專利名稱：鰻魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物檢測(cè)的前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及鰻魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物檢測(cè)的前處理方法。
背景技術(shù)：
孔雀石綠(Malachite green)、結(jié)晶紫(Crystal violet)是一類合成的三苯基甲烷類工業(yè)染料，自上世紀(jì)30年代作為一種體外驅(qū)蟲劑，殺真菌劑和消毒劑被廣泛的用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)。特別是治療魚的增值性腎病(PKD)非常有效。當(dāng)孔雀石綠和結(jié)晶紫被魚體吸收后，它們主要分別代謝為無色孔雀石綠和無色結(jié)晶紫，并沉積在脂肪組織中。由于動(dòng)物試驗(yàn)證明孔雀石綠和結(jié)晶紫對(duì)人畜有潛在的致畸、致癌和致突變作用，因而歐盟、美國食品和藥物管理局(FDA)等宣布禁止其在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中使用。加拿大在1992年發(fā)現(xiàn)人類若進(jìn)食含孔雀石綠的魚類，會(huì)對(duì)健康構(gòu)成重大影響，主要是孔雀石綠中的三苯甲烷基團(tuán)可引致肝癌。不過，基于孔雀石綠、結(jié)晶紫低廉的生產(chǎn)成本及容易使用，不少監(jiān)管較弱的國家依然在使用中。例如在中國仍有漁民在防治魚類感染真菌時(shí)使用，也有運(yùn)輸商用作消毒，以延長魚類在長途販運(yùn)中的存活時(shí)間。由于易獲得，低成本，高效性，雖然因其高毒性、高殘留和致畸、致癌、致突變等作用已被國內(nèi)外許多國家列為“不得檢出”的禁用藥物。根據(jù)歐盟法案2004/25/EC規(guī)定對(duì)其提出的檢測(cè)限要求是2mg/kg;日本的肯定列表也明確規(guī)定在進(jìn)口產(chǎn)品中不得檢出孔雀石綠殘留。2005年，國家標(biāo)準(zhǔn)委將“水產(chǎn)品中孔雀石綠結(jié)晶紫及其代謝物殘留量檢驗(yàn)方法”立項(xiàng)，該標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物隱色結(jié)晶紫，規(guī)定檢出限為O. 5mg/kg。鑒于上述原因，有必要研究掌握孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物的有效檢測(cè)方法，達(dá)到有效監(jiān)控其在水產(chǎn)品中殘留，減少對(duì)人類健康的危害?，F(xiàn)階段對(duì)于孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物的檢測(cè)方法多樣，但都包含了樣品前處理過程。前處理方法多為使用有機(jī)溶劑多次萃取，之后使用層析柱或者具有吸附性填料的柱子進(jìn)行清洗。此類前處理技術(shù)的關(guān)鍵缺點(diǎn)是提取效率低、反復(fù)萃取損失大、處理過程耗時(shí)較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、耗時(shí)短的鰻魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物檢測(cè)的前處理方法，經(jīng)該方法處理后的待測(cè)樣品能夠直接用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物檢測(cè)的前處理方法包括以下步驟
(I)準(zhǔn)確稱取樣品5. 00 g，精確至O. Olg，置于50 mL離心管中，加入乙腈有機(jī)混合溶劑，用高速分散均質(zhì)機(jī)將樣品打散，再加入4. O g的堿性氧化鋁粉末，振蕩lmin，4500rpm/min離心IOmin ;所述乙腈有機(jī)混合溶劑的配制為20mL乙腈+20mL冰乙酸；(2)取IOmL上清液，以15mL高純水稀釋備用，制備成25mL樣品液；
(3)C18固相萃取柱的活化過程
a.2mL含2%冰醋酸的乙腈淋洗；
b.5mL含20%冰醋酸的甲醇雜；
c.5mL蒸餾水平衡；
(4)將步驟(2)中25mL樣品液過柱，抽真空，5mL20%乙腈溶液淋洗，棄去全部淋洗液；
(5)再用2mL含2%冰醋酸的乙腈洗脫，收集洗脫液，加入O. 01mol/L乙酸銨溶液，定容至2. 5mL ；
(6)定容液用O.22 μ m微孔濾膜過濾，所得濾液即可上機(jī)測(cè)試。 所述孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物包括顯色孔雀石綠、隱色孔雀石綠、顯色結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫。本發(fā)明的前處理方法與現(xiàn)有國標(biāo)方法GB/T 20361-2006相比，具有操作簡單有效、耗時(shí)短、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，具有很強(qiáng)的可操作性。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)為
1)目前報(bào)導(dǎo)的大部分孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物檢測(cè)提取方法是針對(duì)動(dòng)物源性食品設(shè)計(jì)，而本方法是針對(duì)鰻魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留檢測(cè)的一種提取方法；
2)國標(biāo)方法需要用有機(jī)混合緩沖溶液來提取孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物，而在本發(fā)明中我們直接用乙酸-乙腈提取，使孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物能夠得到充分的提取，從而能夠有效地檢測(cè)孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物；
3)目前報(bào)道的大部分固相萃取方法均采用多根萃取柱串聯(lián)的方法將孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物從基質(zhì)中分離出來，而本方法采用一根萃取柱直接萃取，從而簡化了分離步驟，節(jié)省了分析時(shí)間；
4)國標(biāo)方法采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或者氮?dú)獯蹈傻姆椒ㄟM(jìn)行濃縮富集，耗時(shí)較長，而本方法采用固相萃取的方法可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)，耗時(shí)少，操作方便，有機(jī)提取劑用量少。
具體實(shí)施例方式按照本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容實(shí)施本發(fā)明，所需試劑溶液的配制方法如下10mmol/L乙酸銨溶液0. 385g乙酸銨溶于500 mL去離子水中，超聲脫氣；乙腈溶液(V/V) :200 mL乙腈與800 mL水混勻；冰醋酸+甲醇(2+8) (V/V) 200mL的冰醋酸與800mL甲醇混勻，超聲脫氣；2%的冰醋酸/乙腈20mL的冰醋酸與980mL的乙腈混勻，超聲脫氣；標(biāo)準(zhǔn)工作液標(biāo)準(zhǔn)工作液取1. O μ g/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液1.0 mL用乙腈稀釋至10 mL,得到O.1 μ g/mL工作液；定量曲線用乙腈配制定量曲線標(biāo)液，各個(gè)組分的濃度O. 0005 yg /mL、0. 001 μ g /mL、
O.002 μ g /mL、0. 004 μ g /mL、0. 010 μ g /mL ;基質(zhì)混合校準(zhǔn)曲線分別取2. 00 mL濃度為
O.0005 μ g/mL、O. 001 μ g/mL、O. 002 μ g/mL、0· 004 μ g/mL、0. OlOyg /mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)空白樣品進(jìn)行洗脫，乙酸銨定容，過濾得基質(zhì)混合校準(zhǔn)溶液。本方法對(duì)空白鰻魚樣品中顯色孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫的檢出限為O. 5 μ g/kg，達(dá)到國內(nèi)外檢測(cè)的要求。實(shí)施例I
本發(fā)明的鰻魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物檢測(cè)的前處理方法的具體操作流程包括樣品均質(zhì)、固相萃取、洗脫等操作。
具體步驟
(1)準(zhǔn)確稱取5.00 g(精確至O.Olg)樣品于50 mL離心管中，加入乙腈有機(jī)混合溶劑(20mL乙腈+20mL冰乙酸)，用高速分散均質(zhì)勻漿機(jī)把樣品打散，加入4. O g的堿性氧化鋁粉末，振蕩 lmin, 4500rpm/min 離心 IOmin ；
(2)取IOmL上清液，以15mL高純水稀釋備用，制備成25mL樣品液；
(3)C18固相萃取柱(SPE小柱C18-200mg/3mL)活化過程
a.2mL 2%冰醋酸/乙腈淋洗；
b.5mL 20%冰醋酸/甲醇除雜；
c.5mL蒸餾水平衡；
(4)將步驟(2)中25mL樣品液過柱，抽真空，5mL20%乙腈/水溶液淋洗；
(5)再用2mL 2%冰醋酸/乙腈洗脫，洗脫液加入O. 5mL O. 01mol/L乙酸銨溶液，定容至 2. 5mL ；
(6)定容液用O.22 μ m微孔濾膜過濾，所得濾液即可上機(jī)測(cè)試。本發(fā)明的提取方法較乙腈-乙酸銨緩沖溶液提取檢測(cè)的孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物的回收率高(見表1)，說明本發(fā)明使孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物的殘留能夠得到充分的提取，從而能夠有效的檢測(cè)孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物的殘留。且本發(fā)明重復(fù)性好(見表2)，具有很強(qiáng)的可操作性。表1:國標(biāo)方法與本方法乙腈-乙酸混合溶液提取的回收率比較
權(quán)利要求
1.一種鰻魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物檢測(cè)的前處理方法，其特征在于所述的前處理方法包括以下步驟 (1)準(zhǔn)確稱取樣品5.OO g，精確至0. Olg，置于50 mL離心管中，加入乙腈有機(jī)混合溶齊U，用高速分散均質(zhì)機(jī)將樣品打散，再加入4. 0 g的堿性氧化鋁粉末，振蕩lmin，4500rpm/min離心IOmin ;所述乙腈有機(jī)混合溶劑的配制為20mL乙腈+20mL冰乙酸； (2)取IOmL上清液，以15mL高純水稀釋備用，制備成25mL樣品液； (3)C18固相萃取柱的活化過程 a.2mL含2%冰醋酸的乙腈淋洗； b.5mL含20%冰醋酸的甲醇雜； c.5mL蒸餾水平衡； (4)將步驟(2)中25mL樣品液過柱，抽真空，5mL20%乙腈溶液淋洗，棄去全部淋洗液； (5)再用2mL含2%冰醋酸的乙腈洗脫，收集洗脫液，加入0. 01mol/L乙酸銨溶液，定容至2. 5mL ； (6)定容液用0.22 Pm微孔濾膜過濾，所得濾液即可上機(jī)測(cè)試。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鰻魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物檢測(cè)的前處理方法，其特征在于所述孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物包括顯色孔雀石綠、隱色孔雀石綠、顯色結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其殘留物檢測(cè)的前處理方法,屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。該方法包括待測(cè)樣品的稱量、均質(zhì)、固相萃取、洗脫等操作；所用儀器包括恒溫振蕩器、高速分散均質(zhì)機(jī)和離心機(jī)等；用本前處理方法制備出的樣品溶液可以直接用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。該前處理方法與現(xiàn)有方法相比,具有操作簡單有效、耗時(shí)少、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，具有很強(qiáng)的可操作性，有望在環(huán)保、商檢及出入境檢驗(yàn)檢疫等行業(yè)大規(guī)模推廣應(yīng)用，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)G01N30/08GK102980961SQ201210552058
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者邱彬, 佘麗雙, 林振宇, 郭隆華, 陳國南 申請(qǐng)人:福州大學(xué)