專利名稱：氨基酸分析用多功能前處理設(shè)備及前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸分析用前處理設(shè)備，以及利用這種設(shè)備對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行氨 基酸分析的前處理方法。
背景技術(shù)：
氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是生物、醫(yī)藥、衛(wèi)生、農(nóng)牧業(yè)、食品、飲料及飼料 等行業(yè)生產(chǎn)和科研中必須的分析測(cè)試項(xiàng)目。
目前，氨基酸分析方法主要有化學(xué)分析法、電化學(xué)方法、分光光度法、高效液相色 譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法等，其中高效液相色譜法(HPLC)是使用最為普遍的方法之 一。高效液相色譜法包括離子交換和反相兩種模式。離子交換使用儀器為氨基酸分析儀， 成本高、專屬性強(qiáng)、普及率低。反相模式使用通用型高效液相色譜梯度系統(tǒng)，成本低、普適性 強(qiáng)、一機(jī)多用。
采用反相液相色譜分析氨基酸，一般需要將樣品中蛋白質(zhì)水解成為氨基酸，傳統(tǒng) 的水解方式為酸水解法，也是目前使用最廣泛的方法。
氨基酸在HPLC分析前，需要大量的前處理工作。前處理過程的重復(fù)性和準(zhǔn)確性， 是最終氨基酸分析結(jié)果準(zhǔn)確性的首要決定因素。氨基酸分析前處理過程使用的前處理設(shè)備 包括烘箱、氮吹議、恒溫水浴裝置等。前處理設(shè)備過多會(huì)使操作過程繁瑣，影響方法穩(wěn)定性 和準(zhǔn)確性，同時(shí)造成成本的提高。目前只有Waters公司推出PICO. TAGTM水解裝置，可用于 苯異硫氰酸酯(PITC)衍生氨基酸分析方法的酸水解和衍生過程。雖然該裝置具有操作方 便，安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，但成本非常高。
同時(shí)由于大部分氨基酸沒有紫外吸收或熒光響應(yīng)，無法直接進(jìn)行高效液相色譜分 析，因此需要進(jìn)行衍生，引入有紫外吸收或熒光響應(yīng)的基團(tuán)。PITC是目前最具吸引力的氨 基酸衍生試劑之一，它可以同時(shí)與一級(jí)和二級(jí)氨反應(yīng)，且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，方法靈敏度高。但 過量的衍生試劑會(huì)影響色譜柱壽命，因此進(jìn)樣前需盡量去除過量的衍生試劑。目前最常 用的方法是正己烷萃取法，該方法操作簡(jiǎn)便，但PITC與氨基酸的衍生反應(yīng)在堿性條件下 (pH=9. O)進(jìn)行，衍生后樣品呈堿性，直接進(jìn)樣分析會(huì)影響色譜峰型，因此還需要將樣品稀釋2-4倍，而樣品的稀釋過程會(huì)導(dǎo)致方法敏度降低?！饵S酒中氨基酸測(cè)定方法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)征求 意見稿中采用加入一定體積的10%乙酸水溶液調(diào)節(jié)樣品pH值，但該方法不穩(wěn)定，當(dāng)乙酸放 置時(shí)間過長(zhǎng)，濃度發(fā)生微小變化時(shí)，樣品pH值相應(yīng)改變，會(huì)嚴(yán)重影響色譜峰型，出現(xiàn)峰分叉 現(xiàn)象。
綜上所述，現(xiàn)階段氨基酸分析的前處理步驟較為繁瑣，操作復(fù)雜，需要應(yīng)用較多的 設(shè)備進(jìn)行操作，并且其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性都有待提高。因此現(xiàn)在需要一種能夠解決上述問題 的新處理方法以及相應(yīng)的處理設(shè)備。
本發(fā)明裝置集多種前處理功能于一體，具備氨基酸分析全部前處理功能，且安全 可靠、成本低，操作方便，適合推廣，同時(shí)能夠提供更佳的方法穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性以及靈敏度。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種集多種前處理功能于一體，具備氨基酸分析全部前處理功能的設(shè)備，同時(shí)還提出一種氨基酸前處理的方法，該方法安全可靠、成本低，操作方便，適合推廣，同時(shí)這種方法還具備較高的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和靈敏度。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種氨基酸分析用多功能前處理設(shè)備，其特征在于 所述的處理設(shè)備包括透明的箱體1，箱體I的上部設(shè)置有可開啟的上蓋2，上蓋2與箱體I 之間設(shè)置有密封墊3，在箱體I內(nèi)設(shè)置有樣品架4，在箱體I內(nèi)還設(shè)置有加熱管5和測(cè)溫管 6，加熱管5通過設(shè)置在箱體I外部的溫控表7進(jìn)行控制，在上蓋2上設(shè)置有帶有流速調(diào)節(jié)閥9的氮吹管8，氮吹管8可以相對(duì)于上蓋2縱向移動(dòng)并固定，在上蓋2上還設(shè)置有抽真空管10。
所述的氮吹管8為多個(gè)，并且均勻分布在上蓋2上，所有的氮吹管8的入口都與設(shè)置在上蓋2上的多通11連接，多通11的通道數(shù)量與氮吹管8的數(shù)量相配。
一種利用如權(quán)利要求1所述的氨基酸分析用多功能前處理設(shè)備對(duì)氨基酸進(jìn)行分析前處理的方法，該方法包括酸水解、除酸、樣品衍生化和干燥四個(gè)步驟，其特征在于所述的酸水解步驟為將需分析樣品放入安瓿瓶，并向安瓿瓶中加入過量的6mol/L的鹽酸，配制成樣品溶液，安瓿瓶高溫拉絲封口后，放入樣品架4上，開啟加熱管5，對(duì)樣品溶液在110±3°〇的條件下水解2411，所述的除酸步驟為安瓿瓶自然冷卻至室溫后，將其封口開啟，利用上蓋2上的抽真空管10對(duì)箱體I內(nèi)腔抽真空，同時(shí)通過氮吹管8向樣品架4上安瓿瓶中的樣品溶液進(jìn)行氮吹， 直至吹干，然后將安瓿瓶取出，用水充分洗滌安瓿瓶，合并洗滌液，在容量瓶中定容，定容體積至多為25mL,所述的樣品衍生化步驟為利用針筒式濾膜對(duì)容量瓶中的樣品溶液進(jìn)行過濾，將過濾后的樣品溶液放置在離心管中，加入lmol/L的三乙胺乙腈溶液和O. 2mol/L的異硫氰酸苯酯乙腈溶液，且樣品溶液與三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液的體積比為2:1: 1，渦旋混勻，將離心管放入樣品架4，開啟加熱管5，對(duì)樣品混合溶液在30土 1°C的條件下衍生 Ih,所述的干燥步驟為利用上蓋2上的抽真空管10對(duì)箱體I內(nèi)腔抽真空，同時(shí)通過氮吹管8向樣品架4上離心管中的樣品溶液進(jìn)行氮吹至干，向離心管中加入100-400 μ L、O.05mol/L的乙酸鈉水溶液，渦旋混勻。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具 有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所提出的氨基酸前處理設(shè)備，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)巧妙，集多種前處理功能于一體，基本上具備了氨基酸分析的全部前處理功能，操作起來方便快捷，并且這種設(shè)備的制作工藝簡(jiǎn)單，制造成本低廉，可以說具備了多種優(yōu)點(diǎn)，特別適合于在本領(lǐng)域中推廣應(yīng)用，其市場(chǎng)前景十分廣闊。而本發(fā)明所提出的氨基酸前處理方法，與傳統(tǒng)的方法相比，具備較為優(yōu)異的重復(fù)性，其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性都較高，同時(shí)還有較好的靈敏度。


圖1為本發(fā)明多功能前處理設(shè)備的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
下面將說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。
如圖1所示，一種氨基酸分析用多功能前處理設(shè)備，它包括一個(gè)透明的箱體1，箱體I最好采用耐高溫玻璃制作；在箱體I的上部設(shè)置有可開啟和關(guān)閉的上蓋2，為了保證箱體I關(guān)閉狀態(tài)下的密閉性，在上蓋2與箱體I之間還設(shè)置有密封墊3 ;在箱體I內(nèi)部設(shè)置有樣品架4，根據(jù)所需放置的樣品瓶的規(guī)格不同，樣品架4可以為與樣品瓶相配的結(jié)構(gòu)或樣式；在箱體I內(nèi)還設(shè)置有加熱管5和測(cè)溫管6，而加熱管5通過設(shè)置在箱體I外部的溫控表 7進(jìn)行控制；在上蓋2上設(shè)置有帶有流速調(diào)節(jié)閥9的氮吹管8，氮吹管8可以相對(duì)于上蓋2 縱向移動(dòng)并固定，為了方便氮吹步驟，氮吹管8可以為多個(gè)，并且均勻地分布在上蓋2上，所有的氮吹管8的入口都與設(shè)置在上蓋2上部的多通11相連，而這個(gè)多通11的通道數(shù)量則與氮吹管8的數(shù)量相配；在上蓋2上還設(shè)置有抽真空管10。
本發(fā)明所用的儀器設(shè)備與試劑。
UV1201紫外-可見檢測(cè)器，P1201高壓恒流泵，AS1201自動(dòng)進(jìn)樣器，EliteAAP色譜柱，EC2006色譜工作站(以上均為大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品)，漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，QL-861)等。
氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA ALDRICH)，異硫氰酸苯酯(PITC，純度> 98%，百靈威科技有限公司)，無水乙酸鈉，冰醋酸，三乙胺，鹽酸、乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，去離子水等(除特別標(biāo)注外，其它均為分析純)。
主要試劑及配制方法O.2mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液移取O. 24 mL異硫氰酸苯酯至IOmL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。
l.Omol/L三乙胺乙腈溶液移取1.45 mL三乙胺至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液AminoAcid Standard, SIGMA ALDRICH, AAS-18-10 X ImL, 2. 5 μ mol/ mL。
標(biāo)準(zhǔn)工作液準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液ImL至10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容。
一種氨基酸進(jìn)行分析前處理的方法，該方法包括酸水解、除酸、樣品衍生化和干燥四個(gè)步驟，其特征在于所述的酸水解步驟為將需分析樣品放入安瓿瓶，(如需分析樣品為固態(tài)，需要先用粉碎設(shè)備將其粉碎)，并向安瓿瓶中加入過量的6mol/L的鹽酸，配制成樣品溶液，將裝有樣品溶液的安瓿瓶高溫拉絲封口后，放入樣品架4上，開啟加熱管5，而測(cè)溫管6檢測(cè)箱體I內(nèi)油的溫度，并將溫度值反饋給溫控表7，溫控表7根據(jù)箱體I內(nèi)的油溫對(duì)加熱管5進(jìn)行控制，保持油溫在110±3°C，讓樣品溶液在該溫度條件下水解24h ；所述的除酸步驟為水解工作完成后，讓安瓿瓶和其內(nèi)的樣品溶液自然冷卻至室溫，并將安瓿瓶的封口開啟，關(guān)閉上蓋2，利用上蓋2上的抽真空管10對(duì)箱體I內(nèi)腔抽真空，調(diào)節(jié)氮吹管8的高度，使其與安瓿瓶中的液面高度相適應(yīng)，并向多通11內(nèi)填充氮?dú)?，氮?dú)馔ㄟ^多通11和氮 吹管8后進(jìn)入箱體1，對(duì)安瓿瓶中的樣品溶液進(jìn)行氮吹，直至吹干，然后將安瓿瓶取出，用水充分洗滌安瓿瓶，合并洗滌液，在容量瓶中定容，定容體積不超過25mL ；所述的樣品衍生化步驟為利用針筒式濾膜對(duì)容量瓶中的樣品溶液進(jìn)行過濾，濾除混合溶液中的固態(tài)物質(zhì)，將過濾后的樣品溶液放置在離心管中，加入lmol/L的三乙胺乙腈溶液和O. 2mol/L的異硫氰酸苯酯乙腈溶液，保證樣品溶液與三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液的體積比為2:1: 1，渦旋混勻，將離心管放入樣品架4，開啟加熱管5，對(duì)樣品混合溶液在30 ± I °C的條件下衍生Ih ；所述的干燥步驟為利用上蓋2上的抽真空管10對(duì)箱體I內(nèi)腔抽真空，同時(shí)仍然通過多通11和氮吹管8向樣品架4上離心管中的樣品溶液進(jìn)行氮吹至干，向離心管中加入一定量的O. 05mol/L乙酸鈉水溶液(體積為100-400 μ L)，渦旋混勻?？筛鶕?jù)實(shí)際樣品氨基酸含量減小定容體積，最小可減至ΙΟΟμ 。然后取10 μ L的待測(cè)樣品溶液進(jìn)行高效液相色譜 (HPLC)分析。
HPLC分析色譜條件流動(dòng)相A :0. 05 mol/L乙酸鈉(冰醋酸調(diào)節(jié)pH=6. 5±0. 05)流動(dòng)相B :乙腈:甲醇水=60:20:20 色譜柱Elite AAP, 5 μ m, 4. 6 X 150mm 檢測(cè)波長(zhǎng)254nm 流速1. OmL/min 柱溫42 °C 梯度條件
權(quán)利要求
1.一種氨基酸分析用多功能前處理設(shè)備，其特征在于所述的處理設(shè)備包括透明的箱體(1)，箱體(I)的上部設(shè)置有可開啟的上蓋(2)，上蓋(2)與箱體(I)之間設(shè)置有密封墊(3)，在箱體(I)內(nèi)設(shè)置有樣品架(4)，在箱體(I)內(nèi)還設(shè)置有加熱管(5)和測(cè)溫管(6)，加熱管(5 )通過設(shè)置在箱體(I)外部的溫控表(7 )進(jìn)行控制，在上蓋(2 )上設(shè)置有帶有流速調(diào)節(jié)閥(9)的氮吹管(8)，氮吹管(8)可以相對(duì)于上蓋(2)縱向移動(dòng)并固定，在上蓋(2)上還設(shè)置有抽真空管(10)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基酸分析用多功能前處理設(shè)備，其特征在于所述的氮吹管(8)為多個(gè)，并且均勻分布在上蓋(2)上，所有的氮吹管(8)的入口都與設(shè)置在上蓋(2) 上的多通(11)連接，多通(11)的通道數(shù)量與氮吹管(8)的數(shù)量相配。
3.一種利用如權(quán)利要求1所述的氨基酸分析用多功能前處理設(shè)備對(duì)氨基酸進(jìn)行分析前處理的方法，該方法包括酸水解、除酸、樣品衍生化和干燥四個(gè)步驟，其特征在于所述的酸水解步驟為將需分析樣品放入安瓿瓶，并向安瓿瓶中加入過量的6mol/L的鹽酸，配制成樣品溶液，安瓿瓶高溫拉絲封口后，放入樣品架(4)上，開啟加熱管(5)，對(duì)樣品溶液在110±3°C的條件下水解24h，所述的除酸步驟為安瓿瓶自然冷卻至室溫后，將其封口開啟，利用上蓋(2)上的抽真空管(10)對(duì)箱體(I)內(nèi)腔抽真空，同時(shí)通過氮吹管(8)向樣品架(4)上安瓿瓶中的樣品溶液進(jìn)行氮吹，直至吹干，然后將安瓶瓶取出，用水充分洗漆安瓶瓶，合并洗漆液，在容量瓶中定容，定容體積至多為25mL,所述的樣品衍生化步驟為利用針筒式濾膜對(duì)容量瓶中的樣品溶液進(jìn)行過濾，將過濾后的樣品溶液放置在離心管中，加入lmol/L的三乙胺乙腈溶液和O. 2mol/L的異硫氰酸苯酯乙腈溶液，且樣品溶液與三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液的體積比為2:1: 1，渦旋混勻，將離心管放入樣品架(4)，開啟加熱管(5)，對(duì)樣品混合溶液在30± 1°C的條件下衍生Ih,所述的干燥步驟為利用上蓋(2)上的抽真空管(10)對(duì)箱體(I)內(nèi)腔抽真空，同時(shí)通過氮吹管(8)向樣品架(4)上離心管中的樣品溶液進(jìn)行氮吹至干，向離心管中加入 100-400 μ L、0· 05mol/L的乙酸鈉水溶液，渦旋混勻。
全文摘要
本發(fā)明公開一種氨基酸分析用多功能前處理設(shè)備，以及應(yīng)用這種前處理設(shè)備的一種前處理方法。這種氨基酸前處理設(shè)備，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)巧妙，集多種前處理功能于一體，基本上具備了氨基酸分析的全部前處理功能，操作起來方便快捷，并且這種設(shè)備的制作工藝簡(jiǎn)單，制造成本低廉，可以說具備了多種優(yōu)點(diǎn)，特別適合于在本領(lǐng)域中推廣應(yīng)用，其市場(chǎng)前景十分廣闊。而本發(fā)明所提出的氨基酸前處理方法，與傳統(tǒng)的方法相比，具備較為優(yōu)異的重復(fù)性，其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性都較高，同時(shí)還有較好的靈敏度。
文檔編號(hào)G01N30/06GK103063785SQ20121057740
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者于淑新, 唐濤, 董禮孚, 張彥彬, 孫元社, 李彤 申請(qǐng)人:大連依利特分析儀器有限公司