含血液成分的試樣的處理方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抑制對血液中存在的血細胞以外的細胞的損壞、并對紅細胞和白細胞產(chǎn)生損壞的簡便的處理方法。在一種實施方式中，涉及一種含有血液成分的試樣的處理方法，包括混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A的液體，所述表面活性劑A為通式R1-O-（EO）n-R2（I）所表示的非離子性表面活性劑。在其他的方式中，涉及一種含血液成分的試樣的處理方法，包括混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A和表面活性劑B的液體、或者含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體，所述表面活性劑A為通式R1-O-（EO）n-R2（I）表示的非離子性表面活性劑，所述表面活性劑B對紅細胞的溶解性高于所述表面活性劑A對紅細胞的溶解性。
【專利說明】含血液成分的試樣的處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本公開涉及含血液的試樣的處理方法、分離含血液的試樣中的稀少細胞以及核酸的方法、CTC數(shù)測定方法、以及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]血液的細胞成分為紅細胞、白細胞、血小板，但是血液中也稀少地存在除此以外的細胞。作為其中一個例子，可以舉出血中循環(huán)腫瘤細胞/CTC (Circulating Tumor Cell)。認為癌的轉(zhuǎn)移是由于癌細胞通過血管、淋巴管運送到體內(nèi)的其他部位并增殖而引起的。并且，報告了血液中的CTC數(shù)與癌的轉(zhuǎn)移的可能性以及預(yù)后是相關(guān)的，并且已知為了作為癌(尤其是乳癌等轉(zhuǎn)移性癌)的診斷、預(yù)后診斷、以及治療效果的預(yù)測或判定的指標，而測定血液中的 CTC 數(shù)的計數(shù)、CTC 的核酸(Circulating Tumor cell ；Evolving Evidence andFuture Challenges.The oncologist2009 ;14 ;1070_1082)。
[0003]作為血液中的CTC的分離、檢測技術(shù)，有如下方法:通過針對CTC特異性表面抗原的抗體來捕捉分離血液中的CTC的方法(特許3834326號、特開2007-178193)、利用了粘附的分離方法(W02005/043121、W02006/078994 )、利用密度梯度的分離方法(特開2010 — 075073、W095/20429)、利用過濾器的分離方法(W02006/116327、W02008/155398)、測定CTC的端粒酶活性的方法(W02010/071114)、通過使用了低滲溶液的溶血的分離方法(W02004/056978)、利用了流式細胞儀的方法(W02008/057437)等。為了檢測、定量、計數(shù)用上述分離的物質(zhì)，進行PCR、利用了有親和性的物質(zhì)的核酸的測定，另外，進行組合了抗體、熒光染料的光學(xué)CTC的測定是一般的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明要解決的問題
[0005]為了在含血液成分的試樣中的稀少細胞活著的情況下分析，或者分離并培養(yǎng)，需要在不對所述稀少細胞產(chǎn)生大的損壞的情況下，高效地去除血液中的細胞成分(尤其是紅細胞及白細胞)。
[0006]因此，本公開提供一種抑制對含血液成分的試樣中的血細胞以外的細胞的損壞、并可迅速排除血細胞的簡便的處理方法。另外，提供一種通過去除血細胞等來提高CTC的純度從而可抑制CTC的計數(shù)、核酸測定時的噪聲、并可進行CTC的檢測的簡便的處理方法、或者分離或檢測方法。
[0007]用于解決問題的手段
[0008]本公開在一個方式中，涉及一種含血液成分的試樣的處理方法，包括混合含血液成分的試樣與含有表面活性劑A的液體，不使用固定劑，所述表面活性劑A為下述通式(I)表示的非離子性表面活性劑。
[0009]R1-O- (EO) n-R2 (I)
[0010][所述式(I)中，R1為具有分支鏈的碳數(shù)為12?40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù),為23?50, R2為氫原子或碳數(shù)為I?3的烴基。]
[0011]本公開在又一方式中，涉及一種含血液成分的試樣的處理方法，包括:混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A及表面活性劑B的液體、或含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體，所述表面活性劑A為下述通式(I)表示的非離子性表面活性劑，所述表面活性劑B對紅細胞的溶解性高于所述表面活性劑A對紅細胞的溶解性。
[0012]R1-O- (EO) n-R2 (I)
[0013][所述式(I)中，R1為具有分支鏈的碳數(shù)為12?40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù),為23?50, R2為氫原子或碳數(shù)為I?3的烴基。]
[0014]本公開在又一方式中，涉及一種含血液成分的試樣的處理方法，包括:混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A及表面活性劑B的液體、或含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體，所述表面活性劑A為聚氧乙烯辛基十二烷基醚(Ε0=23?50)，所述表面活性劑B為對紅細胞的溶解性高于所述表面活性劑A對紅細胞的溶解性的非離子性表面活性劑，并且為從聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚(Ε0=8?22)、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它們的組合所組成的組中選擇的非離子性表面活性劑。
[0015]本公開在又一方式中，涉及一種分離或檢測含血液成分的試樣中的稀少細胞或核酸的方法，包括:通過本公開涉及的處理方法處理含有血液成分的試樣；以及從處理后的試樣中分離或檢測稀少細胞或核酸。
[0016]本公開在又一方式中，涉及一種測定含血液成分的試樣中的CTC (循環(huán)腫瘤細胞)數(shù)或CTC的核酸的方法，包括:通過本公開涉及的處理方法來處理含有血液成分的試樣；或者通過本公開涉及的分離或檢測方法分離或檢測血液成分中的稀少細胞或核酸。
[0017]本公開在又一方式中，涉及一種含血液成分的試樣中的稀少細胞的分析方法，包括:在通過本公開涉及的處理方法處理含有血液成分的試樣之后，通過包括細胞的動態(tài)觀察或活性測定的方法進行分析。
[0018]本公開在又一方式中，涉及一種試劑盒，用于本公開涉及的處理方法、本公開涉及的分離或檢測方法、本公開涉及的CTC數(shù)或CTC的核酸的測定方法、和/或本公開涉及的分析方法，所述試劑盒包含所述表面活性劑A和/或所述表面活性劑B。
[0019]發(fā)明效果
[0020]根據(jù)本公開，能夠抑制對含有血液的試樣中存在的血細胞以外的細胞的損壞，并溶解紅細胞、對白細胞產(chǎn)生損壞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是示出表面活性劑N0.2和表面活性劑N0.1的混合物的混合比與癌細胞的生存率之間的關(guān)系的曲線圖的一個例子；
[0022]圖2是示出表面活性劑N0.3和表面活性劑N0.1的混合物的混合比與癌細胞的生存率之間的關(guān)系的曲線圖的一個例子；
[0023]圖3是對表面活性劑混合物的處理之后用離心分離回收的癌細胞進行培養(yǎng)的結(jié)果的顯微鏡觀察照片的一個例子；
[0024]圖4是顯微鏡觀察對沒有進行表面活性劑混合物的處理的(A)試樣以及進行了表面活性劑混合物的處理的(B)試樣進行過濾處理之后的試樣的照片的一個例子；
[0025]圖5是對含有經(jīng)綠色熒光染色的癌細胞(SNU-1)和經(jīng)藍色熒光染色的白細胞的含癌細胞的血液試樣進行了表面活性劑混合物的處理之后的熒光顯微鏡觀察的結(jié)果的一個例子；
[0026]圖6是對含有癌細胞(SNU-1)懸浮液或白細胞的含血液成分的試樣進行了表面活性劑混合物的處理之后(A)的試樣以及未進行表面活性劑混合物的處理(B)的試樣進行庫爾特式的流式細胞儀分析的結(jié)果的一個例子；
[0027]圖7是對含有癌細胞(SNU-1)和白細胞的含有血液成分的試樣進行了表面活性劑混合物的處理之后(A)的試樣以及未進行表面活性劑混合物的處理(B)的試樣用庫爾特式的流式細胞儀分析后的結(jié)果的一個例子；
[0028]圖8是示出對懸浮在生理鹽水中的含癌細胞(SNU-1)或含有白細胞的含血液成分的試樣用各種PH的表面活性劑混合物進行處理之后的生存率的曲線圖的一個例子。
【具體實施方式】
[0029]預(yù)計今后循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell:CTC)等血液中的稀少細胞的分析會更加盛行，并需求更簡便、損耗少的方法。IOml的血液中通常含有數(shù)百億個紅細胞、數(shù)千萬個白細胞，CTC為O?數(shù)千個左右。因此，直接分析CTC時的技術(shù)問題很多，例如需要分離、濃縮等處理。因此，期待開發(fā)從血液中更高效和/或簡便地濃縮分離CTC的技術(shù)。
[0030]利用了抗原抗體反應(yīng)的分離方法中，存在使用附加了抗體的磁性顆粒和磁場來從血液中濃縮細胞的方法(特許3834326號、特開2007-178193)。但是，血液中密集存在阻礙抗體與目標細胞接觸的血細胞，需要反應(yīng)時間、細胞的回收時間。而且在血細胞的存在下，反應(yīng)體積變大，每體積的試劑量也增加，因此花費成本。另外，在使用顆粒濃縮時，由于大量裹入血細胞因此純度變低導(dǎo)致假陽性。并且在反復(fù)進行去除血細胞的洗浄時，有可能損失目標細胞。
[0031 ] 利用粘附的分離方法(W02005/043121、W02006/078994 )在血液存在下，血細胞、血
小板堆積在一般的細胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿或載體的底面上，因此，癌細胞不能與培養(yǎng)皿粘附不能分離癌細胞。因此，有將抗體等親和性高的物質(zhì)固定在培養(yǎng)皿或載體上來使細胞粘附的方法，但是這也同樣需要細胞和具有親和性的物質(zhì)在底面接觸，血細胞成了阻礙。因此，為了增加接觸次數(shù)需要在載體側(cè)的結(jié)構(gòu)上下工夫并需要攪拌，結(jié)構(gòu)上下的工夫、攪拌方法等增加了復(fù)雜性。
[0032]離心分離法中，血液中離心后從下面開始按紅細胞層、白細胞層的順序形成細胞層。很多癌細胞由于具有與白細胞密度和尺寸近似的密度和尺寸，因此多數(shù)白細胞混入癌細胞中，離心分離的純度受到影響，導(dǎo)致假陽性。另外，由于各層非常接近，因此混入大量紅細胞得不到高回收率和純度。
[0033]通過密度梯度離心法進行的分離(特開2010-075073、W095/20429)作為從血液中回收細胞的方法被通用。但是，利用了細胞密度的分離中，由于癌細胞和白細胞的單核細胞的大小和密度接近，因此單核細胞大量混入，導(dǎo)致假陽性。密度分離離心法過程繁雜，例如分離后必須在不擾亂液面的情況下回收細胞的層，以使分離后各層不混亂。
[0034]使用了過濾器的分離(W02006/116327、W02008/155398)是使用了稀少細胞的大小之差和血細胞的變形能力的分離，用于分離血細胞和癌細胞。大多數(shù)紅細胞、白細胞通過過濾器，但是部分紅細胞、白細胞殘留在膜片上。另外，如果使用孔大小小于8 μ m的膜片的孔，則容易產(chǎn)生堵塞，相反為了提高血細胞通過過濾器的效率而增加濾過時的壓力時，流速變大稀少細胞受到損壞，或者稀少細胞通過孔，從而回收率也下降。
[0035]血液I μ L中存在數(shù)百萬個紅細胞、數(shù)千?I萬個左右的白細胞，因此流式細胞儀一般不能直接計數(shù)。因此，需要添加去除紅細胞的溶血劑，并且測定時為了檢測各細胞而需要稀釋。稀釋IOmL的血液，從數(shù)百億個紅細胞、數(shù)億?數(shù)千個白細胞中對各細胞進行計數(shù)，分離癌細胞并對其進行計數(shù)是非常難的。至于電阻式，由于存在與癌細胞同等程度大小的白細胞，因此分離后混入大量白細胞，導(dǎo)致假陽性。
[0036]如此，對于檢測、分離稀少細胞來說，現(xiàn)有的分離濃縮技術(shù)可以說由于血細胞的殘留，在必要的靈敏度、效率和特異性方面不足。如果能進行試樣中的血細胞的處理(分離、去除、排除等)，則在使用了抗原抗體反應(yīng)的分離中，能夠在溶解后離心，在重新懸濁的少量體積的溶液中反應(yīng)，由此縮短試劑成本和反應(yīng)時間。另外，在利用了粘附的分離中，也能夠使用培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿，進行培養(yǎng)和粘附分離。另外，在使用了離心分離、密度梯度離心法的分離中，稀少細胞的回收變得容易。另外，在使用了過濾器的情況下，能夠使分析容易。即，通過處理含有血液的試樣中的血細胞，能夠減少稀少細胞的計數(shù)和定量中的誤差因素(假陽性)，迅速進行測定。
[0037]另外，如果能夠在含有血液的試樣中的稀少細胞存活的情況下進行分析，或者分離培養(yǎng)，則能夠更詳細地分析、解析稀少細胞。另外，一般，在血細胞去除中用作溶血試劑的非離子表面活性劑的皂苷或Triton會破壞細胞，也會對癌細胞等稀少細胞產(chǎn)生損壞甚至致死，并且細胞被破壞。因此，一般在使用表面活性劑解析目標細胞的情況下，如W02010/071114中所述，預(yù)先用甲醛、多聚甲醛之類的交聯(lián)試劑(固定試劑)固定含有血液的試樣中的稀少細胞之后再與溶血試劑反應(yīng)。前述那樣的甲醛、多聚甲醛之類的交聯(lián)試劑通常經(jīng)由游離的氨基形成分子間交聯(lián)，由此來維持細胞膜、細胞結(jié)構(gòu)。但是，雖然能夠期待維持細胞的結(jié)構(gòu)，但是通過該固定化操作而產(chǎn)生的稀少細胞的分離培養(yǎng)、觀察、活性測定、藥效評價等進一步的解析是困難的。
[0038]另外，W02010/071114中記載的表面活性劑的濃度下不能直接溶解血液，會對癌細胞產(chǎn)生損壞。另外，很多白細胞也生存著。
[0039]在使用溶血試劑的情況下一般同時使用的固定劑即甲醛、多聚甲醛是劇毒物，因此有可能會對使用者的健康產(chǎn)生影響。雖存在W02010/071114、W02004/056978中記載的那樣的通過氯化銨鹽或低滲溶液去除血細胞的方法，但是這些方法由于反應(yīng)條件中需要較大的稀釋倍率，因此存在反應(yīng)槽變大的問題。另外，由于沒有表面活性劑等那樣的溶解力，因此容易得到細胞片等凝集物。
[0040]本公開基于以下知識:在一個或多個實施方式中，通過使用對紅細胞的溶解性和對細胞的損壞低的表面活性劑A，溶解紅細胞并且能夠抑制對血液中存在的稀少細胞的損壞。另外，本公開基于以下知識:在一個或多個實施方式中，當組合對紅細胞的溶解性和對細胞的損壞高的表面活性劑B、以及對紅細胞的溶解性和對細胞的損壞低的表面活性劑A來處理血液試樣時，能夠溶解紅細胞并對白細胞產(chǎn)生損壞并且能夠抑制對血液中存在的稀少細胞的損壞。另外，這些處理具有能夠低成本進行的優(yōu)點。[0041]通過表面活性劑A抑制對血液中的稀少細胞的損壞并能夠排除血細胞的詳細機理并不清楚，但是可以如下考慮。從細胞的觀點來看，細胞的骨格、膜的差異是重要因素。在體內(nèi)循環(huán)的血細胞由于通過毛細血管等細胞的骨格容易變形，另外，細胞膜的磷脂雙層的流動性大，磷脂的各疏水部之間的相互作用弱。因此當受到表面活性劑的作用時容易破壞。另一方面考慮稀少細胞與細胞角蛋白等特征性細絲狀結(jié)構(gòu)遍布細胞內(nèi)并結(jié)合在細胞膜等上，另外，與血細胞相比脂質(zhì)雙層的流動性也小并且難以被破壞。另外，考慮從表面活性劑的觀點看，表面活性劑與細胞膜上的蛋白質(zhì)、膽固醇、磷脂相互作用，溶解細胞。表面活性劑A優(yōu)選與磷脂的疏水基的結(jié)構(gòu)接近，帶有分支鏈的分子結(jié)構(gòu)，另外，以疏水基和親水基、例如烷基和環(huán)氧乙烷的附加數(shù)的平衡，來控制由于溶解力和親水基對立體抑制的影響，由此在不破壞稀少細胞的情況下溶解血細胞。但是，本公開也可以不限定于這些機理地進行解釋。
[0042]通過表面活性劑A和B的組合來抑制對血液中的稀少細胞的損壞并能夠排除血細胞的詳細機理并不清楚，但是可以如下考慮。通過在表面活性劑A中組合對血細胞溶解性高的表面活性劑B，表面活性劑A和B形成混合膠束，該混合膠束以一定比例在不干擾表面活性劑A對血細胞的選擇性的情況下與血細胞選擇性作用，通過表面活性劑B高的溶解性來迅速溶解接觸的血細胞。即，考慮能夠快速排除血細胞，由此進一步抑制對癌細胞的損壞。但是，本公開也可以不限定于這些機理地進行解釋。
[0043]根據(jù)本公開的處理方法，能夠抑制對含有血液的試樣中的血細胞以外的細胞的損壞并簡便地排除血細胞。因此，在一個或多個實施方式中，通過進行本公開的處理方法，例如，能夠簡便地進行血液中的稀少細胞、特別是CTC (循環(huán)腫瘤細胞)的分離、濃縮、測定、和/或培養(yǎng)、分析。另外，例如即使在進行CTC的染色、標記的情況下白細胞被染色，通過本公開的處理方法進行處理之后，白細胞也成了死細胞，或者由于受到損壞染色物等漏出到外面，降低了來自白細胞的信號(噪聲)。因此，即使是使用了蓄積在細胞內(nèi)的熒光物質(zhì)、或利用代謝轉(zhuǎn)變成突光物質(zhì)的物質(zhì)、例如使用CellTracker (Green CMFDA/C7025invitrogen)的非特異性的染色方法，在一個或多個實施方式中，通過進行本公開的處理方法，也能夠抑制CTC的檢測、測定、觀察等的假陽性。
[0044][含血液成分的試樣]
[0045]在本說明書中，“含有血液成分的試樣”也可稱為“含血液成分的試樣”，是可應(yīng)用本公開的處理方法的試樣,可以舉出血液、含有紅細胞成分的血液來源物、血液或血液來源物混合存在的體液、以及由它們制備的試樣等。“體液”在一個或多個實施方式中，可包括血液、淋巴液、腹水、胸膜液、髄液、唾液、尿、以及母乳。作為血液，可以舉出從生物體采集的血液，作為所述生物體，可舉出人或人以外的動物(例如，哺乳類)。作為含有紅細胞成分的血液來源物，可以舉出從血液分離或制備并含有紅細胞成分的物質(zhì)或者它們的稀釋/濃縮物，例如含有去除了血漿的血細胞組分、血細胞濃縮物、血液或血細胞的凍干物、對全血進行了溶血處理的溶血試樣、離心分離血液、自然沉降血液、洗浄血細胞、特定的組分等。它們當中，在不限定的一個或多個實施方式中，從簡便且迅速的處理的觀點以及抑制對血液中的稀少細胞的損壞的觀點來說，優(yōu)選血液或含有血細胞成分的源自血液的血細胞作為含有所述血液的試樣。
[0046]在本說明書中，“血液中的稀少細胞”或“含有血液成分的試樣中的稀少細胞”是指人或人以外的動物的血液中可含有的細胞成分(紅細胞、白細胞、以及血小板)以外的細胞，包括腫瘤細胞和/或癌細胞。一般將血液中循環(huán)的腫瘤細胞或癌細胞稱為CTC。作為血液中的稀少細胞數(shù)，一般在血液IOml中含有O?數(shù)千個?！把褐械南∩偌毎被颉昂醒撼煞值脑嚇又械南∩偌毎痹谝粋€或多個實施方式中，是指選自癌細胞、循環(huán)腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮祖細胞、癌干細胞、上皮細胞、造血干細胞、間葉干細胞、胎兒細胞、以及它們的組合所組成的組的細胞。另外，在本說明書中，作為分離或檢測對象的“核酸”在一個或多個實施方式中，是選自血液成分中的RNA和DNA、癌細胞、循環(huán)腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮前驅(qū)細胞、癌干細胞、上皮細胞、造血干細胞、葉間干細胞、胎兒細胞的RNA和DNA、以及它們的組合所組成的組的核酸。
[0047]在本說明書中，“血細胞的排除”是指紅細胞的溶血、和/或、白細胞的生長抑制。紅細胞的溶解和白細胞的生長抑制例如能夠用實施例的方法來確認。此外，在本說明書中，“白細胞的生長抑制”可包括白細胞的消滅(降低生存率)、溶解、和/或白細胞的增殖抑制。在一個或多個實施方式中，在含有血液的試樣中，紅細胞的溶血能夠通過測定濁度的變化來觀察。在一個或多個實施方式中，值會根據(jù)測定池的大小或多或少發(fā)生變化，但是也可以將值從初始濁度起達到1/2以下作為溶血的基準。具體地，將含有血液的試樣30 μ I與試劑30 μ I混合，能夠使用微孔板檢測儀通過測定確認。例如，對于在所述條件下混合了血液和PBS或蒸餾水的溶液而言，以波長650nm的吸光度值計，初始濁度為2?1.5，溶血發(fā)生包括0.8以下、0.6以下或0.5以下。另外，在一個或多個實施方式中，在含有血液的試樣中，白細胞的生長抑制包括將白細胞的生存率設(shè)定為50%以下、不足50%、40%以下、不足40%、或30%以下。
[0048]含有所述表面活性劑A的液體優(yōu)選具有下述(I)的血細胞去除效果。
[0049](I)用蒸餾水稀釋規(guī)定量的血液，以使用微孔板檢測儀和600nm以上的波長的光用吸光光度法測定的吸光度值為I以上且小于2，由此制備基準樣品，
[0050]替代所述基準樣品中的蒸餾水，使用含有2.5?5w/v%的所述表面活性劑A的液體來制備被檢樣品，
[0051]使用600nm以上的波長的光通過吸光光度法測定的所述被檢樣品的吸光度值達到所述基準樣品的吸光度值的二分之一的時間為I小時以內(nèi)。
[0052]此外，對于含有所述表面活性劑A的液體而言，關(guān)于上述(I)的血細胞去除效果，使用600nm以上的波長的光通過吸光光度法測定的所述被檢樣品的吸光度值達到所述基準樣品的吸光度值的二分之一的時間優(yōu)選為60分鐘以內(nèi)，更優(yōu)選40分鐘以內(nèi)，進一步優(yōu)選30分鐘以內(nèi)。
[0053]含有所述表面活性劑A和表面活性劑B的液體、或者、含有表面活性劑A的液體和表面活性劑B的液體或者這兩種液體的混合物優(yōu)選具有下述(2)的血細胞去除效果。
[0054](2)用蒸餾水稀釋規(guī)定量的血液，以使用微孔板檢測儀和600nm以上的波長的光用吸光光度法測定的吸光度值為I以上且小于2，由此制備基準樣品，
[0055]替代所述基準樣品中的蒸餾水，使用含有2.5?5w/v%的所述表面活性劑A和表面活性劑B的液體來制備被檢樣品，
[0056]使用600nm以上的波長的光通過吸光光度法測定了的所述被檢樣品的吸光度值為所述基準樣品的吸光度值的二分之一的時間為0.5小時以內(nèi)。
[0057]此外,對于含有所述表面活性劑A和表面活性劑B的液、含有表面活性劑A的液體和含有表面活性劑B的液體或者這兩種液體的混合物而言，關(guān)于上述(2)的血細胞去除效果，使用600nm以上的波長的光通過吸光光度法測定了的所述被檢樣品的吸光度值變?yōu)樗龌鶞蕵悠返奈舛戎档亩种坏臅r間優(yōu)選在30分鐘以內(nèi)，更優(yōu)選在20分鐘以內(nèi)，進一步優(yōu)選為15分鐘以內(nèi)。
[0058]此外，關(guān)于用于評價所述血細胞去除效果的所述被檢樣品，含有所述表面活性劑A的液體中的所述表面活性劑A的濃度例如為0.001w/v%~10w/v%。另外，含有所述表面活性劑A和表面活性劑B的液中的、所述表面活性劑A和所述表面活性劑B的總濃度例如為0.001w/v% ~IOw/v%。
[0059]在本說明書中，由η個要素組成的組的“它們的組合”可以包括所述群中2~η個要素的組合。
[0060][表面活性劑Α]
[0061]本公開的處理方法中使用的表面活性劑A為下述式(I)表示的非離子性表面活性劑。表面活性劑A單獨、或者通過與對紅細胞的溶解性更高的表面活性劑B組合，能夠在維持對紅細胞和白細胞的損壞的同時，抑制由表面活性劑B對血液中的稀少細胞的損壞。從縮短處理時間、進一步抑制對稀少細胞的損壞的觀點來看，優(yōu)選組合表面活性劑A和對紅細胞溶解性更高的表面活性劑B (后述)。
[0062]R1-O- (EO) n-R2 (I)
[0063][所述式(I)中，R1為具有分支鏈的碳數(shù)為12~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù),為23~50, R2為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。]
[0064]所述式(I)的R1從抑制對血液中的稀少細胞的損壞并進行血細胞的排除的觀點來看，為具有分支鏈的碳數(shù)為12~40的烴基，優(yōu)選的是具有分支鏈的碳數(shù)為12~30的烷基。在一個或多個實施方式中，所述烴基和烷基的碳數(shù)從抑制對血液中的稀少細胞的損壞并進行血細胞的排除的觀點來看，優(yōu)選12~28，更優(yōu)選的是14~26、進一步優(yōu)選的是16~24、更進一步優(yōu)選的是18~22、更進一步優(yōu)選的是20。作為所述式(I)的R1的優(yōu)選的實施方式，有異己基、異壬基、異癸基、異十二烷基、異十六烷基、己基癸基、己基十二烷基、己基十六烷基、辛基癸基、辛基十二烷基、辛基十六烷基、壬基癸基、壬基十二烷基、壬基十六烷基，從同樣的觀點來看，優(yōu)選辛基十二烷基。所述式(I)的R2為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基，在一個或多個實施方式中，從抑制對血液中的稀少細胞的損壞并進行血細胞的排除的觀點來看，為氫原子或碳數(shù)為I~3的烷基，所述烷基在一個或多個實施方式中，為甲基、乙基、丙基或異丙基。從抑制對血液中的稀少細胞的損壞并進行血細胞的排除的觀點來看，更優(yōu)選下述式(II)作為所述式(I)。
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種含血液成分的試樣的處理方法，包括: 混合含血液成分的試樣與含有表面活性劑A及表面活性劑B的液體、或者含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體； 所述表面活性劑A為下述通式(I)所示的非離子性表面活性劑，所述表面活性劑B對紅細胞的溶解性高于所述表面活性劑A對紅細胞的溶解性，
R1-O- (EO) n-R2 (I) 所述式(I)中，R1表示具有支鏈的碳數(shù)為12~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù)，為23~50, R2為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。
2.一種含血液成分的試樣的處理方法,包括:混合含有血液成分的試樣與含表面活性劑A的液體， 不使用固定劑， 所述表面活性劑A為下述通式(I)表示的非離子性表面活性劑，
R1-O- (EO) n-R2 (I) 所述式(I)中，R1表示具有支鏈的碳數(shù)為12~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù)，為23~50, R2為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑A為聚氧乙烯亞烷基醚(Ε0=23~50)。
4.權(quán)利要求1或3所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中， 所述表面活性劑B為從聚氧乙烯聚氧化烯烷基醚、聚氧乙烯亞烷基醚(Ε0=8~22)、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它們的組合所組成的組中選擇的非離子性表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3和4中任一項所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑B為下述通式(III)表示的非離子性表面活性劑，
R3-O- (AO) m/ (EO) n-R4 (III) 所述式(III)中，R3為碳數(shù)為I~24的烷基，R4為氫原子或碳數(shù)為I~3的烷基，AO表示碳數(shù)為3~6的氧化烯基，EO表示氧乙烯基，m和η分別為AO及EO的平均附加摩爾數(shù)，m為I~100的數(shù)，η為O~50的數(shù)，“/”表示AO基和EO基也能夠不論順序地以隨機或嵌段中的任一種方式附加。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、3至5中任一項所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑B為下述式(IV)表示的非離子性表面活性劑，
R5-O- (EO) n-R6 (IV) R5表示碳數(shù)為12~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù)，為8~22,R6為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、3至6中任一項所述的含血液成分的試樣的處理方法，所述表面活性劑B為下述式(VI)表示的非離子性表面活性劑，
R7-COO- (EO) n-R8 (VI) 所述式(VI)中，R7表示碳數(shù)為10~40的烴基，EO表示氧乙烯基，η為EO的平均附加摩爾數(shù)，為6~160, R8為氫原子或碳數(shù)為I~3的烴基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、3至7中任一項所述的含血液成分的試樣的處理方法，所述表面活性劑B為具有糖殘基作為親水性部分、并具有脂肪鏈或烷基鏈作為疏水性部分的表面活性劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、3至8中任一項所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑B為蔗糖月桂酸酯。
10.一種含血液成分的試樣的處理方法，包括: 混合含有血液成分的試樣與含有表面活性劑A及表面活性劑B的液體、或含有表面活性劑A的液體及含有表面活性劑B的液體， 所述表面活性劑A為聚氧乙烯辛基十二烷基醚(EO=23~50)， 所述表面活性劑B為對紅細胞的溶解性高于所述表面活性劑A對紅細胞的溶解性的非離子性表面活性劑，并且為從聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯辛基十二烷基醚(EO=8~22)、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇脂肪酸酯、以及它們的組合所組成的組中選擇的非離子性表面活性劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1和3至10中任一項所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述表面活性劑A和所述表面活性劑B的混合的量比(A/B)(重量比)為50/50以上且低于100/0。
12.根據(jù)權(quán)利要求2至11中任一項所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，含有所述表面活性劑A的液體具有下述(I)的血細胞去除效果: (1)用蒸餾水稀釋規(guī)定量的 血液，以使使用微孔板檢測儀和600nm以上的波長的光通過吸光光度法測定的吸光度值為I以上且低于2，由此制備基準樣品， 替代所述基準樣品中的蒸餾水，使用含有2.5~5w/v%的所述表面活性劑A的液體來制備被檢樣品， 使用600nm以上的波長的光通過吸光光度法測定的所述被檢樣品的吸光度值達到所述基準樣品的吸光度值的二分之一的時間為I小時以內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的含血液成分的試樣的處理方法， 含有所述表面活性劑A和表面活性劑B的液體、或者含有表面活性劑A的液體和含有表面活性劑B的液體具有下述(2)的血細胞去除效果: (2)用蒸餾水稀釋規(guī)定量的血液，以使使用微孔板檢測儀和600nm以上的波長的光通過吸光光度法測定的吸光度值為I以上且低于2，由此制備基準樣品， 替代所述基準樣品中的蒸餾水，使用含有2.5~5w/v%的所述表面活性劑A和表面活性劑B的液體來制備被檢樣品， 使用600nm以上的波長的光通過吸光光度法測定的所述被檢樣品的吸光度值達到所述基準樣品的吸光度值的二分之一的時間為0.5小時以內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的含血液成分的試樣的處理方法，其中，所述含血液成分的試樣的處理方法是抑制所述試樣可含有的稀少細胞的生存率降低并溶解紅細胞，并且/或者降低白細胞的生存率的方法。
15.一種分離或檢測含血液成分的試樣中的稀少細胞或核酸的方法，包括:通過權(quán)利要求I至14中任一項所述的處理方法處理含有血液成分的試樣；以及從處理后的試樣中分離或檢測稀少細胞或核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的分離或檢測含血液成分的試樣中的稀少細胞或核酸的方法，其中，所述稀少細胞或核酸的分離或檢測包括:通過從使用親和性的分離、密度分離、離心分離、粘附分離、大小分離、流式細胞儀、電分離、磁性分離、播種至培養(yǎng)基、以及它們的組合所組成的組中選擇的方法進行。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的分離或檢測含血液成分的試樣中的稀少細胞或核酸的方法， 所述稀少細胞是從癌細胞、循環(huán)腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮祖細胞、癌干細胞、上皮細胞、造血干細胞、間葉干細胞、胎兒細胞以及它們的組合所組成的組中選擇的細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項所述的分離或檢測含血液成分的試樣中的稀少細胞或核酸的方法， 所述核酸為從血液成分中的RNA及DNA、癌細胞、循環(huán)腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮祖細胞、癌干細胞、上皮細胞、造血干細胞、間葉干細胞、胎兒細胞的RNA及DNA、以及它們的組合所組成的組中選擇的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項所述的分離或檢測含血液成分的試樣中的稀少細胞的方法，包括: 針對所述稀少細胞，使用下述檢測方法中附隨的標記方法來標記，所述檢測方法是從利用了放射性物質(zhì)的檢測方法、利用了發(fā)光現(xiàn)象的檢測方法、使用了色素的檢測方法、利用了磁性的檢測方法、電檢測方法、光學(xué)檢測方法、以及它們的組合所組成的組中選擇的方法。
20.一種測定含血液成分的試樣中的CTC (循環(huán)腫瘤細胞)數(shù)或CTC的核酸的方法，包括:通過權(quán)利要求1至14中任一項所述的處理方法處理含有血液成分的試樣；或者通過權(quán)利要求15至19中任一項所述的分`離或檢測方法從含有血液成分的試樣中分離或檢測稀少細胞或核酸。
21.一種含血液成分的試樣中的稀少細胞的分析方法，包括:在通過權(quán)利要求1至14中任一項所述的處理方法處理含有血液成分的試樣之后，通過包括細胞的動態(tài)觀察或活性測定的方法進行分析。
22.—種試劑盒,包含用于權(quán)利要求1至14中任一項所述的處理方法、權(quán)利要求15至19中任一項所述的分離或檢測方法、權(quán)利要求20所述的CTC數(shù)測定方法、和/或權(quán)利要求21所述的分析方法的、所述表面活性劑A和所述表面活性劑B。
23.—種試劑盒，包含用于權(quán)利要求2至14中任一項所述的處理方法、權(quán)利要求15至19中任一項所述的分離或檢測方法、權(quán)利要求20所述的CTC數(shù)測定方法、和/或權(quán)利要求21所述的分析方法的、所述表面活性劑A。
【文檔編號】G01N33/48GK103513021SQ201310247504
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月20日
【發(fā)明者】高木英紀 申請人:愛科來株式會社