì)十八種復(fù)合氨基酸進(jìn)行定量測(cè)定的，在氨基端用9-芴甲氧羰基衍生的亮氨酸和異亮氨酸的分離方面沒有相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法，主要解決現(xiàn)有通過柱前衍生對(duì)十八種復(fù)合氨基酸進(jìn)行定量測(cè)定的方法存在成本高和對(duì)設(shè)備要求高的技術(shù)問題。本發(fā)明的思路是通過反相高效液相色譜法來分離N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸，采用水/三氟乙酸和乙腈/三氟乙酸為流動(dòng)相，使用普通的C18反相柱，再結(jié)合適當(dāng)?shù)奶荻龋鉀Q了 2種衍生化氨基酸難分離的問題，使用該分析方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，而且不需要添加額外的設(shè)備，流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單，適合一般HPLC實(shí)驗(yàn)室使用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法，包括以下步驟: (O配制分析所需的流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，流動(dòng)相A為三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為三氟乙酸乙腈溶液，超聲波混勻；
(2)將配制好的流動(dòng)相接入色譜系統(tǒng)，檢查高效液相色譜的各個(gè)系統(tǒng)，確保儀器正常，設(shè)置色譜條件，然后按照梯度的起始濃度平衡色譜柱；
(3)將N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N- (9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸以及這2物質(zhì)的混合物用乙腈溶解，過濾后獲得單個(gè)樣品液和混合液待用；
(4)色譜系統(tǒng)平衡好后，分別吸取混合溶液和N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸樣品液進(jìn)入色譜系統(tǒng)，采集色譜數(shù)據(jù)并對(duì)色譜圖進(jìn)行面積歸一法積分。
[0006]流動(dòng)相A:含體積百分含量0.08%?0.1%三氟乙酸的水溶液，流動(dòng)相B:含體積百分含量0.08%?0.1%三氟乙酸乙腈溶液。優(yōu)選流動(dòng)相A:含體積百分含量0.1%三氟乙酸(后面的0.1%三氟乙酸均指三氟乙酸和溶劑的體積比)的水溶液，流動(dòng)相B:含體積百分含量0.1%三氟乙酸乙腈溶液。
[0007]色譜條件如下:
色譜柱:C18 色譜柱，5 μ m，4.6 X 150mm (1.D)
流動(dòng)相 A:水/0.08?0.1%三氟乙酸；B:乙腈/0.08?0.1%三氟乙酸時(shí)間(min)AB
0.0164%36%
35.058%42%
45.05%95%
45.564%36%
50.064%36%
流速:1.0ml/min ;波長(zhǎng):220nm ?280nm,優(yōu)選 265nm ；
進(jìn)樣量:10μ1。
[0008]按照本發(fā)明，所述的反相分離N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸使用的色譜柱是以硅膠為基質(zhì)的，在硅膠基質(zhì)上化學(xué)鍵合C18烷鏈的色譜柱。步驟3所述乙腈為100%色譜級(jí)乙腈。
[0009]本發(fā)明所述的樣品在4.6mm內(nèi)徑的分析柱上的樣品濃度分別為:
9-荷甲氧羰基-L-異亮氨酸0.5mg/ml ；
9-荷甲氧羰基-L-亮氨酸 0.5mg/ml。
[0010]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所述的分離方法，使用的流動(dòng)相比較常見，配制簡(jiǎn)單，而且分離對(duì)于溫度也沒有特殊要求，分離過程中不需要柱溫箱，不增加儀器成本，同時(shí)具體良好的重現(xiàn)性，N- (9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N- (9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸的分離問題解決后，能很好的控制固相多肽合成中的原料質(zhì)量，有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為普通線性梯度分離N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸混合物的色譜圖。
[0012]圖2為調(diào)整后的梯度分離N-(9_芴甲氧羰基)-L_亮氨酸和N-(9_芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸混合物的色譜圖。
[0013]圖3為調(diào)整后的梯度分離N-(9_芴甲氧羰基)-L_亮氨酸的色譜圖。
[0014]圖4為調(diào)整后的梯度分離N-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸的色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0016]1.流動(dòng)相配制:0.1%三氟乙酸水溶液
量筒量取400暈升的去尚子水到溶劑瓶中，然后用移液管精密量取0.4暈升的分析純?nèi)宜岬?00毫升去離子水中，溶劑瓶放入超聲波震蕩以備后用。
[0017]0.1%三氟乙酸乙腈溶液:
量筒量取400毫升的色譜級(jí)乙腈到溶劑瓶中，然后用移液管精密量取0.4毫升的分析純?nèi)宜岬?00毫升乙腈中，溶劑瓶放入超聲波震蕩以備后用。
[0018]2.樣品溶液的配制單個(gè)試樣的配制:
稱取5mg的N- (9-荷甲氧羰基)-L-亮氨酸和5mg的N- (9-荷甲氧羰基)-L-異亮氨酸，分別置于1ml的容量瓶中(即配制0.5mg/ml的濃度)，然后用色譜純乙腈溶解，超聲震蕩，待樣品完全澄清，加乙腈至刻度線，最后用0.45 μ m有機(jī)相濾頭過濾，取濾液待用。
[0019]混合試樣的配制:
稱取5mg的N- (9-荷甲氧羰基)-L-亮氨酸和5mg的N- (9-荷甲氧羰基)-L-異亮氨酸置于1ml的容量瓶中，然后用色譜純乙腈溶解，超聲震蕩，待樣品完全澄清，加乙腈至刻度線，最后用0.45 μ m有機(jī)相濾頭過濾，取濾液待用。
[0020]3.色譜條件
安捷倫1200四元梯度泵，Chemstat1n色譜工作站，紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，手動(dòng)進(jìn)樣器，安捷倫脫氣機(jī)，C18反相柱。
[0021 ] 3.1普通線性梯度分離N- (9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸和N- (9_芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸的混合試樣，2個(gè)樣品沒有分離的痕跡，色譜峰完全重疊在一起，不適合分離。
[0022]色譜柱:安捷倫C18，5 μ m，4.6 X 150mm (1.D)
流動(dòng)相 A:水/0.1%三氟乙酸；B:乙腈/0.1%三氟乙酸
時(shí)間(min)AB
0.0150%50%
20.00%100%
25.00%100%
流速:1.0ml/min ;波長(zhǎng):265nm ；
進(jìn)樣量:10 μ I 分離圖見圖1。
[0023]3.2調(diào)整后的梯度分離Ν-(9_芴甲氧羰基)-L_亮氨酸和Ν-(9_芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸的混合試樣，2個(gè)樣品能分離。
[0024]色譜柱:安捷倫C18, 5 μ m，4.6 X 150mm (1.D)
流動(dòng)相 A:水/0.1%三氟乙酸；B:乙腈/0.1%三氟乙酸時(shí)間(min)AB
0.0l64%36%
35.058%42%
45.05%95%
45.564%36%
50.064%36%
流速:1.0ml/min ;波長(zhǎng):265nm ；
進(jìn)樣量:10 μ I 分離圖見圖2。
[0025]3.3調(diào)整后的梯度分析N- (9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸溶液，在N- (9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸主峰前明顯有一個(gè)N-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸的峰。
[0026]色譜柱:安捷倫C18, 5 μ m，4.6 X 150mm (1.D)
流動(dòng)相 A:水/0.1%三氟乙酸；B:乙腈/0.1%三氟乙酸
時(shí)間(min)AB
0.0164%36%
35.058%42%
45.05%95%
45.564%36%
50.064%36%
流速:1.0ml/min ;波長(zhǎng):265nm ；
進(jìn)樣量:10 μ I 分離圖見圖3。
[0027]3.4調(diào)整后的梯度分析N- (9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸溶液，在N- (9_芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸主峰后明顯有一個(gè)N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸的峰。
[0028]色譜柱:安捷倫C18, 5 μ m，4.6 X 150mm (1.D)
流動(dòng)相 A:水/0.1%三氟乙酸；B:乙腈/0.1%三氟乙酸
時(shí)間(min)AB
0.0164%36%
35.058%42%
45.05%95%
45.564%36%
50.064%36%
流速:1.0ml/min ;波長(zhǎng):265nm ；
進(jìn)樣量:10 μ I 分離圖見圖4。
【權(quán)利要求】
1.一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法，包括以下步驟: (O配制分析所需的流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，流動(dòng)相A為三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為三氟乙酸乙腈溶液，超聲波混勻； (2)將配制好的流動(dòng)相接入色譜系統(tǒng)，檢查高效液相色譜的各個(gè)系統(tǒng)，確保儀器正常，設(shè)置色譜條件，然后按照梯度的起始濃度平衡色譜柱； (3)將N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N- (9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸以及這2物質(zhì)的混合物用乙腈溶解，過濾后獲得單個(gè)樣品液和混合液待用； (4)色譜系統(tǒng)平衡好后，分別吸取混合溶液和N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮氨酸、N-(9-芴甲氧羰基)-L-異亮氨酸樣品液進(jìn)入色譜系統(tǒng)，采集色譜數(shù)據(jù)并對(duì)色譜圖進(jìn)行面積歸一法積分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法，其特征是:流動(dòng)相A:含體積百分含量0.08%?0.1%三氟乙酸的水溶液，流動(dòng)相B:含體積百分含量0.08%?0.1%三氟乙酸乙腈溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法，其特征是:流動(dòng)相A:含體積百分含量0.1%三氟乙酸的水溶液，流動(dòng)相B:含體積百分含量0.1%三氟乙酸乙腈溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法，其特征是:所述的色譜條件為: 色譜柱:C18 色譜柱，5 μ m，4.6 X 150mm (1.D) 流動(dòng)相 A:水/0.08?0.1%三氟乙酸；B:乙腈/0.08?0.1%三氟乙酸
時(shí)間(min)AB
0.0164%36%
35.058%42%
45.05%95%
45.564%36%
50.064%36% 流速:1.0ml/min ;波長(zhǎng):220nm ?280nm, 進(jìn)樣量:10μ1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法，其特征是:所述的流動(dòng)相:Α:水/0.1%三氟乙酸；B:乙腈/0.1%三氟乙酸，所述的波長(zhǎng)為265nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種反相分離衍生化亮氨酸和異亮氨酸的方法，其特征是:所述色譜柱是以硅膠為基質(zhì)的通過化學(xué)鍵合直鏈C18烷基的色譜柱。
【文檔編號(hào)】G01N30/89GK104345114SQ201310325212
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】巢慶, 喬立超, 張倩, 楊培, 張恒維, 朱國基 申請(qǐng)人:希施生物科技（上海）有限公司