電化學測定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種電化學測定。該電化學測定使用包括電活性材料(12)覆層的順磁性顆粒(10)，以檢測或測量目的分析物(30)。分析物隨著具有覆層的順磁性顆粒(10)被帶到電極(42)的附近。電勢的施加將順磁性顆粒(10)上的電活性的覆層(12)轉(zhuǎn)變成離子，所述離子可以使用例如陽極溶出伏安法測量。離子的水平對應(yīng)于在樣品中的目的分析物(30)的量。
【專利說明】電化學測定
[0001]本申請涉及電化學測定，尤其涉及用于測定樣品中的分析物的存在或量的方法。
[0002]免疫測定經(jīng)常用于檢測樣品中的特定的分析物。例如，可以使用特定生物標記物如睪酮或皮質(zhì)醇的抗體，來測試在運動員的唾液、血液或尿液中的這些物質(zhì)的水平。
[0003]W02005/121792公開了結(jié)合到目的物種的金屬顆粒的用途。將金屬顆粒溶解，并隨后電化學測量，以提供金屬標記的物種的存在或量的指示。然而，為了溶解金屬顆粒，所述方法需要化學氧化劑。隨之而來的問題是，氧化劑可能通過破壞掃描的基線而干擾掃描的電化學特征。在W02005/121792中描述的測定依賴于形成金屬離子，以使金屬被電分析地轉(zhuǎn)移到電極表面。這是成問題的，尤其是當分析生物學樣品時。在生物學樣品溶液中的蛋白質(zhì)和其他分子典型地結(jié)合金屬離子，致使它們沒有電化學活性。也可以通過與化學氧化劑螯合/偶聯(lián)而使金屬離子沒有電化學活性。因此，信號的靈敏度降低。
[0004]W02009/068862公開了 一種處理上述問題的測定。該測定利用化學隔離劑(release agent)使金屬標記從目的分析物分離，隔離劑與金屬標記共同形成帶電的(典型地帶負電的)物種。隨后施加電勢，以將該帶電的物種帶到電極。隨后，向該帶電的物種施加正電勢，以由金屬標記形成金屬離子。隨后進行定量測定程序如陽極溶出伏安法(ASV)，以測定被金屬標記的分析物的存在或量。此測定需要使用化學隔離劑。
[0005]本發(fā)明尋求克服上述問題中的一種或多種。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于測定樣品中的分析物的存在或量的方法，所述方法包括以下步驟:用被電活性材料覆蓋的順磁性顆粒標記所述分析物；施加磁場以將所述被標記的分析物帶到電極；向所述被標記的分析物施加電勢以由所述電活性材料形成離子；以及進行定量測定程序以測定被金屬標記的分析物的存在或量。
[0007]離子在非?？拷姌O表面處形成。因此，離子在其被測量之前失活的機會很小。因此不必形成離子和螯合劑之間的配合物。此外，因為使用電化學勢溶解電活性材料，所以不必使用化學氧化劑并且避免了與化學氧化劑相關(guān)的問題。而且，被電活性材料覆蓋的順磁性顆粒的使用使得能夠在電極處測量電活性材料，而無需將電活性標記與分析物分離。這因此不需要使用任何化學隔離劑。
[0008]在優(yōu)選的實施方案中，被標記的分析物結(jié)合至設(shè)置在緊接著電極的樣品載體的區(qū)域處的結(jié)合部分。
[0009]優(yōu)選地，在進行定量測定程序之前，將磁場反轉(zhuǎn)。作為結(jié)果，在電極處僅留下了經(jīng)由分析物結(jié)合到所述結(jié)合部分的具有覆層的順磁性顆粒，并且因此僅測量覆蓋那些顆粒的電活性材料。這避免了需要洗滌步驟以從電極上除去未結(jié)合的顆粒。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于測定樣品中的分析物的存在或量的方法，所述方法包括以下步驟:提供被電活性材料覆蓋且包括第一結(jié)合部分的順磁性顆粒；提供在緊接著電極的樣品載體的區(qū)域處的第二結(jié)合部分；將被懷疑含有所述分析物的樣品與所述第一和第二結(jié)合部分溫育；施加磁場以將所述順磁性顆粒帶到所述電極，向所述電活性材料施加電勢以形成離子，以及進行定量測定程序以測定所述分析物的存在或量。
[0011]如果目標分析物存在，電活性順磁性顆?？梢越?jīng)由結(jié)合部分結(jié)合在電極表面?？梢越柚艌鰧⑽唇Y(jié)合的顆粒從電極移開。隨后可以通過施加電勢以形成離子以及進行定量測定程序，測量結(jié)合的顆粒。
[0012]術(shù)語“溫育”不意在暗示除了允許樣品接觸結(jié)合部分以外的并且使分析物與適當?shù)慕Y(jié)合部分的結(jié)合發(fā)生的任何特定方法。
[0013]在一個實施方案中，第一結(jié)合部分和第二結(jié)合部分是各自對目的分析物的不同表位具有特異性的抗體。這可以有用地被稱為“夾心測定”。這種測定可以用于檢測和/或測量肌鈣蛋白I (tooponin I)( 一種心肌細胞死亡的標志物)、在妊娠測試中檢測和/或測量人絨膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin)、或檢測和/或測量促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone)用于監(jiān)測甲狀腺功能。
[0014]在某些實施方案中，第一結(jié)合部分或第二結(jié)合部分可以分別與分析物競爭結(jié)合第二結(jié)合部分或第一結(jié)合部分。例如，第一結(jié)合部分或第二結(jié)合部分可以與分析物基本上相同。此布置提供了競爭測定(或半抗原測定)并且在目的分析物僅具有單個表位的情況下是特別有用的。半抗原測定對于測試運動員的睪酮或皮質(zhì)醇水平，或?qū)τ跒榱藴y量女性能育性而測量雌二醇水平，可以是特別有用的。
[0015]第一結(jié)合部分和/或第二結(jié)合部分可以是抗體。
[0016]在一些實施方案中，分析物是抗體，且第一結(jié)合部分和/或第二結(jié)合部分可以是相應(yīng)的抗原。在分析物是抗體的情況下，第一結(jié)合部分或第二結(jié)合部分可以是另外的抗體，例如抗Ig抗體。這種測定可以稱作“血清學測定”，并通常可以用于測定對免疫或感染的抗體響應(yīng)。因此抗原可以是感染性因子(infectious agent)或其部分。
[0017]當然，抗體僅僅是結(jié)合部分的實例。結(jié)合部分，或者實際上，分析物，可以是任何合適的分子，如例如分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer)、DNA、RNA、單核苷酸多態(tài)性或模擬表位(mimotope)。
[0018]電活性材料可以是金屬，在此情況下，施加正電勢以形成金屬離子。在優(yōu)選的實施方案中，金屬可以是例如金、銀、銅或砷。在其他實施方案中，電活性材料可以是非金屬的。例如，電活性材料可以是pyrol、噻吩或咔唑，其中取決于所用的材料，可以測量負氧化還原過程或正氧化還原過程。
[0019]定量測定程序可以是伏安法，如陽極溶出伏安法(ASV)。
[0020]第二方面的優(yōu)選特征同樣適用于第一方面且反之亦然。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種用于在上述方法中使用的試劑盒，所述試劑盒包括:用于插入到檢測器單元中的樣品載體，所述樣品載體在位于緊接著所述檢測器單元的電極處的樣品載體的區(qū)域包括與其結(jié)合的結(jié)合部分；和被電活性材料覆蓋且包括結(jié)合部分的順磁性顆粒。
[0022]在一些實施方案中，順磁性顆?？梢栽O(shè)置在樣品載體中。
[0023]現(xiàn)在將僅通過實施例并參照附圖描述優(yōu)選的實施方案，在附圖中:
[0024]圖1是順磁性顆粒的一個實施方案的示意圖；
[0025]圖2是在樣品載體中的圖1的順磁性顆粒的示意圖；
[0026]圖3至5是圖示一個方法的一個實施方案的步驟的示意圖；
[0027]圖6和7是圖示一個方法的另外的實施方案的示意圖；且
[0028]圖8至11是圖示一個方法的另一個實施方案的示意圖。[0029]首先參照圖1，已經(jīng)使用常規(guī)方法，如化學還原沉積，用銀12覆蓋順磁性顆粒10。在被銀覆蓋的順磁性顆粒10的表面上，已經(jīng)結(jié)合有對目的分析物的第一表位具有特異性的抗體14。在下文中，將整個顆粒稱為被標記的順磁性綴合物16。
[0030]圖2圖示了樣品載體20、其內(nèi)表面的區(qū)域22已經(jīng)被對目的分析物的第二表位具有特異性的抗體24覆蓋。在樣品載體20中，例如，在惰性液體載體中，也設(shè)置圖1的被標記的順磁性綴合物16。
[0031]將用于目的分析物測試的樣品，例如唾液、血液或尿液的樣品，導(dǎo)入樣品載體20中。圖3圖示了在該樣品中存在抗原30的情況?？梢钥吹剑乖?0將結(jié)合設(shè)置在順磁性顆粒上的抗體14，并且也將結(jié)合設(shè)置在樣品載體20的內(nèi)表面上的第二抗體24。
[0032]在可以由技術(shù)人員根據(jù)被研究的特定抗原/抗體決定的必要的溫育期后，使用磁體40 (其可以例如是固體磁體或電磁體)施加磁場。在優(yōu)選的實施方案中，樣品載體20被插入包括必需的磁體40并且也包括電極42的檢測器單元中(見圖4)。在電極42處引入磁場，并因此將順磁性顆粒綴合物16吸引至電極42，在那里如果存在抗原30則發(fā)生“夾心(sandwich)”。
[0033]如圖5所示的，后續(xù)的磁場反轉(zhuǎn)導(dǎo)致未結(jié)合的被標記的順磁性綴合物16被從電極42除去，在電極42處僅留下結(jié)合的被標記的順磁性綴合物16。
[0034]隨后向電極42施加正電勢，以使結(jié)合在電極42處的被標記的順磁性綴合物16的銀金屬12電化學地轉(zhuǎn)變?yōu)殂y金屬離子。隨后可以使用例如陽極溶出伏安法(ASV)測量所得的金屬離子。將要理解的是，因為在電極處僅留下與抗原30結(jié)合的被標記的順磁性綴合物16，所以通過氧化產(chǎn)生的銀離子的測量與目的抗原30在原始樣品中的量直接相關(guān)。任何未與電極42處的第二抗體24結(jié)合的被標記的順磁性綴合物16被從電極42除去(在此實施方案中，通過將磁場反轉(zhuǎn))。因此，在這些被標記的順磁性綴合物16上的銀覆層12將不影響通過氧化生成的銀離子的量。
[0035]可以使用上述夾心測定，例如，通過測量肌鈣蛋白I的水平，作為對心肌細胞死亡的測試；通過測量人絨膜促性腺激素的水平，作為妊娠測試，或通過測量促甲狀腺激素的水平，作為對甲狀腺功能的測試。
[0036]上述實施方案存在許多優(yōu)點。
[0037]在銀12的氧化之前不需要包括洗滌步驟以從電極42除去未結(jié)合的被標記的順磁性綴合物16。這是因為通過使磁場反轉(zhuǎn)，而從電極42除去了未結(jié)合的被標記的順磁性綴合物16。
[0038]ASV提供對產(chǎn)生的銀離子的量的直接測量，產(chǎn)生的銀離子的量又直接正比于留在電極42處的被標記的順磁性綴合物16，留在電極42處的被標記的順磁性綴合物16又直接正比于在原始樣品中存在的抗原30的量。
[0039]圖6圖示了半抗原測定。此實施方案類似于圖2至5的實施方案，但代替被抗體覆蓋的是，被標記的順磁性綴合物16結(jié)合半抗原60，半抗原60是目的抗原的綴合形式，并且與抗原競爭結(jié)合抗體24。在這種情況下，在樣品中的任何抗原結(jié)合抗體24，并且阻止被半抗原標記的順磁性綴合物16的結(jié)合。因此，在這種情況下，通過ASV測得的金屬離子的水平將反比于樣品中抗原的量。
[0040]圖7圖示了非常類似于圖6中圖示的方法的方法。然而，作為一種變型，將半抗原60設(shè)置在電極附近放置的樣品載體20的區(qū)域22處，并且提供抗體14以形成被標記的順磁性綴合物16。在樣品中的任何抗原將結(jié)合抗體14，從而阻止被標記的順磁性綴合物16與半抗原60結(jié)合。再一次地，通過ASV測得的金屬離子的水平反比于在原始樣品中的抗原的量。
[0041]半抗原測定對于僅具有單個表位的抗原將是特別有用的，且因此可以例如用于對運動員進行睪酮或皮質(zhì)醇測試。
[0042]在進一步的實施方案中，提供血清學測定。在這種情況下，分析物是抗體，且該測定可以用于測量對感染或免疫的免疫學響應(yīng)。
[0043]如在圖8和9中所示，分析物30是特定的抗體，其能夠結(jié)合設(shè)置在鄰近電極放置的樣品載體20的區(qū)域22處的抗原24。在允許抗體30和抗原24之間的結(jié)合后，為了除去未結(jié)合的抗體90，進行洗滌步驟。
[0044]隨后，將被標記的順磁性綴合物16導(dǎo)入樣品載體20 (見圖10)。在此實例中，被標記的順磁性綴合物16綴合至結(jié)合目的抗體30的第二抗體14。第二抗體14可以因此是抗Ig抗體。在一種變型中，在血清學測定中使用的被標記的順磁性綴合物16可以與抗原24
一起提供。
[0045]如在圖11中所示，被標記的順磁性綴合物16結(jié)合鄰近電極放置的樣品載體20的區(qū)域22處的抗原24，并且能夠如上所述通過氧化以及之后的ASV測量。
[0046]想到的是，將樣品和被標記的順磁性綴合物16 —起混合在樣品載體20中，隨后將樣品載體20導(dǎo)入含有磁體40和電極42的檢測器單元，并且其時可進一步操作的以解釋并顯示測定結(jié)果。因而，各樣品載體20可以預(yù)裝入適合于特定的目的分析物的結(jié)合部分(例如，抗體，并且在一些實施方案中，是被標記的順磁性綴合物16自身)。各樣品載體20可因此意在用于單次使用，而更昂貴的電子設(shè)備在可重復(fù)使用的檢測器單元中被發(fā)現(xiàn)。在 申請人:較早的作為W02010/004244公布的PCT申請中公開的裝置可以容易地適用于進行在本申請中公開的方法。
[0047]技術(shù)人員將理解，上述描述提供了示例性的方法，并且可以對其進行許多變更。
[0048]圖示的抗體、抗原和半抗原的布置僅僅是示例性的。技術(shù)人員會知道，為了測試其他類型的分析物，如何使所述方法適用。
[0049]銀僅是合適的電活性材料的一個實例。雖然它因為容易被電化學氧化而形成銀離子而是優(yōu)選的，但其他電活性材料也可以是合適的。尤其是，金屬如金、銅或砷，以及非金屬如pyrol、噻吩或咔唑可以是合適的。
[0050]在一種變型中，可以通過使用被兩種不同的電活性材料例如金或銀覆蓋的被標記的順磁性綴合物，檢測在同一樣品中的兩種不同分析物。例如，被金覆蓋的順磁性顆粒可以附著至識別第一分析物的第一結(jié)合部分，且被銀覆蓋的順磁性顆?？梢愿街磷R別第二分析物的另一結(jié)合部分。當在同一電極上通過ASV測量時，金離子和銀離子給出不同的可區(qū)別的峰。
[0051]上述實施方案提供對目的分析物的簡單測定，其可以在單個室中進行，以允許未結(jié)合的被標記的順磁性綴合物與已經(jīng)結(jié)合至目標分析物的被標記的順磁性綴合物的分離。溫育、分離和測量因此可以全部發(fā)生在相同的室中，從而允許簡化的機械設(shè)備和電子設(shè)備。此外，與現(xiàn)有技術(shù)中所需的氧化劑和隔離劑不同，除了用在任何受控生物測定中的標準化學品(如樣品和PH緩沖劑)之外，不需要額外的化學試劑。
[0052]在聯(lián)合王國專利申請GBl118293.8中的以及在本申請所附摘要中的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。
【權(quán)利要求】
1.用于測定在樣品中的分析物(30)的存在或量的方法，所述方法包括以下步驟:提供被電活性材料(12)覆蓋且包括第一結(jié)合部分(14;60)的順磁性顆粒(10);提供在樣品載體(20)內(nèi)的第二結(jié)合部分(24 ；60);將被懷疑含有所述分析物的樣品與所述第一和第二結(jié)合部分溫育；施加磁場以將所述順磁性顆粒帶到電極(42);向所述電活性材料施加電勢以形成離子；以及進行定量測定程序以測定所述分析物的存在或量。
2.用于測定在樣品中的分析物(30)的存在或量的方法，所述方法包括以下步驟:用被電活性材料(12)覆蓋的順磁性顆粒(10)標記所述分析物；施加磁場以將所述被標記的分析物帶到電極(42);向所述被標記的分析物施加電勢以從所述電活性材料形成離子；以及進行定量測定程序以測定被金屬標記的分析物的存在或量。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述順磁性顆粒(10)包括第一結(jié)合部分(14)。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，所述被標記的分析物(30)結(jié)合至設(shè)置在緊接著所述電極(42)的樣品載體(20)的區(qū)域處的第二結(jié)合部分(24)。
5.如權(quán)利要求2、3或4所述的方法，其中所述順磁性顆粒(10)包括第一結(jié)合部分(14)，其中第二結(jié)合部分(24)設(shè)置在樣品載體(20)內(nèi)，且其中所述方法包括將被懷疑含有所述分析物(30)的樣品與所述第一和第二結(jié)合部分溫育的步驟。
6.如權(quán)利要求1或3至5中任一項所述的方法，其中，所述第一結(jié)合部分(14；60)和/或所述第二結(jié)合部分(24 ；60)是抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述第一結(jié)合部分(14)和所述第二結(jié)合部分(24)是各自對所述分析物(30)的不同表位具有特異性的抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述分析物是肌鈣蛋白I。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述分析物是人絨膜促性腺激素。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述分析物是促甲狀腺激素。
11.如權(quán)利要求1或5所述的方法，其中，所述第一結(jié)合部分(60)或所述第二結(jié)合部分(60)分別與所述分析物(30)競爭結(jié)合所述第二結(jié)合部分(24)或所述第一結(jié)合部分(14)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述第一結(jié)合部分(60)或所述第二結(jié)合部分(60)與所述分析物基本上相同。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中，所述分析物(30)僅具有單個表位。
14.如權(quán)利要求11、12或13所述的方法，其中，所述分析物(30)是睪酮。
15.如權(quán)利要求11、12或13所述的方法，其中，所述分析物(30)是皮質(zhì)醇。
16.如權(quán)利要求11、12或13所述的方法，其中，所述分析物(30)是雌二醇。
17.如權(quán)利要求1或3至16中任一項所述的方法，其中，所述分析物(30)是抗體且所述第一結(jié)合部分和/或所述第二結(jié)合部分是相應(yīng)的抗原(24 ；60)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述第一結(jié)合部分(14;60)或所述第二結(jié)合部分(24 ；60)是另外的抗體。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述第一結(jié)合部分(14)和/或所述第二結(jié)合部分(24)是抗Ig抗體。
20.如權(quán)利要求17至19中任一項所述的方法，其中，所述方法用于測定對免疫或感染的抗體響應(yīng)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，用于所述分析物抗體(30)的抗原是感染性因子或其部分。
22.如權(quán)利要求1至16中任一項所述的方法，其中，所述分析物(30)是分子印跡聚合物、DNA、RNA、單核苷酸多態(tài)性或模擬表位。
23.如權(quán)利要求1、3至5或11至22中任一項所述的方法，其中，所述第一結(jié)合部分(14 ；60)和/或所述第二結(jié)合部分(14 ；60)是分子印跡聚合物、DNA、RNA、單核苷酸多態(tài)性和/或模擬表位。
24.如在前權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，在進行所述定量測定程序之前，將磁場反轉(zhuǎn)。
25.如在前權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述電活性材料(12)是金屬，且施加正電勢以形成金屬離子。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述金屬(12)是金、銀、銅或砷。
27.如權(quán)利要求1至24中任一項所述的方法，其中，所述電活性材料(12)是非金屬的。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述電活性材料(12)是pyrol、噻吩或咔唑。
29.如在前權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述定量測定程序是伏安法。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述定量測定程序是陽極溶出伏安法(ASV)。
31.用于如 在前權(quán)利要求中任一項所述的方法的試劑盒，所述試劑盒包括:用于插入到檢測器單元中的樣品載體(20)，所述樣品載體在緊接著所述檢測器單元的電極(42)的所述樣品載體的區(qū)域(22)處包括與其結(jié)合的結(jié)合部分(24 ；60);和被電活性材料(12)覆蓋且包括結(jié)合部分(14 ；60)的順磁性顆粒(10)。
32.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中，所述順磁性顆粒(10)被設(shè)置在所述樣品載體(20)中。
【文檔編號】G01N33/553GK103890585SQ201280052281
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月24日
【發(fā)明者】羅伯特·安德魯·波特 申請人:英國政府商業(yè)創(chuàng)新與技能部