專利名稱：抗旱因子Lea-like蛋白一步法快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速檢測試劑盒。
技術(shù)背景來自于耐福射異常球菌Rl (D. radiodurans Rl)的與植物干旱抗性相關(guān)蛋白Lea-Iike屬于LEA3家族成員(Makarova, et al. , 2001),在眾多微生物中，是種子發(fā)育后期產(chǎn)生的一類小分子特異多肽，與植物耐脫水性密切相關(guān)，受干旱、高滲、ABA等調(diào)節(jié)。研究顯示Iea-Iike基因的表達(dá)能顯著提高大腸桿菌的干旱抗性。該基因?qū)胗筒撕?，明顯提高了油菜的抗干旱能力。將轉(zhuǎn)的油菜和非轉(zhuǎn)基因的油菜同時(shí)一次性澆足營養(yǎng)液后不再澆水，干旱處理4周后恢復(fù)澆水，轉(zhuǎn)Iea-Iike基因的油菜迅速恢復(fù)生長，葉片變綠；而非轉(zhuǎn)基因油菜葉片枯黃、萎蔫，不能正常生長。油菜葉片含水量的測定結(jié)果同樣證明轉(zhuǎn)入Iea-Iike基因的油菜具有抗旱性。在干早脅迫4周時(shí)，非轉(zhuǎn)基因油菜的葉片相對(duì)含水量降至35. 67%，而 轉(zhuǎn)基因油菜的葉片相對(duì)含水量為72. 98%,約為非轉(zhuǎn)基因油菜含水量的2. 05倍。目前，編碼Lea-Iike蛋白基因已轉(zhuǎn)入油菜、玉米等作物。在轉(zhuǎn)基因植物的研制開發(fā)或在對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行篩選或安全性評(píng)價(jià)時(shí)，往往需要對(duì)轉(zhuǎn)入的外源性基因進(jìn)行定性或半定量測定?，F(xiàn)有的檢測裝置，如酶免、放免等方法的裝置，受儀器(酶標(biāo)儀、放免閃爍儀、離心機(jī)等)、場地等因素的限制，而且檢測時(shí)間長，檢測成本較高，很難推廣應(yīng)用。中國專利ZL201020107248. 5提供了一種快速檢測耐鹽IrrE蛋白的試劑盒，將送檢物品的提取液用加樣器或滴管滴加在試劑盒的加樣孔中即可得到結(jié)果，雖然比起上述裝置操作簡便、快速。但試劑盒的包裝中還需要加樣器或滴管等加樣器械
實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是建立一種操作更加簡便、快速，不使用加樣器即可進(jìn)行快捷檢測轉(zhuǎn)基因成分的抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速檢測試劑盒。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是這樣的—種抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速檢測試劑盒，包括底板、具有觀測窗的上蓋，底板蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征是底板內(nèi)表面有測試帶，且測試帶的一端裸露出試劑盒一側(cè)。所述底板表面具有一條凹槽，所述凹槽可以嵌入所述測試帶的一端。觀測窗分為測試區(qū)(T)和質(zhì)控區(qū)(C)兩部分，可在上蓋上用字母C、T標(biāo)示出；所述測試帶形狀為長方形片狀，用于檢測Lea-1 ike蛋白。底板的厚度不限，底板的上表面設(shè)置一條可嵌入測試帶凹槽，凹槽可放置一條測試帶。所述底板或上蓋可具有卡槽，以保證底板與上蓋扣緊。當(dāng)?shù)装迳w入上蓋后，測試帶的一端仍裸露在外。主要優(yōu)點(diǎn)在于更方便快捷，無需加樣器械(如移液器、滴管等)測試時(shí)，可直接將測試帶浸入待檢樣品溶液中。所述觀測窗優(yōu)選是長方形。試劑盒的形狀是扁平的半啞鈴形盒。所述測試帶是一種具有檢測系統(tǒng)主體膜反應(yīng)體系功能的檢測材料，由高分子纖維膜、塑料等多層材料制成。測試帶分為質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)，質(zhì)控區(qū)可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗體；蛋白測試帶的樣品檢測區(qū)包被特異功能性Lea-Iike單克隆抗體或多克隆抗體。當(dāng)外源基因轉(zhuǎn)入植物，并在植物中表達(dá)，將產(chǎn)生目的蛋白Lea-like，因此通過檢測樣品中是否含有上述蛋白來確定該基因是否存在。如果外源基因轉(zhuǎn)入植物，發(fā)生基因沉默， 無目的蛋白產(chǎn)生，將不能達(dá)到預(yù)期目的。檢測時(shí)，只需將試劑盒梳狀裝置浸入送檢物品的提取液中，5sec內(nèi)取出試劑盒平放，3-5min后，肉眼就可以通過觀測窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。檢測結(jié)果直觀不借助任何儀器，用肉眼可觀察到結(jié)果.應(yīng)用廣泛可檢測玉米、油菜、棉花、水稻、小麥、煙草、大豆等各類農(nóng)作物的葉片、種子及加工產(chǎn)品。由于本實(shí)用新型提供的抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速檢測試劑盒檢測快速，特別適用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研制開發(fā)和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速篩選，可用于實(shí)驗(yàn)室、田間、邊防、海關(guān)植物檢驗(yàn)、檢驗(yàn)檢疫局、食品安全檢測及種子經(jīng)營銷售等部門對(duì)可疑樣本現(xiàn)場、快速篩查。
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，進(jìn)一步舉例說明本實(shí)用新型的技術(shù)內(nèi)容。

圖I和圖2是本實(shí)用新型一種聯(lián)檢試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖I是底板的俯視圖，底板有一條測試帶，且測試帶的一端裸露出試劑盒一側(cè)；圖2是試劑盒上蓋的俯視圖，上蓋有一個(gè)觀測窗；圖中，I是測試帶，2是觀測窗。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I檢測試劑盒的制備(一 )制備測試帶I. Lea-Iike單抗腹水的制備小鼠腹腔注射液體石蠟O. 5mL。I周后，將Lea-Iike單抗雜交瘤細(xì)胞注射于以上預(yù)先處理過的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞I 3 X 106。10天后收獲腹水，以上過程皆在無菌條件下完成。2. Lea-Iike單克隆抗體的純化I)以DEAE離子交換層析及S印hacryl S-300分子篩對(duì)單抗進(jìn)行純化；SDS_PAGE平板電泳檢測純化單抗的純度；ELISA法測定單抗活性；2)純化過程取小鼠單抗腹水一3，OOOXg離心15min —上清液加50%硫酸銨沉淀，過夜一3，OOOXg離心20min —沉淀溶于O. OlM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2) — S-300凝膠柱一DEAE Blue層析柱一0-800mM NaCl梯度洗脫一超濾離心，濃縮單抗；3)單抗純度測定常規(guī)SDS-PAGE電泳，上述方法所純化的單抗的純度皆在95%以上；4)蛋白濃度測定紫外分光光度計(jì)測定279nm處的O. D.值，按以下公式計(jì)算蛋白含量0D279/1.4 = mg/mL(純化單抗)。將單抗?jié)舛日{(diào)節(jié)為約lmg/mL ；5)單抗活性測定選用Lea-Iike抗原包被ELISA板(I μ g/孔)， 及羊抗鼠IgG-HRP復(fù)合物，測定各單抗效價(jià)(大于I : 5000)。3.羊抗DOAT高效價(jià)免疫抗血清的制備和純化I)純化好的上述單抗+完全佐劑一免疫山羊一加強(qiáng)免疫2次，每次間隔一月一第二次加強(qiáng)后10天左右取血一離心取血清一硫酸銨沉淀一DEAE離子交換層析純化；2)效價(jià)測定ELISA夾心法，抗體效價(jià)稀釋度應(yīng)大于I : 256;3)蛋白濃度測定紫外分光法測定OD279,計(jì)算蛋白濃度。4.膠體金及金標(biāo)抗體制備I)膠體金的制備以檸檬酸鹽還原法制備40_60nm的膠體金。將O. 01 % HauCl4加熱至沸，加入一定量的I %檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)，繼續(xù)加熱煮沸5min，待膠體金溶液顏色由蘭一紫一紅，穩(wěn)定后，冷卻即可。膠體金溶液應(yīng)清亮透明，如需長期保存，可加入O. 02% NaN3。2)將膠體金液500mL用O. IM NaOH調(diào)pH 8. 4，磁力攪拌下緩慢加入單抗2mL，攪拌20min。5，500Xg離心30min,除去上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心后吸取膠體金標(biāo)記抗體沉淀，沉淀溶于IOmL保存液中，用O. 45 μ m微孔濾膜過濾。取樣進(jìn)行檢定，其余置4°C保存。5.膜反應(yīng)體系Ml的制備I)將Lea-Iike抗體及純化的羊抗鼠IgG以O(shè). IM磷酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為約O. 2_2mg/mL02)純化的羊抗鼠IgG溶于O. IM磷酸鹽緩沖液中，濃度為2. Omg/mL ；3)硝酸纖維素膜大小10cmX 27cm，每張膜可噴長25cm的檢測及控制帶各4條；4)將以上兩種溶液分別加入Biodot XYZ3000噴涂機(jī)的二個(gè)噴頭儲(chǔ)存瓶中；5)設(shè)置噴速為2 μ L/cm,NC膜的移行速度為50mm/s。以單抗Lea-like AD2 (2mg/mL)在NC膜上包被反應(yīng)檢測線，以I. Omg/mL兔抗鼠IgG包被反應(yīng)對(duì)照線，對(duì)照線與檢測線的距離為4-4. 5mm ；6)完成包被后，置37°C干燥箱24h，用BB封閉液封閉處理半小時(shí)，用WB洗液抽洗I次；7) 37 °C干燥箱干燥備用；8)切制備好的硝酸纖維素膜1. 8cmX27cm/條，放入鋁薄袋中密封干燥保存。置
室溫保存?zhèn)溆谩?.膜反應(yīng)體系M2a、M2b及M3的制備 將吸水纖維膜分別浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，裝入塑料袋中，
室溫保存。l)M2a制備將制好的玻璃纖維切27cmX I. 2cm/條；2)M2b制備將制好的玻璃纖維切27cmX I. 8cm/條；[0054]3)M3制備將制好的玻璃纖維切27cmX I. 2cm/條。7.膜反應(yīng)體系M4的制備I)取膠體金-單抗復(fù)合物加稀釋液，混勻配成工作濃度；2)將溶液加入噴涂機(jī)Biodot的Airjet噴頭儲(chǔ)存瓶中；3)設(shè)定壓力為15PSI，玻璃纖維膜的移動(dòng)速度為50mm/s ；4)噴制規(guī)格為O. 5-1. 5cmX 25cm/條，每條噴2遍；5)于37°C烘干12h，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，室溫保存。8.反應(yīng)體組裝I)在M6塑料基板上貼雙面膠帶M7 二條；2)在M7中間貼反應(yīng)膜Ml (18mm)，離M6上緣約22_ ；3)在M7上貼M5 (22mm)，與M6上緣對(duì)齊并與Ml上緣交1_ ;4)在M7上貼M2a(12mm)，與Ml下緣相接；5)在 M2 上貼 M4 (IOmm)，壓住 Ml 下緣 O. 5mm ;6)在 M7 上貼 M3 (12mm),上緣壓住 M4 約 2/3 ；7)在M7上貼M2b (18mm)，上緣壓住M4約2/3，下緣與M7的下緣對(duì)齊；8)在M4和M7上貼透明保護(hù)膠帶M8，上緣完全壓住M4，并壓住Ml約I. 5mm ;9)在M5上貼彩色標(biāo)記膠帶M9，與Ml上緣交1mm，另一端翻過M6上緣，貼于M6被面；10)將組裝成型的反應(yīng)體用全自動(dòng)切條機(jī)切成3. 5mm規(guī)格。( 二)裝配試劑盒將制備好的檢測Lea-Iike蛋白的測試帶嵌入底板的凹槽中，然后將上蓋與底板扣緊，使測試帶從試劑盒一端裸露出盒外。即完成試劑盒。實(shí)施例2試劑盒使用過程(一 )檢測樣本處理及準(zhǔn)備植物種子、葉子、籽苗等樣本在檢測前需經(jīng)研磨，并以蒸餾水抽提和稀釋。為獲得最佳檢測效果，各不同樣品應(yīng)根據(jù)下表中的比例稀釋，在完成研磨和稀釋后，將樣本混勻，靜置，取上清液作為檢測樣品。
葉子及籽苗種子
植物種類
__葉子/蒸懼水(g/mL)__種子/蒸懼水(g/mL)
玉米__I 20__I 2_
油菜__I 10__I 4_
其余雙子葉植物__I 10__I 4_
其余單子葉植物_I 20__I 2_( 二)檢測及結(jié)果將試劑盒梳狀裝置浸入送檢植物樣品的提取液中，5sec內(nèi)取出試劑盒平放，吸水材料使待檢樣品緩慢移動(dòng)，膜反應(yīng)體系被啟動(dòng)。3-5min后，肉眼就可以通過觀測窗直接觀察到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。無論待測基因是否存在于植物樣品中，一條紫紅色條帶都會(huì)出現(xiàn)在質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)。質(zhì)控區(qū)內(nèi)(C)所顯現(xiàn)的紫紅色條帶是判定是否有足夠的植物樣品液，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。(三)結(jié)果判定觀測窗檢測待檢基因是否存在。I)若待測植物樣本中不含特定Lea-Iike蛋白，或其濃度低于檢測靈敏度，膠體金抗體在層析過程中不會(huì)被固定在膜上檢測帶內(nèi)的單抗免疫，因而測試區(qū)內(nèi)(T)不會(huì)出現(xiàn)一條紫紅色檢測帶，顯示陰性(-)結(jié)果，即僅在質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。2)若待測植物樣本中Lea-Iike蛋白濃度高于其檢測閾值時(shí)，抗原免疫金與檢測帶上的另一單抗結(jié)合，在測試區(qū)內(nèi)(T)還將出現(xiàn)另一紫紅色檢測帶，顯示陽性(+)結(jié)果，即 在質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)內(nèi)各出現(xiàn)一條紫紅色條帶。注意測試區(qū)(T)內(nèi)的紫紅色條帶可顯現(xiàn)出顏色深淺的現(xiàn)象。但是，在規(guī)定的觀察時(shí)間內(nèi)，不論該色帶顏色深淺，都應(yīng)判定為陽性結(jié)果。3)若試劑盒質(zhì)控區(qū)(C)未出現(xiàn)紫紅色條帶，則檢測結(jié)果無效，表明不正確的操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。
權(quán)利要求1.一種抗旱因子Lea-Iike蛋白一步法快速檢測試劑盒，包括底板、具有一個(gè)觀測窗的上蓋，所述底板蓋入上蓋后組成試劑盒，底板內(nèi)表面有測試帶，且底板表面具有一條凹槽，其特征是試劑盒的形狀是扁平的半啞鈴形盒；所述凹槽嵌入所述測試帶的一端；觀測窗分為測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)兩部分，在上蓋上用字母C、T標(biāo)示出；所述測試帶形狀為長方形片狀；當(dāng)?shù)装迳w入上蓋后，測試帶的一端仍裸露在外。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測試劑盒，其特征是所述盒體或上蓋具有卡槽。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種抗旱因子Lea-like蛋白一步法快速檢測試劑盒，包括底板、具有觀測窗的上蓋，底板蓋入上蓋后組成試劑盒，其特征是底板內(nèi)表面有測試帶，且測試帶的一端裸露出試劑盒一側(cè)。本試劑盒操作簡便，不需要加樣器械，檢測樣品時(shí)，直接將試劑盒一端浸入送檢樣品的提取液中，5秒內(nèi)取出平放，3-5分鐘后就可以通過肉眼直接觀察到檢測結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/68GK202676706SQ20122007437
公開日2013年1月16日 申請日期2012年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月1日
發(fā)明者張維, 江世杰, 陳明, 林敏 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所