用于腹主動脈瘤的生物標記物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測個體的腹主動脈瘤AAA或?qū)AA的易感性的方法、監(jiān)測個體的AAA的治療功效的方法和評估個體的AAA的嚴重程度或AAA的風險的方法，所述方法涉及測量測試樣品中存在的四氫生物喋呤H4B的量并且將其與標準物或先前測試樣品中存在的H4B的量進行比較。所述測試樣品中存在的H4B的量與所述標準物相比降低指示AAA或?qū)AA的易感性。可在第二時間點之前向所述個體投與治療，且第二測試樣品中存在的H4B的量與所述第一測試樣品相比增加指示AAA的有效治療?？设b別出候選者用于進一步測試或監(jiān)測AAA和/或治療AAA。
【專利說明】用于腹主動脈瘤的生物標記物
[0001]相關申請案交叉參考
[0002]本申請案主張于2011年10月11日提出申請的美國臨時專利申請案第61/545，975號的權益，所述申請案的全部內(nèi)容以引用方式并入本文中。在此申請案中引用了各種出版物。這些出版物的全部揭示內(nèi)容均以引用方式并入本申請案中以更全面地描述本發(fā)明所涉及領域的現(xiàn)有技術狀態(tài)。
[0003]關于聯(lián)邦資助研究的聲明
[0004]本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的批準號HL077440的政府支持下完成。政府擁有本發(fā)明中的某些權利。
【技術領域】
[0005]本發(fā)明一般來說涉及腹主動脈瘤的新穎生物標記物和使用此生物標記物檢測和監(jiān)測患者的動脈瘤風險的方法。
【背景技術】
[0006]腹主動脈瘤(AAA)是分子機理尚不清楚的嚴重人類血管疾病。它是由主動脈壁內(nèi)與漸進性主動脈擴張和最終破裂相關的組織病理學重塑來界定。男性和吸煙是AAA的唯一已知風險因素。年齡超過50歲的每250人中約有一人將死于AAA破裂。然而，對于這種盛行且危及生命的疾病來說，由于對其疾病機理缺乏了解，因此目前為止唯一療法是手術矯治。此外，手術只推薦用于大于5.5cm的AAA ;且沒有癥狀的較小AAA經(jīng)常無法診斷出，從而導致靜默生長和令人驚訝的致死性破裂。因此增進我們對于AAA病原學的理解具有公共衛(wèi)生重要性，此可能促成創(chuàng)新的治療性和預防性策略。
[0007]業(yè)內(nèi)仍需要AAA生物標記物。具體來說，仍需要可用于篩選、檢測和監(jiān)測AAA以及鑒別那些傾向于產(chǎn)生AAA的生物標記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供檢測個體的腹主動脈瘤(AAA)或?qū)AA的易感性的方法。所述方法包含(a)使來自個體的測試樣品與能夠測量測試樣品中存在的四氫生物喋呤(H4B)的量的分析裝置接觸；和(b)比較測試樣品中存在的H4B的測得量與H4B的標準量。在本發(fā)明的典型實施例中，樣品包含血清或全血。測試樣品中存在的H4B的量與標準物相比降低指示AAA或?qū)AA的易感性。在一些實施例中，測試樣品中存在的H4B的量與標準物相比統(tǒng)計學顯著降低指示AAA或?qū)AA的易感性。在其它實施例中，H4B的降低與所述標準物相比降低至少約10%或降低至少20%、30%、40%、50%或60%、70%、80%或90%。較小降低通常指示對AAA的易感性，而較大降低更可能指示AAA的存在。
[0009]因此，所述方法可進一步包含例如通過超聲或通過在一或多個指定間隔后重復測試H4B將個體鑒別為候選者用于進一步測試或監(jiān)測AAA。所述方法還可進一步包含規(guī)定H4B與所述標準物相比降低的個體進行AAA的治療。治療的實例包含葉酸療法和/或DHFR療法，包括基因療法。
[0010]還提供監(jiān)測治療個體的AAA的功效的方法。在一個實施例中，所述方法包含(a)使于第一時間點獲得的來自個體的第一測試樣品與能夠測量測試樣品中存在的H4B的量的分析裝置接觸；(b)使于第二時間點獲得的來自個體的第二測試樣品與能夠測量測試樣品中存在的H4B的量的分析裝置接觸；和(c)比較第一和第二測試樣品中存在的H4B的測得量。在第二時間點之前向所述個體投與治療，且第二測試樣品中存在的H4B的量與所述第一測試樣品相比增加指示AAA的有效治療。此方法可在治療開始時或在治療計劃已經(jīng)進行后起始。在一些實施例中，第二樣品中存在的H4B的量與第一樣品相比統(tǒng)計學顯著增加指示AAA的有效治療。在其它實施例中，H4B的增加與第一樣品相比增加至少約10%或增加至少 20%、30%、40%、50%或 60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更大。所述方法任選地進一步包含規(guī)定H4B與第一樣品相比或與標準物相比降低或增加的個體進行AAA的改良治療。
[0011]本發(fā)明另外提供評估個體的腹主動脈瘤(AAA)的嚴重程度或AAA的風險的方法。在一個實施例中，所述方法包含(a)使來自個體的測試樣品與能夠測量測試樣品中存在的H4B的量的分析裝置接觸；(b)測量測試樣品中存在的H4B的量；和(c)所述測試樣品中存在的H4B的測得量與標準物中存在的H4B的測得量。測試樣品中存在的H4B的量與標準物相比降低的程度指示所述個體的AAA的嚴重程度或風險。在一些實施例中，測試樣品中存在的H4B的量與標準物相比統(tǒng)計學顯著降低指示AAA或?qū)AA的易感性。在其它實施例中，H4B的降低與所述標準物相比降低至少約10%或降低至少20%、30%、40%、50%或60%、70%、80%或90%。較小降低通常指示對AAA的易感性或AAA的較溫和情形，而較大降低更可能指示AAA的存在或AAA的更嚴重情形。根據(jù)測試樣品中存在的H4B的量，可如本文所述監(jiān)測或治療個體。
[0012]在典型實施例中，分析裝置包含高效液相色譜(HPLC)柱或免疫分析試劑盒，例如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒、化學發(fā)光分析試劑盒或其它常規(guī)分析試劑盒。因此，本發(fā)明進一步提供包含用于檢測H4B的試劑和/或分析裝置的試劑盒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1A-C顯示血管緊張素II (Ang II)誘導高苯丙氨酸血癥(hph)_l小鼠形成腹主動脈瘤(AAA) ο向野生型(WT)小鼠和hph-Ι小鼠輸注Ang II (0.7mg/kg/天)達14天。圖1A是數(shù)字照片，其中數(shù)字顯微照片的插圖顯示在WT、WT/Ang I1、hph_l和hph-l/Ang II的不同實驗組中腹主動脈到第14天時的代表性外觀。只有輸注Ang II的hph-Ι小鼠產(chǎn)生AAA，具有可見的出血跡象。對AAA區(qū)段的蘇木精-曙紅染色(箭頭)顯示血栓形成。圖1B是顯示輸注Ang II的hph-Ι小鼠的分別為21%、65%和14%的AAA發(fā)病率和死亡率(無AAA對非致死性AAA對致死性AAA)的餅形圖。圖1C是描繪輸注Ang II的hph_l小鼠的平均血壓(MBP)變化的圖。通過頸動脈內(nèi)遙測方法(國際數(shù)據(jù)科學(Data SciencesInternational))連續(xù)監(jiān)測 MBP14 天。
[0014]圖2A-C是柱狀圖，其顯示血管緊張素II (Ang II)輸注增大四氫生物喋呤(H4B)和N0.的缺乏，并且加劇高苯丙氨酸血癥(hph)-l小鼠的內(nèi)皮NO合成酶(eNOS)解偶聯(lián)。向野生型小鼠和hph-Ι小鼠輸注Ang II (0.7mg/kg/天)達14天，此后收獲主動脈用于以下目的:圖2A顯示主動脈H4B含量；圖2B顯示主動脈N0.的產(chǎn)生量；且圖2C顯示在存在或不存在L-NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)時主動脈超氧化物(02‘_)的產(chǎn)生量。P < 0.05。
[0015]圖3A-C顯示葉酸(FA)通過恢復內(nèi)皮二氫葉酸還原酶(DHFR)表達來阻止輸注血管緊張素II (Ang II)的高苯丙氨酸血癥(hph)-l小鼠的內(nèi)皮NO合成酶(eNOS)解偶聯(lián)。在Ang II輸注(0.7mg/kg/天)前2天開始向野生型小鼠和hph-Ι小鼠經(jīng)口投與FA (15mg/kg/天)并且在整個14天研究期內(nèi)進行治療，此后，收獲主動脈用于以下目的:圖3A顯示主動脈制備物中的內(nèi)皮和非內(nèi)皮DHFR表達；圖38顯示主動脈四氫生物喋呤(H4B)含量；且圖3C顯示主動脈eNOS解偶聯(lián)活性(通過NG-硝基-L-精氨酸甲酯[L-NAME]敏感性O2的產(chǎn)生量來指示)O *P < 0.01。
[0016]圖4A-F顯示葉酸(FA)阻止輸注血管緊張素II (Ang II)的高苯丙氨酸血癥(hph)-1小鼠的腹主動脈瘤(AAA)形成并使血壓正常化。在Ang II輸注(0.7mg/kg/天)前2天開始向野生型(WT)小鼠和hph-Ι小鼠經(jīng)口投與FA(15mg/kg/天)并且在整個14天研究期內(nèi)進行治療。在第O天和第14天，執(zhí)行腹部超聲(維爾沃(Velvo) 770高分辨率回聲系統(tǒng)，維索尼克(Visualsonics))以評價利用或不利用FA治療的輸注Ang II的野生型小鼠和hph-Ι小鼠的腹主動脈(AA)尺寸(圖4A-D)。主動脈橫截面區(qū)域由藍色圓描繪，并且將計算面積列示于每一圖像下方。在研究過程期間通過遙測來評價平均血壓(MBP)(圖4E和4F)，如圖1中所述。
[0017]圖5A-B是顯示葉酸(FA)阻止輸注血管緊張素II (Ang II)的高苯丙氨酸血癥(hph)-1小鼠的內(nèi)皮NO合成酶(eNOS)的漸進性解偶聯(lián)的柱狀圖。在Ang II輸注(0.7mg/kg/天)前2天開始向野生型(WT)小鼠和hph-Ι小鼠經(jīng)口投與FA(15mg/kg/天)并且在整個14天研究期內(nèi)進行治療 。在第O天、第4天或第8天收獲主動脈用于分析(圖5A)WT小鼠和(圖5B)hph-l小鼠在存在或不存在NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)時O2的產(chǎn)生量。*P < 0.05，相對于 L-NAME ；#P < 0.05，相對于 WT sham ；+P < 0.05，相對于 4 天。
[0018]圖6A-C是顯示葉酸(FA)阻止輸注血管緊張素II (Ang II)的高苯丙氨酸血癥(hph)-l小鼠的血管重塑的顯微照片。在Ang II(0.7mg/kg/天)或媒劑輸注前2天開始利用或不利用FA(15mg/kg/天)治療野生型小鼠和hph-Ι小鼠并且在整個14天研究期內(nèi)進行治療，此后，收獲主動脈用于(圖6A)蘇木精-曙紅(H&E)染色(黑色箭頭和紅色箭頭分別指示FA誘導的中膜和外膜變化)；(圖6B)偉郝夫-范吉森(Verhoeff-Van Gieson) (VVG)染色(黑色箭頭顯示彈性蛋白變化)；和(圖6C)指示巨噬細胞浸潤的巨噬細胞染色。
[0019]圖7A-C顯示葉酸(FA)阻止高苯丙氨酸血癥(hph)-1小鼠的由血管緊張素II (AngII)誘導的基質(zhì)金屬蛋白酶(麗?)2和麗?9活化。在Ang 11(0.7mg/kg/天)或媒劑(sham)輸注前2天開始利用或不利用FA(15mg/kg/天)治療野生型小鼠和hph_l小鼠。在14天研究期后，收獲主動脈以評價MMP活性。圖7A是顯示MMP2和MMP9活性的代表性酶譜。圖7B是MMP2活性的定量數(shù)據(jù)。圖7C是MMP9活性的定量數(shù)據(jù)。*P < 0.05，相對于sham。
[0020]圖8A-B二氫葉酸還原酶(DHFR)過表達使輸注血管緊張素II (Ang II)的高苯丙氨酸血癥(hph)-1小鼠的內(nèi)皮NO合成酶(eNOS)再偶聯(lián)。在Ang II輸注前2天開始每隔一天向野生型(WT)小鼠和hph-ι小鼠的尾靜脈轉(zhuǎn)染來自阿特津生物系統(tǒng)(Altogen Biosystems)的基于脂質(zhì)的試劑中的DHFR表達載體(pcDNA3.1-DHFR)達14天。在14天輸注結(jié)束時，收獲主動脈用于(圖8A)通過蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)測定主動脈制備物中的內(nèi)皮DHFR表達和(圖8B)在存在或不存在NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)時主動脈超氧化物的產(chǎn)生量。*P < 0.05，相對于野生型(WT) sham ；#P < 0.05，相對于L-NAME ；+P < 0.05，相對于 hph-1 sham ο
[0021]圖9A-B是顯示在兩種不同的腹主動脈瘤(AAA)模型中在存在或不存在葉酸(FA)療法時H4B的主動脈和血漿水平的柱狀圖。圖9A顯示從輸注血管緊張素II (Ang II)的hph-Ι小鼠(η = 3-4)進行的測量，而圖9Β顯示從輸注Ang II的apoE缺失小鼠(η = 5-6)進行的測量。輸注Ang II的apoE小鼠通常到第4周時檢查到的AAA發(fā)生率為約92%，并且血管在第3周時經(jīng)歷了嚴重的重塑和AAA產(chǎn)生。循環(huán)的H4B和主動脈H4B的相關下降進一步證明循環(huán)的H4B可用作AAA的預測和診斷標記物。
[0022]圖10A-B繪示在兩種不同的腹主動脈瘤(AAA)模型中在存在或不存在葉酸(FA)療法時H4B水平的主動脈水平與血漿水平之間的相關性。圖1OA顯示從hph-Ι動物(η =3-4)進行的測量,而圖1OB顯示從apoE動物(η = 5-6)進行的測量。在兩種AAA模型中，循環(huán)/血漿H4B與H4B的主動脈水平很好地相關，從而確認循環(huán)/血漿H4B用于AAA形成的生物標記物作用，已經(jīng)將AAA形成與H4B的主動脈缺乏關聯(lián)。
[0023]圖11是顯示經(jīng)口投與葉酸(FA)阻止輸注Ang II的apoE缺失小鼠的腹主動脈瘤(AAA)形成的柱狀圖。Ang II輸注誘導92%的研究小鼠發(fā)生AAA，且通過經(jīng)口投與FA使其實質(zhì)上衰減到17%。在輸注Ang II的hph-Ι小鼠(79%發(fā)生率在2周內(nèi)出現(xiàn)，而apoE缺失小鼠是在4周內(nèi)出現(xiàn))中，投與FA完全阻止AAA發(fā)生(0% )。
[0024]圖12是顯示經(jīng)口投與葉酸(FA)恢復輸注Ang II的apoE缺失小鼠的eNOS功能的柱狀圖。在基線下，eNOS抑制劑L-NAME最低程度地減少超氧化物的產(chǎn)生量，從而暗示eNOS的微小解偶聯(lián)/功能失調(diào)。Ang II輸注顯著地增加L-NAME敏感性超氧化物的產(chǎn)生量，所述產(chǎn)生量可通過經(jīng)口投與FA完全消除。這些數(shù)據(jù)指示FA在恢復輸注Ang II的apoE缺失小鼠的eNOS功能/使eNOS再偶聯(lián)方面高度有效，這類似于在輸注Ang II的hph_l小鼠中所觀察到的。
[0025]圖13A-B圖解說明通過經(jīng)口投與葉酸(FA)恢復輸注Ang II的apoE缺失小鼠的主動脈一氧化氮(NO)生物利用性。通過電子自旋共振(ESR)定量地且選擇性地測量主動脈生物可利用的一氧化氮(NO)自由基。與FA使輸注Ang II的apoE缺失小鼠的eNOS完全再偶聯(lián)的發(fā)現(xiàn)一致，通過FA治療也顯著改進了主動脈一氧化氮(NO)生物利用性。圖13A顯示NO的代表性ESR譜。圖13B顯示主動脈NO水平(η = 6)的分組數(shù)據(jù)。
【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn):四氫生物喋呤(H4B)的血漿水平與H4B的組織水平相關，且因此可用作AAA產(chǎn)生的新穎生物標記物，且用作治療功效的指示物。使用兩種不同的AAA模型，也就是說輸注血管緊張素II的hph-Ι和apoE缺失小鼠，下文所述的實例證明H4B的血漿水平與H4B的組織水平密切相關，這兩者在AAA中均降低并且通過葉酸治療予以恢復。本發(fā)明由此提供篩選個體的血液、血漿或其它體液樣品的H4B的方法，從而提供創(chuàng)新、方便且有力的AAA產(chǎn)生預測物。此篩選對具有AAA風險的群體(例如年長吸煙男性)使用時特別有價值。此外，本發(fā)明的篩選方法對AAA的預測性遠高于當前所鑒別的風險因素，例如吸煙、年齡和性別。[0027]經(jīng)口投與葉酸使eNOS再偶聯(lián)并且隨后使氧化應激降低并改進一氧化氮生物利用性，此進而阻止先于AAA的血管重塑。這源于葉酸對eNOS輔因子補救酶二氫葉酸還原酶(DHFR)的上調(diào)。因此，根據(jù)本發(fā)明通過H4B測試鑒別的個體可利用葉酸或促進DHFR的其它療法(例如DHFR基因療法)進行治療。此早期檢測可減少或消除對于手術修復的需要和破裂風險。
[0028]定義
[0029]除非另有指明，否則本申請案中所用的所有科學和技術術語都具有業(yè)內(nèi)通常所用的含義。如本申請案中所用，以下用語或片語具有所指明的含義。
[0030]如本文所用，“分析裝置”是指通常用于分析、測量和/或檢測化學物質(zhì)的存在的分析儀器或設備。所述儀器的典型實例是高效液相色譜(HPLC)柱?？墒褂闷渌V儀器，以及免疫分析或其它常規(guī)檢測分析。免疫分析的典型實例是ELISA。
[0031]如所屬領域的技術人員所理解，從個體獲得的樣品可直接與分析儀器接觸或在首先與溶劑或其它預備介質(zhì)接觸后再與分析儀器接觸。
[0032]如本文所用，“對照”樣品通常是從一或多個正常、健康個體獲得，或在合適時，從同一個體但在已知個體處于健康狀態(tài)時獲得。可接受的正常水平的參考分析物(在本文中稱作“標準物”)也適合作為比較用對照。
[0033]如本文所用，“醫(yī)藥上可接受的載劑”或“賦形劑”包括在與活性成份組合時，允許所述成份保留生物活性并且不與個體免疫系統(tǒng)反應的任何材料。實例包括但不限于標準醫(yī)藥載劑，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)和各種類型的潤濕劑。用于氣溶膠或不經(jīng)腸投與的優(yōu)選稀釋劑是磷酸鹽緩沖鹽水或生理(0.9%)鹽水。
[0034]包含所述載劑的組合物是通過熟知的常規(guī)方法來調(diào)配(例如，參見雷明頓醫(yī)藥科學(Remington, s Pharmaceutical Sciences),第 18 版，Α.真納羅(A.Gennaro)編輯，馬克出版公司(Mack Publishing C0.),賓夕法尼亞州伊斯頓市(Easton, PA), 1990)。
[0035]如本文所用，除非另有明確說明，否則“一(a、an) ”意指至少一者。
[0036]方法
[0037]本發(fā)明提供檢測個體的腹主動脈瘤(AAA)或?qū)AA的易感性的方法。所述方法包含(a)使來自個體的測試樣品與能夠測量測試樣品中存在的四氫生物喋呤(H4B)的量的分析裝置接觸；和(b)比較測試樣品中存在的H4B的測得量與H4B的標準量。測試樣品中存在的H4B的量與標準物相比降低指示AAA或?qū)AA的易感性。在一些實施例中，測試樣品中存在的H4B的量與標準物相比統(tǒng)計學顯著降低指示AAA或?qū)AA的易感性?？蓹z測在約lpmol/mg到6pmol/mg范圍內(nèi)的循環(huán)H4B水平差異。在一些實施例中，H4B水平降低到小于約3pmol/mg指示AAA,并且低于約2pmol/mg的水平指示嚴重AAA。在其它實施例中,H4B的降低與所述標準物相比降低至少約10 %或降低至少20 %、30 %、40 %、50 %或60 %、70 %、80%或90%。較小降低,例如降低到約2.9-2.0pmoI/mg范圍,通常指示指示對AAA的易感性，而較大降低，例如降低到小于約1.9pmol/mg,更可能指示AAA的存在。循環(huán)H4B的量與動脈瘤的大小相關。
[0038]在一些實施例中，用于參考的標準H4B量是根據(jù)所屬領域的技術人員認為對于無AAA的健康個體來說正常的水平來采用，這將根據(jù)年齡和性別而變化。在其它實施例中，在所述方法中用于比較的標準物是從正常、健康對照個體獲得的樣品。在另外其它實施例中，用于比較的標準物是在已知所述個體無疾病時預先取自同一個體的測試樣品。用于比較的參考水平的額外可用來源包括在AAA開放修復手術期間常規(guī)收集的動脈瘤組織和相鄰組織，以及在手術前收集的血液、血漿或其它體液樣品。因此，在一些實施例中，比較從個體獲得的測試樣品中的H4B水平與正常的標準H4B水平和從AAA樣品獲得的已知異常水平兩者。
[0039]任選地，所述方法可進一步包含例如通過超聲或通過在一或多個指定間隔后重復測試H4B將個體鑒別為候選者用于進一步測試或監(jiān)測AAA。例如，具有較嚴重病情的個體可每月監(jiān)測一次，而具有輕微病情的那些可每三個月監(jiān)測一次。治療醫(yī)師將能夠基于個別患者的需要和風險來調(diào)節(jié)此計劃。因此，可重復所述方法且可比較H4B的測得量與標準物或與來自同一個體的先前測量值。初始監(jiān)測可包含重復測試H4B,且在H4B測試指示朝AAA的顯著進展后，可指引個體進行治療和/或超聲評估。測量H4B水平的變化可在可通過超聲檢測AAA之前對其進行檢測。對AAA的早期檢測使得可進行侵襲性較小的治療并避免手術。例如，如果個體表現(xiàn)出初始5-10%降低，隨后在隨訪期后觀察到顯示15%降低，那么所述個體需要比隨時間不顯示任何降低或< 10%穩(wěn)定水平的小量降低的那些受到更頻繁地監(jiān)測。
[0040]所述方法可進一步包含規(guī)定H4B與標準物相比降低的個體進行AAA的治療。所述治療的實例包含葉酸療法和/或二氫葉酸還原酶(DHFR)-靶向療法，包括基因療法和有效改進DHFR功能的任何藥理學或其它療法，此將改進H4B水平并預防、延遲或改善AAA。同樣，治療可包含針對eNOS解偶聯(lián)的其它對策。
[0041 ] 還提供監(jiān)測治療個體的AAA的功效的方法。在一個實施例中，所述方法包含(a)使于第一時間點獲得的來自個體的第一測試樣品與能夠測量測試樣品中存在的H4B的量的分析裝置接觸；(b)使于第二時間點獲得的來自個體的第二測試樣品與能夠測量測試樣品中存在的H4B的量的分析裝置接觸；和(c)比較第一和第二測試樣品中存在的H4B的測得量。優(yōu)選地，使用相同或接近相同的分析裝置和條件來獲得第一和第二測試樣品。在第二時間點之前向所述個體投與治療，且第二測試樣品中存在的H4B的量與所述第一測試樣品相比增加指示AAA的有效治療。
[0042]監(jiān)測治療功效的方法可在治療開始時或在治療計劃已經(jīng)進行后起始。在一些實施例中，第二樣品中存在的H4B的量與第一樣品相比統(tǒng)計學顯著增加指示AAA的有效治療。在其它實施例中，H4B的增加與第一樣品相比增加至少約10%或增加至少20%、30%、40%、50 %或60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、150 %、200 %或更大。所述方法任選地進一步包含規(guī)定H4B與第一樣品相比或與標準物相比降低或增加的個體進行AAA的改良治療。例如，可通過增加或降低投與個體的葉酸或另一治療劑的量來改良治療。
[0043]本發(fā)明另外提供評估個體的腹主動脈瘤(AAA)的嚴重程度或AAA的風險的方法。在一個實施例中，所述方法包含(a)使來自個體的測試樣品與能夠測量測試樣品中存在的H4B的量的分析裝置接觸；(b)測量測試樣品中存在的H4B的量；和(c)比較所述測試樣品中存在的H4B的測得量與標準物中存在的H4B的測得量。測試樣品中存在的H4B的量與標準物相比降低的程度指示所述個體的AAA的嚴重程度或風險。在一些實施例中，測試樣品中存在的H4B的量與標準物相比統(tǒng)計學顯著降低指示AAA或?qū)AA的易感性。在其它實施例中，H4B的降低與所述標準物相比降低至少約10%或降低至少20%、30%、40%、50%或60%、70%、80%或90%。較小降低通常指示對AAA的易感性或AAA的較溫和情形，而較大降低更可能指示AAA的存在或AAA的較嚴重情形。根據(jù)測試樣品中存在的H4B的量，可如本文所述監(jiān)測或治療個體。
[0044]在本發(fā)明的典型實施例中，樣品包含血清或全血，但其可為任何體液。在典型實例中，從個體抽出2ml全血，但小于約0.5ml可足夠。樣品可在多種條件下收集，包括在收集時利用或不利用旋轉(zhuǎn)減慢。樣品可使用例如多種收集管處理，所述收集管包括不含補充物、含EDTA、含肝素和業(yè)內(nèi)已知的其它條件。同樣，樣品可收集并儲存在多種條件下，包括例如在液氮中快速冷凍；在_20°C下冷凍幾周且隨后轉(zhuǎn)移到-70°C或-80°C ;或樣品在_70°C或-80°C下冷凍并儲存在此處。
[0045]分析裝置和試劑盒
[0046]在典型實施例中，分析裝置包含高效液相色譜(HPLC)柱或免疫分析試劑盒，例如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒、化學發(fā)光分析試劑盒或其它常規(guī)分析試劑盒。在典型實施例中，HPLC裝配有熒光或電化學檢測器和C-18柱。
[0047]用于本文所述方法中的試劑盒也在本發(fā)明范圍內(nèi)。所述試劑盒可包含載劑、包裝或間隔化成可容納一或多個容器(例如小瓶、管等)的容器，每一容器包含一個待用于所述方法中的單獨元件。例如，容器可包含一或多種用于檢測H4B的試劑，所述試劑任選地以可檢測方式標記。試劑盒還可包括一或多個用于報告工具(reporter-means)(例如生物素結(jié)合蛋白，例如抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素)的容器，所述報告手段結(jié)合到用于檢測H4B的可檢測標記，例如酶、熒光或放射性同位素標記。
[0048]本發(fā)明試劑盒通常將包含上述容器和一或多個其它容器，所述其它容器包含從商業(yè)和用戶角度來看需要的材料，包括緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。另外，標簽可提供于容器上以指示所述組合物用于特定應用，且還可指示使用說明。也可在試劑盒所包括的插頁上包括說明和/或其它信息。
[0049]投與和劑量
[0050]組合物是以任何合適的方式經(jīng)常與醫(yī)藥上可接受的載劑、賦形劑一起投與或以醫(yī)藥上可接受的鹽形式投與?？衫迷诒景l(fā)明上下文中向個體投與治療的合適方法，且盡管超過一種途徑可用于投與特定組合物，但特定途徑經(jīng)?？商峁┍攘硪煌緩礁苯忧腋行У姆磻?。
[0051 ] 在本發(fā)明上下文中，投與患者的劑量應足以隨時間在患者中實現(xiàn)有益治療反應，或抑制疾病進展。因此，將組合物以足以誘發(fā)有效反應和/或減輕、減少、治愈或至少部分地阻止疾病的癥狀和/或并發(fā)癥的量投與個體。將足以實現(xiàn)此目的的量定義為“治療有效劑量”。一般來說，對于包含葉酸的醫(yī)藥組合物來說，劑量中存在的量在每千克個體體重約Img到約IOOmg和更高范圍內(nèi)。代表性量包括但不限于lmg/kg體重、5mg/kg體重、15mg/kg體重、30mg/kg體重、100mg/kg體重或更高mg/kg體重。合適量將隨著患者的大小而改變，但通常將在約l_20mg/片劑或0.1mL到約5mL范圍內(nèi)。
[0052]本文所揭示的治療組合物的投與途徑和頻率以及劑量將隨個體不同而改變，且可使用標準技術容易地確定。一般來說，醫(yī)藥組合物可經(jīng)口或通過注射(例如，皮內(nèi)、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、經(jīng)鼻內(nèi)(例如，通過抽吸)投與。通常，至少I到10次劑量可經(jīng)52周時期投與。優(yōu)選地，以I個月間隔投與6次劑量，且此后可周期性地給予額外補充物。交替方案可能適合個別患者。在一個實施例中，間隔10天投與2種或更多種口服補充物。當用葉酸治療時，其通常最好每天服用一次。[0053]一般來說，適當?shù)慕o藥和治療方案以足以提供治療和/或預防益處的量提供活性齊U。所述反應可通過確定治療患者與非治療患者相比臨床結(jié)果的改進來監(jiān)測。
[0054]治療包括預防和治療。預防或治療可通過于單個時間點或多個時間點單次投與到單個或多個部位來實現(xiàn)。也可接近同時投與到多個部位。患者或個體包括哺乳動物，例如人類、?？苿游铩ⅠR科動物、犬科動物、貓科動物、豬科動物和羊科動物。個體優(yōu)選人類。
[0055]實M
[0056]呈現(xiàn)以下實例來說明本發(fā)明并幫助所屬領域的技術人員實現(xiàn)和使用本發(fā)明。所述實例并不打算以任何方式在其它方面限制本發(fā)明范圍。
[0057]實例1:解偶聯(lián)的內(nèi)皮一氧化氮合成酶在AAA形成中的作用
[0058]本實例證明eNOS解偶聯(lián)/四氫生物喋呤缺乏在AAA形成中的成因性作用。因此，經(jīng)口投與葉酸、內(nèi)皮靶向性二氫葉酸還原酶基因療法和可能針對eNOS解偶聯(lián)的其它對策可用作AAA的新治療法。
[0059]通過產(chǎn)生一氧化氮(N0‘)來快速地使超氧化物(02‘_)和其它活性氧(ROS)不活化，內(nèi)皮NO合成酶(eNOS)保護血管細胞免于氧化損害。積累的證據(jù)證明，當eNOS輔因子四氫生物喋呤(H4B)缺乏時，eNOS變得功能失調(diào)而產(chǎn)生O2._，而非NO‘H3。此eNOS的解偶聯(lián)可使內(nèi)皮功能失調(diào)惡化，使得極難矯正。一種能夠?qū)NOS轉(zhuǎn)變成解偶聯(lián)態(tài)的重要病理性激動劑是血管緊張素II (Ang II)1’2’5。如前文所示，Ang II通過NADPH氧化酶的暫時性活化和隨后H4B補救酶二氫葉酸還原酶(DHFR)的過氧化氫依賴性、內(nèi)皮特異性缺乏使eNOS解偶聯(lián)U5。
[0060]Ang II在血管疾病(例如高血壓和動脈粥樣硬化)的發(fā)病機理中起到重要作用，其是通過充分表征的機理起作用，例如血管收縮、血管NADPH氧化酶的活化和ROS依賴的炎癥性和肥大性信號傳導14_18。然而，eNOS的解偶聯(lián)代表Ang II使氧化應激延長的新穎機理u’5。然而，仍不清楚解偶聯(lián)的eNOS是否直接參與血管疾病的發(fā)病機理。繼GTP環(huán)水解酶
I(GTPCHl)突變后的四氫生物喋呤(H4B)缺乏誘導小鼠的高苯丙氨酸血癥19’2°。在基線下，高苯丙氨酸血癥(hph)-l小鼠的NO‘生物利用性降低，但因過氧化氫依賴性補償而保持血管舒張19。在與C57BL6小鼠雜交> 10代后，對hph-Ι小鼠進行基因分型并使用電子自旋共振進行表征用于檢測O2的產(chǎn)生量。盡管在野生型(WT)動物中，NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)因NO‘損失而增加02‘_的產(chǎn)生量，但L-NAME衰減hph_l小鼠的O2的產(chǎn)生量，從而暗示eNOS的解偶聯(lián)。因此，hph-Ι小鼠可用作極佳模型系統(tǒng)以研究解偶聯(lián)的eN0S/H4B缺乏對于血管發(fā)病機理的作用。
[0061]為了檢查解偶聯(lián)的eNOS是否放大了 Ang II在擴大高血壓或增大血管重塑方面的病理學效應，向WT小鼠和hph-Ι小鼠輸注Ang II，并保持14天。發(fā)現(xiàn)截至第6天到第7天通過頸動脈內(nèi)遙測方法監(jiān)測的平均血壓(MBP)在兩組中均增加。盡管WT小鼠的MBP繼續(xù)上升，但hph-Ι小鼠的MBP開始下降，這與猝死(13.9%;n = 72)相關。立即尸體檢查顯示破裂性腹主動脈瘤(AAA)。約65%的存活hph-Ι小鼠產(chǎn)生AAA，總發(fā)病率為79% (η = 72)。對AAA進行進一步表征且顯示輸注Ang 11的hph_l小鼠的漸進性DHFR缺乏和eNOS的解偶聯(lián)係廣泛血管重塑、炎癥和AAA形成的基礎。有趣的是，通過經(jīng)口投與葉酸(FA)恢復DHFR表達或DHFR的過表達完全阻止輸注Ang II的hph_l小鼠的AAA形成。這些治療也鈍化了eNOS的漸進性解偶聯(lián)，以及特征在于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活化、彈性蛋白分解、膠原重塑和巨噬細胞浸潤的血管重塑和炎癥。因此這些創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)代表eNOS解偶聯(lián)/H4B缺乏在AAA形成中起到成因性作用且經(jīng)口投與FA、DHFR靶向療法和可能針對eNOS解偶聯(lián)的其它對策可用作新穎且有力的AAA治療方案的第一證據(jù)，所述AAA是當前無法獲得藥理學治療的嚴重且盛行的人類疾病。
[0062]方法
[0063]動物、Ang II輸注和血壓測量
[0064]基于邱(Khoo)等人21的方案將hph-Ι小鼠(最初在CBA背景下)19與C57BL6小鼠回交> 10代并進行基因分型。只將C57BL6背景下的純合子hph-Ι小鼠用于實驗。使用皮下植入的滲透泵(杜瑞克(Durect)公司)向24周齡WT和hph_l雄性小鼠輸注AngII (0.7mg/kg/天)。在14天輸注期間，通過遙測方法監(jiān)測血壓。在植入滲透泵前10天將無線血壓探針植入動物中。將血壓探針導管插入左頸動脈中，而將探針主體插入右側(cè)腹部中。
[0065]使動物從手術中恢復I周。這段時期后，測量血壓3天以獲得基線。然后在手術后第10天植入滲透泵。每天從9:00AM到4:00PM以250-Hz取樣速率進行測量。每天計算平均血壓作為整個記錄期的平均值。動物和實驗程序的使用經(jīng)洛杉磯加利福尼亞大學實驗動物照護與使用委員會(the institutional animal care and usage committee at the'niversity of California Los Angeles)批準。主動脈NO和超氧化物的產(chǎn)生量的電子自旋共振測定、主動脈H4B含量的高效液相色譜測定和內(nèi)皮DHFR表達的蛋白質(zhì)印跡測定如先前所公開來執(zhí)行1’2’5。
[0066]從小鼠主動脈分離內(nèi)皮細胞
[0067]收獲后，將完整主動脈縱向切開且隨后在37°C下用膠原酶(0.6mg/mL)消化20分鐘，然后利用卷棉子輕輕去除內(nèi)皮細胞。將含有內(nèi)皮細胞的上清液離心且裂解用于蛋白質(zhì)印跡分析。
[0068]FA的經(jīng)口投與和DHFR過表達
[0069]開始向WT小鼠和hph-Ι小鼠連續(xù)經(jīng)口投與FA(15mg/kg/天)或在Ang II輸注前2天開始每隔一天尾靜脈轉(zhuǎn)染來自阿特津生物系統(tǒng)的基于脂質(zhì)的試劑中的DHFR表達載體(pcDNA3.1_DHFR)5達14天。在2周輸注時期期間每天監(jiān)測小鼠兩次，且收獲主動脈用于評價到第14天時的AAA形成、內(nèi)皮DHFR表達和eNOS解偶聯(lián)活性。立即檢查在14天輸注時期期間猝死的動物的動脈瘤且新收獲主動脈用于實驗。
[0070]腹主動脈大小的超聲檢測
[0071]用異氟烷將動物麻醉且置于溫度控制桌上，所述溫度控制桌還測量ECG的心率。在整個實驗內(nèi)調(diào)節(jié)異氟烷水平以維持心率在400bpm與500bpm之間，同時使動物充分麻醉。使用毛發(fā)去除乳膏從腹部去除毛發(fā)，且將預熱超聲傳導凝膠施用到腹部區(qū)域上。將超聲探針(維爾沃770，維索尼克)置于凝膠上以使主動脈橫向地可視化。使用多普勒(Doppler)測量來鑒別主動脈中脈動流的存在。通過在所有動物中使緊接左腎動脈分支上方的主動脈可視化來確保圖像獲取的一致定位。記錄圖像且將其保存到PC計算機上用于離線面積分析。依照標準組織學方案進行蘇木精-曙紅和偉郝夫-范吉森染色。
[0072]巨噬細胞染色
[0073]將福爾馬林固定和石蠟包埋的組織以5μπι切片。通過用二甲苯洗滌去除石蠟且然后利用遞減濃度的乙醇使其再水化。通過將切片在98.5°C抗原修復緩沖液(lOymol/L檸檬酸、0.01%吐溫(Tween) 20)中浸潰20分鐘來執(zhí)行抗原修復。在PBS+0.1%曲通(triton) (PBS-T)中洗滌切片且然后在室溫下用于PBS-T中的2%正常山羊血清將其封阻3小時。然后在4°C下將切片與一級抗體(Mac-3，BD法明津(Pharmingen)，2%于PBS-T中)一起培育過夜。在用PBS-T洗滌I小時后，在室溫下在黑暗中將切片與二級抗體(阿樂薩福陸(Alexa fluor) 488，2%于PBS-T中)一起培育2小時。在用PBS-T洗滌I小時后，依次用遞增等級的乙醇和二甲苯將切片脫水。用普芒特(Permount)介質(zhì)將切片封固并利用共焦顯微鏡(萊卡(Leica)，SPl倒置)拍照。如先前所公開來執(zhí)行MMP活性分析22。
[0074]統(tǒng)計學分析
[0075]通過ANOVA執(zhí)行不同治療組之間的比較。當指示差異時，使用鄧奈特事后測試(Dunnet post hoc test)。將P < 0.05設定為統(tǒng)計學顯著性。附圖中所示所有分組數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)為平均值土 SEM。
[0076]結(jié)果
[0077]向hph-Ι小鼠輸注Ang II誘導AAA形成
[0078]向24 周齡雄性 WT 小鼠(η = 72)和 hph-Ι 小鼠(η = 72)輸注 Ang II (0.7mg/kg/天)14天。約14%的輸注Ang II的hph_l小鼠在14天內(nèi)突然死于AAA破裂(圖1B)。在存活者中，65%產(chǎn)生AAA，總發(fā)病率為79% (圖1A-1B)。相比之下，輸注Ang II的WT小鼠或未治療hph-Ι小鼠均未死亡或產(chǎn)生AAA(圖1A)。通過頸動脈內(nèi)遙測方法監(jiān)測MBP且發(fā)現(xiàn)hph-Ι小鼠與WT小鼠相比在基線下略高(S卩，第O天Ang II輸注；圖1C)。在AngII輸注期間，截至第6天，MBP在兩種基因型中均增力口 (WT:101±3-140 +2mm Hg ；hph-l:112±3-140±2_ Hg;圖1C)。此后，MBP在hph_l小鼠中下降，而其在WT小鼠中繼續(xù)上升(圖 1C)。
[0079]Ang II輸注在hph_l小鼠中增大H4B和N0.的缺乏并加劇eNOS解偶聯(lián)
[0080]對從輸注Ang II的WT小鼠和hph_l小鼠新分離的主動脈進行H4B含量的高效液相色譜測定以及N0.和O2.-的產(chǎn)生量的電子自旋共振測定U2。與WT小鼠相比，hph-Ι小鼠表現(xiàn)降低的主動脈H4B生物利用性(圖2A)，所述主動脈H4B生物利用性因Ang II輸注而進一步降低(1.9 + 0.2-1.0 + 0.lpmol/mg蛋白質(zhì)；圖2A)。Ang II輸注也顯著地降低WT小鼠的主動脈H4B生物利用性(5.1±0.2-3.8±0.4pmol/mg蛋白質(zhì))。值得注意的是，主動脈N0.的產(chǎn)生量反映了輸注Ang II的WT小鼠和hph_l小鼠的這些變化(圖2B)。主動脈O2的產(chǎn)生量在存在或不存在L-NAME時測定。hph-Ι小鼠的基礎O2的產(chǎn)生量是WT小鼠的兩倍(圖2C，比較sham hph-Ι對sham WT)。盡管L-NAME在未治療WT小鼠中因抑制eNOS偶聯(lián)而增加O2 產(chǎn)生量(圖2C)，但L-NAME降低輸注Ang II的WT小鼠的O2 產(chǎn)生量，這與響應Ang II的eNOS解偶聯(lián)一致，如先前所報道1,5 (圖2C)。在hph-Ι小鼠中，L-NAME降低未治療小鼠的O2產(chǎn)生量，這與在不存在Ang II輸注時eNOS在基線下的解偶聯(lián)一致(圖2C)。重要的是，Ang II輸注使hph-Ι小鼠的eNOS進一步解偶聯(lián)，如通過受L-NAME完全抑制的O2的實質(zhì)上更高的產(chǎn)生量所證明(圖2C)。
[0081 ] FA在輸注Ang 11的hph_l小鼠中恢復內(nèi)皮DHFR表達和H4B生物利用性并阻止eNOS解偶聯(lián)
[0082]在Ang II輸注(0.7mg/kg/天)前2天開始向WT小鼠和hph_l小鼠經(jīng)口投與FA(15mg/kg/天)并且在整個14天研究期內(nèi)進行治療。分析內(nèi)皮細胞(從主動脈消化，參見方法部分)和內(nèi)皮細胞剝離的主動脈兩者的DHFR表達。如所顯示，hph-Ι小鼠表現(xiàn)降低的內(nèi)皮DHFR表達，這因Ang II輸注而進一步降低。FA治療將hph_l小鼠的內(nèi)皮DHFR表達恢復到接近WT水平(圖3A)。同樣通過FA治療阻止由Ang II在WT小鼠與hph_l小鼠兩者中誘導的H4B缺乏，使兩組中的H4B水平甚至高于基線(圖3B)。此外，F(xiàn)A阻止輸注AngII的WT小鼠和hph-Ι小鼠兩者的eNOS解偶聯(lián)，如通過L-NAME敏感性O2 ‘ _產(chǎn)生量的完全衰減所證明(圖3C)。
[0083]FA治療在輸注Ang II的hph_l小鼠中阻止AAA形成并使血壓正?；?br> [0084]關于此研究，使用總共21只經(jīng)FA治療的輸注Ang II的hph_l小鼠，且這些動物均未產(chǎn)生AAA。使用2X2列聯(lián)表的統(tǒng)計學分析顯示此AAA產(chǎn)生的降低是顯著的(P< 0.0001)。在第O天和第14天，使用超聲(裝配有45MHz換能器的維爾沃770高分辨率回聲系統(tǒng)，維索尼克)監(jiān)測腹主動脈尺寸。Ang II輸注誘導hph-Ι小鼠的腹主動脈的顯著擴大(0.37-1.96mm2)，這是通過FA治療來防止(0.39-0.52mm2 ；圖4A到4D)。相反，在WT小鼠中，Ang II誘導腹主動脈大小的最小增加(0.53-0.66mm2)。另外，F(xiàn)A在衰減WT小鼠的Ang II誘導的高血壓方面高度有效(圖4E)，并且其還阻止輸注Ang II的hph_l小鼠的MBP下降(圖4F)。這些數(shù)據(jù)表明，在輸注Ang II的WT小鼠中，eNOS的解偶聯(lián)導致MBP升高，這最有可能是因為NO‘生物利用性降低所致，而在表現(xiàn)更大程度的eNOS解偶聯(lián)的hph-1小鼠中，ROS的過量產(chǎn)生自相矛盾地降低MBP，或MBP的降低是通過獨立于ROS的機理介導。
[0085]FA阻止輸注Ang II的hph_l小鼠的eNOS的漸進性解偶聯(lián)和血管重塑
[0086]為了檢查在AAA產(chǎn)生期間的不同時間點處FA對eNOS解偶聯(lián)的影響，在起始AngII輸注后第4天和第8天關注O2 產(chǎn)生量。收獲主動脈且在存在或不存在L-NAME時進行02‘_的電子自旋共振檢測。在WT小鼠中，對于兩個檢查時間點，eNOS解偶聯(lián)活性均保持響應Ang II而穩(wěn)定。如圖5A中顯而易見，反映eNOS解偶聯(lián)活性的L-NAME敏感性O2 產(chǎn)生量在第4天和第8天類似。相比之下,Ang II誘導hph-Ι小鼠的eNOS的漸進性解偶聯(lián)。如圖5B中所顯示，L-NAME可抑制份數(shù)的O2產(chǎn)生量在第8天與第4天所觀察到的相比增大。重要的是，在兩個時間點，F(xiàn)A均一致地抑制hph-Ι小鼠的eNOS解偶聯(lián)活性。在額外實驗中，發(fā)現(xiàn)FA還阻止hph-Ι小鼠的Ang II誘導的血管重塑。如通過蘇木精-曙紅染色所指示，F(xiàn)A消除了輸注Ang II的hph-Ι小鼠的中膜退化和外膜炎癥細胞募集(圖6A)。更具體來說，F(xiàn)A衰減了中膜彈性蛋白的扁平化和彈性蛋白纖維的稀疏化，如通過偉郝夫-范吉森(VVG)染色所顯示(圖6B)。對于輸注Ang II的小鼠，浸潤性巨噬細胞(包括MMP9在內(nèi)的基質(zhì)降解酶的一個主要來源)也受到顯著上調(diào)，這經(jīng)FA治療完全衰減(圖6C)。此外，F(xiàn)A衰減了 hph-Ι小鼠的由Ang II誘導的MMP2活化和MMP9活化的增大，而其也抑制了 WT小鼠的由Ang II誘導的MMP2活化(圖7)。
[0087]DHFR基因療法在輸注Ang II的hph_l小鼠中使eNOS再偶聯(lián)并阻止AAA形成
[0088]如先前所顯示，DHFR基因療法在使輸注Ang II的WT小鼠的eNOS再偶聯(lián)方面有效、為了測試DHFR基因療法是否足以克服其在輸注Ang II的hph_l小鼠中在對于AAA形成至關重要方面的不足，在起始Ang II輸注之前且在整個輸注期內(nèi)用DHFR轉(zhuǎn)染W(wǎng)T小鼠或hph-Ι小鼠。在成功地活體內(nèi)轉(zhuǎn)染含有DHFR的表達載體后，內(nèi)皮DHFR表達顯著增強(圖8A)5，且這在完全衰減輸注Ang II的hph-Ι小鼠的eNOS解偶聯(lián)增大(L-NAME)而非如WT對照中的O2-.產(chǎn)生量增加方面有效(圖8B)。過表達DHFR的輸注Ang II的hph_l小鼠均未產(chǎn)生AAA。
[0089]討論
[0090]本研究的最重大發(fā)現(xiàn)是首次證明eNOS解偶聯(lián)/H4B缺乏在AAA形成中的成因性作用和eNOS再偶聯(lián)的治療潛力。在eNOS在基線下解偶聯(lián)的hph_l小鼠中，Ang II輸注誘導AAA形成與eNOS的進一步解偶聯(lián)。利用經(jīng)口投與FA進行治療有效地同時阻止hph_l小鼠的eNOS解偶聯(lián)與AAA形成。此外，F(xiàn)A衰減hph_l小鼠與WT小鼠兩者的由Ang II誘導的血管重塑，并差別地調(diào)節(jié)兩組動物的血壓對Ang II的反應。這些發(fā)現(xiàn)表明eNOS解偶聯(lián)使得易于形成AAA且針對eNOS再偶聯(lián)的策略可在治療這一血管病癥中有益。
[0091]已在人類AAA中全身性地與局部地檢測到氧化應激參數(shù)升高23’24。此外，已結(jié)合在動物模型中以實驗方式誘導的AAA報道了主動脈氧化應激增加，且針對氧化應激的對策已證明在阻止輸注Ang II的小鼠的AAA形成方面有效，但在人類中無效25_27。盡管先前已確定血管平滑肌的作用，但是否還有氧化應激的其它細胞或酶來源參與AAA的發(fā)病機理仍有待全面理解。這是首次在鼠類模型中報道解偶聯(lián)的eNOS可造成氧化應激，從而導致嚴重血管重塑和AAA形成。AAA的腎下模式非常類似于在人類中所發(fā)現(xiàn)的。另外，在具有解偶聯(lián)的eNOS的小鼠中觀察到的病理學特征類似于在人類AAA中所觀察到的那些，包括外膜炎癥、MMP活化和基質(zhì)降解(圖6和7)。此外，AAA易于破裂，從而導致猝死，如通過這些輸注AngII的hph-Ι小鼠的14%死亡率所證明(圖1B)。值得注意的是，解偶聯(lián)過程使eNOS成為過氧亞硝酸鹽生成物，從而暗示了過氧亞硝酸鹽而非其它ROS可能用作AAA形成的重要氧化還原信號傳導介體。喂養(yǎng)高脂肪的載脂蛋白E缺失小鼠缺失eNOS導致自發(fā)AAA形成，但發(fā)生率低得多，為25% 28’29。值得注意地，也已在載脂蛋白E-缺乏小鼠中在基線下觀察到eNOS解偶聯(lián)7’3°。缺乏eNOS的小鼠表現(xiàn)隨N0.產(chǎn)生量損失而發(fā)生的氧化應激增加。然而，這些小鼠并未產(chǎn)生eNOS解偶聯(lián)，因為其缺乏功能eNOS蛋白質(zhì)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明血管系統(tǒng)中的eNOS解偶聯(lián)依賴性N07R0S失衡而非N0.產(chǎn)生量損失本身更深刻地誘導了 AAA形成。所述數(shù)據(jù)也表明內(nèi)皮細胞在參與促進AAA形成的氧化物生成中的新穎作用。
[0092]Ang II輸注誘導hph_l小鼠的血壓的快速上升，這類似于在WT小鼠中所觀察到的。然而，在hph-Ι小鼠中，在第6天Ang II輸注后，血壓開始漸進性地下降，截至第11天達到預治療值。相比之下，在WT小鼠中，血壓在整個Ang II輸注過程中不斷上升。利用已證明使eNOS再偶聯(lián)u1’32的FA進行治療同時衰減源于Ang II輸注的WT小鼠的血壓上升與hph-Ι小鼠的血壓下降,表明eNOS解偶聯(lián)參與這兩種反應。在WT動物的情況下，由AngII誘導的eNOS解偶聯(lián)可能通過降低N0.生物利用性而導致高血壓。N0.生物利用性降低還可能造成hph-Ι小鼠在基線下的血壓增加以及對Ang II輸注的初始升壓反應(圖1C)。輸注Ang II的hph-Ι小鼠的血壓的隨后下降也似乎源于eNOS解偶聯(lián),但確切機理仍有待確定?？赡苁巧L的動脈瘤影響血液動力學，因而影響血壓。氧化應激對血壓的調(diào)節(jié)是復雜的且依賴于可具有血管收縮或血管舒張效應的NO‘的破壞與ROS的產(chǎn)生之間的平衡。例如，過氧化氫已顯示介導高血壓動物的補償性血管舒張6。那么通過eNOS的再偶聯(lián)清除eNOS源過氧化氫可增加血管收縮性(vasocontractility)和血壓。考慮到WT小鼠響應Ang II輸注而產(chǎn)生持續(xù)高血壓,但沒有AAA形成，而hph-Ι小鼠產(chǎn)生AAA形成，但僅有暫時性高血壓，所述數(shù)據(jù)與高血壓并非AAA產(chǎn)生的決定性風險因素但其可促進疾病過程的先前觀點一致 28,29,33
[0093]也很重要的是，注意eNOS在輸注Ang II的hph_l小鼠中漸進性地解偶聯(lián)，但在WT小鼠中則不會(圖6)，這與通過FA治療完全矯正的hph-Ι小鼠的漸進性DHFR缺乏一致(圖3A)。這些數(shù)據(jù)指示內(nèi)皮DHFR缺乏在介導eNOS解偶聯(lián)和AAA形成中的關鍵作用。DHFR在血管細胞而非內(nèi)皮細胞中表達；然而，只有內(nèi)皮DHFR豐度與主動脈H4B和NO‘生物利用性相關(圖 3A)1’5。
[0094]先前研究已顯示MMP (特別是MMP-2和MMP-9)是AAA產(chǎn)生的主要參與者(player) 34^36 0在此研究中，觀察到這些酶在輸注Ang II的hph_l動物中的活性均增加(圖7B和7C)，這與那些早期觀察結(jié)果非常匹配。有趣的是，MMP-2活性在并未產(chǎn)生AAA的輸注Ang II的WT動物中也增加。這似乎表明單獨MMP2活化不足以實現(xiàn)AAA產(chǎn)生。值得注意的是，僅在輸注Ang II的hph-Ι小鼠中發(fā)現(xiàn)MMP-9活性增加。此外，這些動物的巨噬細胞染色(圖6C)豐度顯著高于輸注Ang II的WT動物。這些發(fā)現(xiàn)與AAA中的MMP-9的來源一般為巨噬細胞的先前觀察結(jié)果一致36?？傊鰯?shù)據(jù)表明Ang II輸注導致WT動物與hph-1動物兩者的主動脈中MMP-2的產(chǎn)生增加，很有可能來自血管平滑肌細胞34’36’37和內(nèi)皮細胞38’39。然而，來自受刺激血管細胞和浸潤性巨噬細胞的MMP-9的增加是發(fā)生AAA所必需的。
[0095]這些數(shù)據(jù)創(chuàng)新性地表明eNOS解偶聯(lián)/H4B缺乏在AAA形成中的成因性作用并且提高了經(jīng)口投與FA、DHFR基因療法和可能針對eNOS解偶聯(lián)的其它對策可在治療AAA中具有益處的可能性。
[0096]參考文獻
[0097]實例I中所提供的參考文獻引文的完整列表可在聞(Gao)等人，2012,聞血壓(Hypertension) 59:158-166 中找到。
[0098]實例2:通過飲食葉酸阻止腹主動脈瘤形成
[0099]本實例證明補充FA的飲食可通過改進組織H4B水平和eNOS的再偶聯(lián)來阻止輸注Ang II的apoE缺失小鼠產(chǎn)生AAA。實例I中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示FA在輸注Ang II的hph_l動物模型中消除AAA產(chǎn)生方面有效。在此實例中，在另一 AAA模型中測試所述治療而顯示FA的保護作用擴展到其它模型。此外，本實例測試了 FA是否通過H4B和eNOS的再偶聯(lián)來發(fā)揮其保護作用。
[0100]使用植入式阿澤特(Alzet)滲透泵向3到5月齡apoE缺失小鼠輸注Ang
II(1000ng/kg/min)達4周。在Ang II輸注前兩天且在整個4周研究期內(nèi)向動物進給正常飼料或定制的FA飼料(15mg/kg/天)。值得注意的是,26只食用正常飼料的輸注Ang II的apoE缺失小鼠中有24只(92.3% )產(chǎn)生AAA(圖11)。利用FA治療，AAA的發(fā)生率下降到24只中的4只(16.7%)0通過電子自旋共振測定的主動脈超氧化物產(chǎn)生量顯示apoE缺失小鼠經(jīng)Ang II處理而增加2.67±0.15倍，這通過投與FA而衰減到1.75±0.01倍(各自為η = 6)。也對反映eNOS解偶聯(lián)活性的L-NAME敏感性超氧化物產(chǎn)生量進行了測量。經(jīng)Ang II處理的apoE缺失小鼠大大增加了 eNOS功能失調(diào)，其中L-NAME敏感性超氧化物產(chǎn)生量增加2.22±0.2倍，從apoE缺失小鼠在1.17±0.06倍的基線下的eNOS適度解偶聯(lián)顯著放大。用FA進行治療恢復了 eNOS功能，導致L-NAME敏感性超氧化物的-1.22±0.4倍變化，這指示沒有來自eNOS的超氧化物產(chǎn)生量。這些數(shù)據(jù)證明，經(jīng)口 FA治療在輸注Ang II的apoE缺失小鼠的第二 AAA模型中降低AAA發(fā)生率方面極為有效。所述數(shù)據(jù)進一步表明，F(xiàn)A的這種保護作用至少部分地歸因于eNOS功能的恢復。
[0101]實驗設計:
[0102]關于此研究，向apoE缺失雄性動物輸注Ang II達4周，這已在文獻中顯示在90-100%動物中可靠地產(chǎn)生AAA。向一組動物進給混合有FA的飼料。在輸注期使用非侵襲性超聲技術監(jiān)測AAA產(chǎn)生。在4周結(jié)束時，收獲來自動物的主動脈并執(zhí)行組織學或生物化學分析以評價AAA的各種標記物和eNOS功能狀態(tài)。
[0103]將含有Ang II (1000ng/kg/min)或媒劑的滲透泵(阿澤特，2004型)皮下植入動物中。向動物給予在室內(nèi)制備的混合有FA(15mg/kg/天)的定期飼料或食物顆粒。在無痛處死后從動物小心地切開主動脈并清潔掉結(jié)締組織。每周且在無痛處死后從每一動物收集血液樣品(約0.1mL)。
[0104]在Ang II輸注期通過超聲成像系統(tǒng)(維沃(Vevo) 770,維索尼克)來非侵襲性地監(jiān)測AAA的產(chǎn)生。使腹主動脈橫向地成像并通過多普勒測量來鑒別主要脈動流的存在。通過使緊接左腎動脈分支上方的主動脈可視化來維持動物之間沿主動脈的一致定位。隨后從所捕獲的圖像離線測量主動脈大小。在Ang II輸注后每周進行兩次測量，并且在Ang II輸注(用于對照)前進行兩次測量。AAA定義為腹主動脈腫大至少50%并且稍后在實驗端點處確認。還通過在收獲時直接檢查腹主動脈或?qū)δ切┧烙谕蝗黄屏训膭游镞M行尸體檢查來評價此模型的AAA發(fā)生率。
[0105]使用組織學和生物化學分析(例如MMP酶譜法)來評價FA針對AAA的保護的有效性。將進行所收獲主動脈的切片的組織學分析以使腹主動脈的細節(jié)可視化。組織固定于甲醒中，包埋于石臘中，并且以5 μ m切片。執(zhí)行標準H&E染色、梅森三色(Mason’s trichrome)染色和VVG染色。
[0106]MMP活性的增加是AAA產(chǎn)生的標志之一。因此，MMP活性可使用其它研究中所詳細描述的酶譜法技術測量。簡單來說，將主動脈裂解物加載到輸注明膠的SDS-PAGE凝膠上。在電泳后，通過在37°C下將凝膠培育過夜通過所加載樣品中的MMP消化凝膠中的明膠。然后利用標準考馬斯藍(Coomassie blue)染色使裂解帶可視化。
[0107]如先前所述使用HPLC系統(tǒng)測量H4B水平。簡單來說，用三氯乙酸和DTT裂解主動脈樣品，使其經(jīng)受酸性或堿性氧化，且在HPLC系統(tǒng)(島津(Shimadzu))中分離后利用熒光檢測器檢測H4B和其氧化物質(zhì)。
[0108]通過在存在或不存在L-NAME時使用電子自旋共振(ESR，來自布魯克(Bruker))測量超氧化物產(chǎn)生來評價裂解的主動脈樣品中eNOS的功能狀態(tài)。在其中eNOS偶聯(lián)的正常條件下，添加eNOS抑制劑L-NAME將增加超氧化物產(chǎn)生量，因為eNOS通常產(chǎn)生NO來清除超氧化物。然而，在其中eNOS正在產(chǎn)生超氧化物的eNOS解偶聯(lián)條件下，添加L-NAME將降低超氧化物產(chǎn)生量。超氧化物產(chǎn)生量的這種變化方向?qū)⒃试S對eNOS在動物主動脈中的功能進行精確評價。
[0109]實例3:作為hph-Ι小鼠和apoE缺失小鼠的AAA牛物標記物的循環(huán)H1B水平
[0110]本實例證明H4B水平可用作AAA生物標記物。在此研究中，對hph_l小鼠和輸注Ang II的apoE缺失小鼠的另一確定的AAA模型兩者進行了研究。在apoE缺失小鼠中，使用HPLC測量的H4B顯示在主動脈中，H4B水平隨著Ang II輸注而降低(4.86±0.32到2.72±0.26pmol/mg，各自為 η = 6)，并且隨著經(jīng)口投與 FA 而增加(6.60±0.62pmol/mg，η=6)。當從血漿測量 H4B 時，觀察到類似趨勢(3.31±0.13、1.87±0.11、5.80±0.30pmol/mg，分別對應于媒劑、Ang I1、FA，各自為η = 6)。同樣在hph_l小鼠中，H4B的主動脈水平顯現(xiàn)為 1.87±0.25,0.99±0.11,3.00±0.64，且血漿水平為 1.37±0.05,0.92±0.06 和
2.36 + 0.25pmol/mg(分別對于媒劑、Ang II和AngII/FA，各自為η = 3)。更完全且更新的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于圖9Α-Β和11中。
[0111]此外，對于apoE缺失小鼠以及對于hph-Ι來說，血漿與主動脈H4B水平之間的線性相關顯示0.86的R2，表明兩次測量之間的線性關系。此兩次測量之間的線性關系極其重要，因為這將允許測量局部血管H4B生物利用性的較小侵襲性方法，相信這對于預測AAA產(chǎn)生必不可少。更完全且更新的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于圖10A-B中。
[0112]這些數(shù)據(jù)指示降低的H4B生物利用性與AAA形成相關，而恢復的H4B生物利用性與AAA產(chǎn)生的阻止相關。此外，主動脈H4B值的變化在血漿中得到反映?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明循環(huán)H4B水平可用作AAA產(chǎn)生的生物標記物以及治療功效的預測物。
[0113]實驗設計:
[0114]從輸注Ang II的apoE缺失動物和hph_l動物收集血液樣品。每周從每只動物的尾靜脈收集約0.1mL血液。如上文所概述使用HPLC來測定血液樣品中H4B的濃度。
[0115]還研究了如上文所用的FA補充是否改進H4B在循環(huán)和血管組織兩者中的可利用性。利用補充FA的飲食治療輸注Ang II的apoE缺失小鼠或hph-Ι小鼠，并于I周、2周、3周和4周的不同時間點使用HPLC測定循環(huán)和主動脈H4B含量。使這些數(shù)據(jù)與AAA的產(chǎn)生相關以檢查作為生物標記物的H4B的實際改進是如何與AAA的阻止關聯(lián)的。確定了輸注AngII的apoE缺失小鼠產(chǎn)生AAA需要3_4周，且在這些時間點，循環(huán)和組織H4B水平實際上降低，但通過FA治療得到恢復(圖9-10)。
[0116]實例4:經(jīng)口投與葉酸恢復輸注Ang II的apoE缺失小鼠的eNOS功能和主動脈NO生物利用性
[0117]本實例證明FA在恢復eNOS功能方面高度有效。向小鼠輸注Ang II達4周(η =6),而在Ang II輸注前2天且在整個研究期內(nèi)用葉酸以15mg/kg/天經(jīng)口治療平行組(η =6)。還包括一組未治療的apoE缺失小鼠(η = 6)。在基線下，eNOS抑制劑L-NAME最低程度地減少超氧化物產(chǎn)生量，從而暗示eNOS的微小解偶聯(lián)/功能障礙。Ang II輸注顯著地增加L-NAME敏感性超氧化物產(chǎn)生量，所述產(chǎn)生量可通過經(jīng)口投與FA完全消除?？傊?，這些數(shù)據(jù)指示FA在通過恢復主動脈和循環(huán)H4B水平來恢復eNOS功能方面高度有效，如圖9和10中所示，且通過這些機理，F(xiàn)A阻止輸注Ang II的apoE缺失小鼠(廣泛認可的經(jīng)典AAA模型)形成AAA (圖11)。圖13 —致地證明通過FA治療因恢復eNOS功能也顯著地改進一氧化氮(NO)生物利用性。
[0118]表:動脈瘤在apoE缺失小鼠中的發(fā)生率
[0119]
【權利要求】
1.一種檢測個體的腹主動脈瘤AAA或?qū)AA的易感性的方法，所述方法包含: (a)使來自所述個體的測試樣品與能夠測量所述測試樣品中存在的四氫生物喋呤(H4B)的量的分析裝置接觸；和 (b)比較所述測試樣品中存在的H4B的測得量與H4B的標準量； 其中所述測試樣品中存在的H4B的量與所述標準物相比降低指示AAA或?qū)AA的易感性。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述分析裝置包含高效液相色譜HPLC柱。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述分析裝置包含免疫分析試劑盒。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述測試樣品中存在的H4B的所述量與所述標準物相比降低20%指示AAA或?qū)AA的易感性。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述測試樣品中存在的H4B的所述量與所述標準物相比降低50%指示AAA或 對AAA的易感性。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述樣品包含血清或全血。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其進一步包含規(guī)定H4B與所述標準物相比降低的所述個體進行AAA的治療。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述治療包含葉酸療法。
9.一種監(jiān)測個體的AAA的治療功效的方法，所述方法包含: (a)使于第一時間點獲得的來自所述個體的第一測試樣品與能夠測量所述測試樣品中存在的四氫生物喋呤H4B的量的分析裝置接觸； (b)使于第二時間點獲得的來自所述個體的第二測試樣品與能夠測量所述測試樣品中存在的四氫生物喋呤H4B的量的分析裝置接觸； (c)比較所述第一和第二測試樣品中存在的四氫生物喋呤H4B的測得量； 其中在所述第二時間點之前向所述個體投與治療，且其中所述第二測試樣品中存在的H4B的量與所述第一測試樣品相比增加指示AAA的有效治療。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述分析裝置包含高效液相色譜HPLC柱。
11.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述分析裝置包含免疫分析試劑盒。
12.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述第二測試樣品中存在的H4B的所述量與所述第一測試樣品相比增加20%指示AAA的有效治療。
13.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述樣品包含血清或全血。
14.根據(jù)權利要求9所述的方法，其進一步包含規(guī)定H4B與所述標準物相比降低或增加的所述個體進行AAA的改良治療。
15.—種評估個體的腹主動脈瘤AAA的嚴重程度或AAA的風險的方法，所述方法包含: (a)使來自所述個體的測試樣品與能夠測量所述測試樣品中存在的四氫生物喋呤H4B的量的分析裝置接觸；和 (b)測量所述測試樣品中存在的四氫生物喋呤H4B的所述量； (c)比較所述測試樣品中存在的H4B的所述測得量與標準物中存在的H4B的測得量； 其中所述測試樣品中存在的H4B的所述量與所述標準物相比降低的程度指示所述個體的AAA的嚴重程度或風險。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述分析裝置包含高效液相色譜HPLC柱。
17.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述分析裝置包含免疫分析試劑盒。
18.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述樣品包含血清或全血。
19.根據(jù)權利要求15所述的方法，其進一步包含規(guī)定H4B與所述標準物相比降低的所述個體進行AAA的治 療。
20.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述測試樣品中存在的H4B的所述量與所述標準物相比降低50%指示嚴重AAA。
【文檔編號】G01N33/53GK103988080SQ201280060568
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年10月11日 優(yōu)先權日:2011年10月11日
【發(fā)明者】才華 申請人:加利福尼亞大學董事會