專利名稱：轉(zhuǎn)bar/pat基因植物及其衍生產(chǎn)品的快速檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析測試方法，確切地說是一種利用免疫親和層析技術(shù)對轉(zhuǎn)bar/pat基因植物及其加工產(chǎn)品中PAT蛋白的快速檢測方法。屬于免疫學(xué)和食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域。
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背景技術(shù)：
在轉(zhuǎn)基因植物研制開發(fā)或?qū)D(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行篩選或安全性評價時，往往需要對轉(zhuǎn)入外源基因進(jìn)行定性或半定量測定。bar/ pat基因均為抗除草劑基因，編碼同一蛋白一膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)。該基因廣泛應(yīng)用于基因工程育種中的抗除草劑基因，也是遺傳轉(zhuǎn)化中的標(biāo)記基因，它使植物抵抗以L-phosphiothricin(PPT)為活性成分的除草劑。近年來，全球種植的轉(zhuǎn)基因作物面積和比例連年增加，而其中的抗除草劑作物占全球轉(zhuǎn)基因作物的85%。由于抗除草劑標(biāo)記在商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用廣泛，隨著轉(zhuǎn)基因食品的快速發(fā)展，國外轉(zhuǎn)PAT/bar基因的作物和食品的大量進(jìn)入我國，轉(zhuǎn)PAT/bar基因的食品檢測技術(shù)是轉(zhuǎn)基因食品安全性評價的重要技術(shù)平臺，其研究具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
植物中的除草劑抗性是由外源bar I pat基因所表達(dá)的PAT蛋白產(chǎn)生的，本檢測方法是針對轉(zhuǎn)基因植物中bar/pat基因表達(dá)的PAT蛋白。本發(fā)明采用免疫層析法快速檢測樣品中PAT蛋白，整個過程只需5-10分鐘。試紙條質(zhì)量穩(wěn)定，保存期可達(dá)一年。適用于大豆、玉米、棉花、油菜、苜蓿等農(nóng)作物中轉(zhuǎn)基因成分的快速定性檢測。本發(fā)明的目的是提供一種具有簡便、準(zhǔn)確、快速、靈敏度和特異性高、經(jīng)濟(jì)實用、適合于現(xiàn)場檢測等特點的轉(zhuǎn)抗除草劑植物的快速檢測試紙條。為了達(dá)到本發(fā)明的目的采取如下技術(shù)方案·. 一塊bar I pat基因表達(dá)的PAT蛋白IgG抗體快速檢測試紙，在塑料支撐板上粘貼上樣品墊，上樣墊的一端緊密連接含有膠體金標(biāo)記的PAT單克隆抗體的膠體金墊，膠體金墊的另一端緊密連接硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，檢測線為包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上的PAT單克隆抗體，質(zhì)控線為包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG抗體，在檢測線和質(zhì)控線之間且距檢測線2. 5 3mm處劃有指示線用于標(biāo)識加樣位置，硝酸纖維素膜的另一端緊密連接吸樣墊形成試紙條，試紙條也可以裝入塑料卡中形成卡式包裝。所述PAT單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞株4C2分泌的/ /蛋白單克隆抗體，該細(xì)胞株已于2012年7月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC No. 6341。該/ /蛋白單克隆單抗具有高特異性、與其他轉(zhuǎn)基因材料或表達(dá)蛋白無交叉反應(yīng)，效價高，達(dá)到IO7以上。
所述的上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊為吸水濾紙。所述的植物中bar/pat基因快速檢測試紙,其特征在于所述的抗PAT蛋白單克隆抗體的包被方法為以O(shè). 01MpH7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗PAT蛋白單抗配制成I. 5mg/ml的溶液，有噴膜機在NC膜下部以I. 3ul/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線，包被T線，同時在NC膜上部包被羊抗鼠IgG作為C線，劃線后將NC膜在干燥間(溫度20 25°C，濕度小于30%)干燥8 10小時。所述的快速bar/PAT蛋白檢測試紙條,其特征在于所述的PAT蛋白抗體標(biāo)記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30 50nm的膠體金溶液，制備完成后取IOOml膠體金液放在燒杯中，用O. 2MK2C03調(diào)至pH8. 2，按IOOml膠體金溶液加入O. 5mg PAT單克隆抗體，室溫攪拌2小時，加入終濃度O. I %酪蛋白鈉，O. I %聚乙二醇20000封閉20min，12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至66. 7ml，按Iml溶液鋪16cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間溫度20 25°C，濕度小于30%干燥2 4小時，制成膠體金墊，備用。 試紙條的裝配方法為在干燥室內(nèi)溫度20 25°C，濕度小于30%，取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)距邊緣Imm搭接膠體金墊，在膠體金墊另一側(cè)距邊緣2mm搭接粘貼上樣墊；在NC膜C線一側(cè)距邊緣I. 5mm處搭接吸樣墊。然后用裁剪機將貼好的塑料板切成3_或4_寬的試紙條。檢測方法將被檢植物/材料(Img-IOOmg)研磨，加入裝有Iml碳酸鹽緩沖液的離心管中，將制備好的試紙條部分插入離心管中，溶液的浸沒高度為標(biāo)示線以下，若樣品中含有Bar基因抗原則被膠體金一PAT抗體捕獲，并擴(kuò)散到NC膜上，與NC上的抗體形成Ab-Ag-膠體金形成復(fù)合物，當(dāng)被捕獲的膠體金復(fù)合物達(dá)到一定數(shù)量時，則形成一條肉眼可見的T線，C線作為試劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陽性和陰性樣品檢測時均會出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在10分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測結(jié)果。根據(jù)上樣的檢測結(jié)果,確定試紙的最佳標(biāo)記pH值為8. 2,最佳標(biāo)記量為O. 5mg每IOOml膠體金溶液，最佳的膠體金工作液為pH9. O的Tris-檸檬酸緩沖液，含O. 2%的酪蛋白，5%蔗糖，O. 2%的BSA，O. 2%的吐溫，最佳的抗PAT蛋白單克隆抗體包被濃度為I. 5mg/ml ο 20分鐘內(nèi)判讀結(jié)果。樣本檢測
以ELISA試劑為對照，20份陽性抗除草劑材料，包括玉米、大豆、水稻，不同轉(zhuǎn)基因成分含量的樣品。本試劑檢測出陽性20份，靈敏度為O. 1%。50份陰性樣本中，本試劑檢測出陰性50份，特異性為100%。本發(fā)明轉(zhuǎn)抗除草劑bar/pat基因植物快速檢測試紙的優(yōu)點
①特異性強，敏感性高。該膠體金層析檢測試紙條以膠體金標(biāo)記高親和力的多克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)記對抗體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。且本發(fā)明試紙應(yīng)用了高特異性和高效價的由CGMCC No. 6341雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。因此，試紙條具有較強的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達(dá)到O. 25ng。②簡便、快速、時效性強。使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，無需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場操作，試紙條加入被檢樣品液后，在15分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果。
③結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。檢測試紙條均以顯示紅色線T線和C線作為檢測結(jié)果陽性和陰性標(biāo)記，即在包被膜上顯示一條紅色線C線時，表示在被檢樣品中含有被檢物，顯示兩條紅色線T線和C線時，表示在被檢樣品中不含被檢物。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。④節(jié)省費用，適用范圍廣，便于推廣。使用檢測試紙條，比用儀器分析和ELISA試劑盒的費用大幅下降。另外，試紙條的適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業(yè)檢驗，海關(guān)檢疫，衛(wèi)生檢疫，質(zhì)量監(jiān)測，加工企業(yè)和養(yǎng)殖場戶等，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和明顯的經(jīng)濟(jì)、社會效益。


圖I利用該單抗進(jìn)行轉(zhuǎn)bar基因棉花Western blot檢測 I為陰性細(xì)胞株對照；2為轉(zhuǎn)bar基因棉花總蛋白；3為非轉(zhuǎn)基因棉花總蛋白4為轉(zhuǎn)EPSPS基因玉米種子總蛋白。圖2該單抗在Elisa檢測特異性的結(jié)果。圖3該單克隆抗體在檢測不同轉(zhuǎn)Bar成分含量的檢測靈敏度結(jié)果。圖4為轉(zhuǎn)bar/pat基因植物及其衍生產(chǎn)品的快速檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。圖5檢測樣品結(jié)果判斷示意圖。圖6試紙條檢測轉(zhuǎn)基因植物中PAT蛋白I為陰性水稻2為轉(zhuǎn)bar基因水稻。
具體實施例方式鼠抗bar/PAT蛋白單克隆抗體的制備
用蛋白量為200 μ g純化bar/PAT蛋白，腹腔注射BALB/C小白鼠，用福氏完全佐劑；經(jīng)15天后進(jìn)行二次相同劑量免疫，用福氏不完全佐劑；再15天后進(jìn)行三次免疫，用加倍劑量的純蛋白不加佐劑；3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。將免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按10 : I的比例，在無血清的DMEM培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50% PEG3350作為融合劑，在37 °C下加Λ O. 6ml，融合2min，用DMEM培養(yǎng)基終止融合后，1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37°C，5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10% -50%時，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔。篩選出的特異性強陽性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲得單抗細(xì)胞株4C2。細(xì)胞株4C2進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存。 取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射O. 3-0. 5ml降植燒，7-10天后腹腔注入5-10 X IO5個雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000rpm離心3min,收集上清液，即為單克隆抗體腹水。辛酸-硫酸銨鹽析法純化單克隆抗體，-70°C保存。4C2細(xì)胞株制備得單克隆抗體，即為可專一識別PAT蛋白的抗體。單克隆抗體的效價測定 I)包被將分離純化的PAT蛋白用包被緩沖液進(jìn)行稀釋，加入酶標(biāo)板中(IOOul/孔)，PAT蛋白的包被濃度為10ug/ml ;37°C孵育2h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。將Ig非轉(zhuǎn)基因大豆葉片總蛋白加入IOml包被緩沖液中，在研缽中研磨，得到陰性對照液，將陰性對照加入酶標(biāo)板中(IOOul/孔)，即為陰性對照孔；37°C孵育2h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。封閉
每孔加入IOOul含5%脫脂奶粉的磷酸緩沖液，37°C孵育30min，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。3)每孔加入IOOul上述純化得到的單克隆抗體或其稀釋液(用酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋)，37°C孵育2h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。4)每孔加入IOOul酶標(biāo)二抗工作液，37°C孵育2h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。 5)每孔加入IOOul底物溶液，室溫避光孵育60min后，用酶標(biāo)儀測定450nm波長下的吸收值。將吸收值為陰性對照孔兩倍以上的孔判斷為陽性孔。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、小鼠腹水及純化后抗體的效價見表I。表I單克隆抗體的效價
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3.本發(fā)明的單抗采用轉(zhuǎn)印免疫印跡方法檢測轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)PAT蛋白。)種子總蛋白的提取轉(zhuǎn)bar基因棉花、非轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)EPSPS玉米種子各lg，采用HEPES buffer直接提取蛋白，具體方法為加入預(yù)冷的提取液I mL，混懸后冰上靜置3 4 h，4°C、12 000 r/min，離心20 min，上清液置于_80°C冰箱中備用。) SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳
3)轉(zhuǎn)膜
4)封閉及雜交
封閉轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，小心取出凝膠和膜，可將凝膠再用考馬斯亮藍(lán)染色以判斷轉(zhuǎn)移情況。將膜放入TBST洗一次，再置于麗春紅染色液中，在室溫下染色5min，用雙蒸水洗膜至水變清無色蛋白條帶清晰。將膜放入盛有封閉液(5%的脫脂奶粉)的容器中，室溫?fù)u床封閉Ih0一抗孵育根據(jù)抗體說明書以適當(dāng)比例(1:1000)用5%的脫脂奶粉稀釋一抗，每張膜約4ml。將封閉后的PVDF膜小心放入雜交袋內(nèi)，然后加入配好的一抗溶液，，小心排除氣泡，室溫下?lián)u床緩慢搖蕩孵育l_3h。孵育后將膜取出，用TBST搖床洗膜3次，每次5min，以去除殘留的一抗。二抗孵育用5%的脫脂奶粉按二抗說明書比例稀釋二抗(1:4000)，將PVDF膜小心置于雜交袋中，每張膜加4ml 二抗溶液，避免氣泡產(chǎn)生，封好雜交帶口，室溫?fù)u床孵育2h。孵育后將膜取出，用TBST搖床洗膜3次，每次5min。5)曝光鑒定；在暗室中取出一張X光膠片，根據(jù)熒光強弱調(diào)整曝光時間，一般為l-5min。曝光后，打開暗盒取出X光膠片，顯影、定影并沖洗膠片。6)將膠片進(jìn)行掃描,用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。圖I為利用該單抗進(jìn)行轉(zhuǎn)bar基因的棉花Western blot檢測,結(jié)果表明，該單克隆抗體能夠特異識別植物中表達(dá)PAT蛋白。本發(fā)明的單抗采用雙抗夾心ELISA法，檢測轉(zhuǎn)基因材料。取不同轉(zhuǎn)基因成分的轉(zhuǎn)基因玉米品系，Btl76 (轉(zhuǎn)bar基因玉米)、Mon810 (轉(zhuǎn)CrylAb基因抗蟲玉米)、GA21 (轉(zhuǎn)EPSPS基因玉米)、T25 (轉(zhuǎn)pat基因玉米)籽粒分別與非轉(zhuǎn)基因玉米混合成樣品材料。樣品材料中轉(zhuǎn)基因成分質(zhì)量比分別為1%、10%、100%。分別取樣品材料Ig加入IOml樣品預(yù)冷的抽提緩沖液lmL，并研磨。混懸后冰上靜置3 4 h，4°C、12000r/min,離心20 min,上清液置于_80°C冰箱中備用?！?br> 單克隆抗體的特異性鑒定
I.兔PAT蛋白多抗制備方法如下
選體重2. Okg左右、雄性、健康的家兔3只，免疫前耳緣靜脈采血分離血清作為陰性對照，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｃ庖叱绦蛉缦率酌?，抗原與等量弗氏完全佐劑充分乳化后，皮下多點注射，Img/只。二免(第15日)，用加弗氏不完全佐劑的抗原進(jìn)行免疫，部位為雙后腳掌，500yg/只。三免(第30日)，劑量同上，免疫部位為腫大的胭淋巴結(jié)。加強免疫(第37日)，不加佐劑，劑量同上。加強免疫一周后心臟采血并分離血清，用間接ELISA檢測抗體水平。效價為1:32000，心臟采血，分離血清，加入O. 01%的疊氮鈉，過濾除菌，_80°C保存?zhèn)溆?。辛酸一硫酸銨法提純兔抗bar基因蛋白IgG高免血清，將血清3000rpm離心30min，棄沉淀；按1:2的比例將離心后的血清與醋酸鹽緩沖液(O. 06M，pH=5. O)混合，用O. IM HCl調(diào)節(jié)pH值至4. 5。4°C下邊攪拌邊加入辛酸(每mL血清加入75 μ I辛酸)，攪拌30min, 4°C靜止2h, 12000rpm離心30min,棄沉淀；上清液用IM NaOH調(diào)pH值至7. 4,邊攪拌邊加入4°C放置的飽和(NH4)2SO4,使其濃度達(dá)45%，4°C靜置Ih以上；4°C 12000rpm離心30min棄上清，沉淀用少量PBS (O. 01Μ,ρΗ=7· 4)溶解，在O. 01M,pH=7. 4 PBS溶液中4°C透析過夜，期間換液3-5次，5%BaC12檢測透析液中S042-存留情況；4°C 12000rpm離心30min，吸取上清于-20°C保存。將粗純物進(jìn)一步用親和層析法進(jìn)行純化，步驟如下平衡加起始緩沖液平衡柱床至進(jìn)入與洗出液PH值相同；上樣樣品經(jīng)濾膜濾過，取5mL上柱，輕輕振蕩5min，豎直放置。待所有懸浮物沉淀后，吸出上清；洗脫加起始緩沖液5mL，輕輕振蕩5min，豎直放置。待所有懸浮物沉淀后，吸出上清。反復(fù)操作3次。加洗脫緩沖液3mL，輕輕振蕩5min，豎直放置。待所有懸浮物沉淀后，吸出上清。反復(fù)操作2次。收集洗脫液，每毫升洗脫液加70 μ L中和緩沖液。提純前和提純后的兔抗bar基因蛋白IgG高免血清純度鑒定采用普通的聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE )，并用測定抗體濃度。2.兔抗PPV IgG與McAb最佳工作濃度的確定
用方陣試驗確定兔抗bar基因蛋白多抗與McAb最佳工作濃度。單抗雙夾心ELISA的一般流程兔抗bar基因IgG包被-洗板-封閉-洗板-加樣-洗板-加McAb-洗板-加酶標(biāo)二抗-洗板-顯色-終止-判定結(jié)果。具體步驟如下包被用包被液將兔抗bar基因 IgG 作 I: 100、I: 200、I: 400、I: 800、I: 1600、I: 3200、I: 6400 稀釋，100 μ L/孔，每個稀釋度一行，37°C包被2h后或4°C過夜；棄掉孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，5min/次，拍干；封閉用39^八作封閉劑，100^ /孔，并去除各孔內(nèi)可能產(chǎn)生的氣泡，37°C封閉3h，同上洗滌三次，拍干；加樣，100 μ L/孔，同時設(shè)PBS空白對照，37°C作用40min，同上洗漆三次，拍干；加 McAb 用稀釋液將 McAb 作 1:25、1:50、1: 100、I: 200、I: 400、I: 800、I 1600稀釋，加入酶標(biāo)板中，IOOyL/孔，每個稀釋度作兩列，同時設(shè)PBS空白對照，37°C作用40min，同上洗滌三次，拍干；加酶標(biāo)二抗加入I: 5000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100 μ L/孔，37°C作用40min，同上洗滌三次，拍干；顯色與終止，加入新配制的TMB底物顯色液IOOyL /孔，室溫避光顯色10_15min，加入終止液(2M H2S04溶液)，50 μ L/孔，在酶標(biāo)儀上讀取0D450nm。以陽性孔OD值接近1，P/Ν值最大時，兔抗PPV IgG和McAb的最大稀釋度為其最佳工作濃度。確定的兔抗PPV IgG包被濃度為1:3200 ;單抗稀釋倍數(shù)為1:800。雙抗夾心Elisa檢測該單抗對于轉(zhuǎn)基因植株中PAT蛋白的特異性
分別將樣本液Btl76、Mon810、GA21和T25 (1%、10%、100%)作為待測樣本液進(jìn)行如下實驗提取的植物蛋白(包括葉片和種子的提取液)，每孔100 μ L加于微量反應(yīng)板，4°C過夜 包被，洗滌緩沖液洗滌后，以每孔100 μ L加入3% BSA封閉液，37°C封閉3h，PBST洗滌，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔100 μ L加于微量反應(yīng)板，SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為陰性對照。37°C作用60min，洗滌，加入酶標(biāo)二抗，37°C作用60min，洗滌，加入新配制的TMB底物顯色液每100 μ L，室溫避光顯色10-15min，2mol/L H2SO4 ;每孔50 μ L終止反應(yīng)，酶標(biāo)檢測儀測定0D450nm各孔的吸收值。結(jié)果見圖2。上述結(jié)果說明，制備獲得的單抗與非轉(zhuǎn)bar基因植物不發(fā)生交叉反應(yīng)，對轉(zhuǎn)bar基因植物具有較強的特異性。該單抗僅對PAT蛋白有特異性反應(yīng)，而與Bt蛋白、EPSP無特異性反應(yīng)，說明用這單抗具有檢測bar/PAT蛋白良好的特異性。單克隆抗體的靈敏度鑒定
樣本制備將Btl76 (bar基因陽性材料)，與其非轉(zhuǎn)基因玉米親本籽粒，按照質(zhì)量比進(jìn)行混合，制備轉(zhuǎn)基因成分分別為100%、10%、5%、1%、0. 1%、0. 01%、0%的待測樣品。選用Mon810(未含有bar基因的轉(zhuǎn)基因玉米品系)為陰性對照，其與非轉(zhuǎn)基因玉米的混合比例同上。采用HEPES buffer直接提取蛋白，具體方法為加入預(yù)冷的提取液I mL，混懸后冰上靜置3 4 h，4°C、12 000 r/min，離心20 min，上清液置于_80°C冰箱中備用。分別將將含有10%，5%，1%，O. 1%，O. 01%, O. 001%、0%的轉(zhuǎn)bar基因成分的種子提取植物蛋白提取液，稀釋濃度為lOyg/mL，作物樣本液，進(jìn)行Elisa檢測實驗(步驟同特異性檢測實驗)，結(jié)果見圖3。該實驗結(jié)果表明利用本發(fā)明獲得的單克隆抗體
5.膠體金標(biāo)記bar基因蛋白單克隆抗體的制備 I)膠體金標(biāo)記
采用改良的檸檬酸三鈉還原法，其過程為在攪拌條件下，98 mL去離子水加熱至65°C后，加入I. 5 mL 1%的氯金酸，繼續(xù)加熱，待溫度上升至95°C時，加入2mL 1%的檸檬酸三鈉，當(dāng)溶液呈酒紅色時停止加熱，冷卻后，4°C避光保存。取膠體金溶液，pH7. 2 7. 5，金顆粒大小20 30nm。將bar基因蛋白單克隆抗體O. 5mg/mLlul加入膠體200ul金溶液中，混合均勻，即得金標(biāo)鼠抗蛋白單克隆抗體溶液。經(jīng)純化及濃縮，用稀釋液稀釋4倍后備用。2)試紙條的組裝整個測試條由2層吸水玻璃纖維，I層硝酸纖維素膜，吸水濾紙及白色塑料墊板組成。將吸水紙、包被NC膜(包被有單克隆抗體和羊抗兔IgG)、噴涂玻璃纖維(金標(biāo)抗體)從上到下依次固定于白色塑料板上。裁取40 mm X5 mm的吸水紙，將吸水紙、包被NC膜、噴涂玻璃纖維膜、樣品墊從上到下依次固定在帶有粘合劑的PVC背板上，切成5mm寬的試紙條，室溫干燥備用，即成測試條。將做好的測試條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)，密封貯存。如圖3所示。3)測試樣品檢測
檢測前，將樣品磨碎并加水或提取液提取，溶解獲取蛋白。檢測時，先將樣品墊浸在已提取好的蛋白樣品溶液中，樣品溶液在毛細(xì)吸收作用下由樣品墊沿NC膜向吸收墊流動。樣品溶液中的特定蛋白在流經(jīng)結(jié)合墊時首先與其中膠體金標(biāo)記的抗體發(fā)生抗原-抗體的特異性的結(jié)合作用，流經(jīng)檢測帶時抗原-抗體復(fù)合物被固定在檢測帶上的捕獲抗體結(jié)合，聚集形成肉眼可見的金標(biāo)條帶，顯示檢測結(jié)果為陽性。過量的金標(biāo)抗體繼續(xù)流動被固定在控制帶上的第二抗體結(jié)合聚集形成條帶，顯示檢測的結(jié)果有效。4)靈敏度試驗
將抗原按0、0.25、0.5、1.0、5.0、10、20、40、80 ng/ ml稀釋濃度進(jìn)行檢測，檢測線出現(xiàn)紅色的最低可測定量，即為此試劑條的靈敏度。當(dāng)抗原濃度> O. 25時，出現(xiàn)明顯的陽性紅帶；>0.5，出現(xiàn)明顯的強陽性帶。因此本試紙條的檢測靈敏度為O. 25ng。5)穩(wěn)定性試驗
測試條在不啟封條件下，分別檢測37°C存放2周、室溫存放18個月后的試紙條。結(jié)果顯示，對O. 1%的轉(zhuǎn)基因成分檢測靈敏度無明顯影響。圖6為應(yīng)用本發(fā)明的組裝試紙條，并進(jìn)行的轉(zhuǎn)bar基因水稻和陰性水稻的檢測結(jié)果。表明該試紙條可用于免疫層析法檢測轉(zhuǎn)bar基因植物材料。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙，其特征在于由底板、吸水墊、硝酸纖維素膜、單克隆抗體金標(biāo)墊、上樣墊組成；底板中部粘貼硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條檢測線和一條控制線，底板一端粘貼單克隆抗體金標(biāo)墊和上樣墊，另一端粘貼吸水墊，其中，單克隆抗體金標(biāo)墊一末端搭接硝酸纖維素膜的一末端，另一末端搭接上樣墊的一末端，硝酸纖維素膜的另一末端搭接吸水墊一末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙，所述抗除草劑轉(zhuǎn)基因是轉(zhuǎn)bar/pat基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙，其特征在于控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙，其特征在于檢測線是由PAT蛋白單克隆抗體包被制成，該PAT蛋白單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 6341的雜交瘤細(xì)胞株分泌。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙，其特征在于金標(biāo)墊是由PAT蛋白單克隆抗體作膠體金標(biāo)記，該PAT蛋白單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 6341的雜交瘤細(xì)胞株分泌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙，其特征在于金標(biāo)墊是由PAT蛋白單克隆抗體作膠體金標(biāo)記，該PAT蛋白單克隆抗體由保藏號為CGMCCNo. 6341的雜交瘤細(xì)胞株分泌。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙，其特征在于吸水紙用雙層吸水紙。
8.權(quán)利要求I或2所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙在抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物檢測中的用途。
9.權(quán)利要求I或2所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙在抗以L-phosphiothricin為活性成分的除草劑的轉(zhuǎn)基因植物檢測中的用途。
10.權(quán)利要求I或2所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的用途。
11.權(quán)利要求I或2所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙在抗以L-phosphiothricin為活性成分的除草劑的轉(zhuǎn)基因食品檢測中的用途。
12.權(quán)利要求I或2所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙在檢測轉(zhuǎn)bar/mi基因植物中的用途。
13.權(quán)利要求I或2所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙在檢測轉(zhuǎn)bar/mi基因食品中的用途。
14.一種轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求I或2所述的快速檢測植物中抗除草劑轉(zhuǎn)基因成分的膠體金試紙。
15.如權(quán)利要求14所述的檢測試劑盒，所述轉(zhuǎn)基因為轉(zhuǎn)如r/PAT基因。
全文摘要
本專利利用自主知識產(chǎn)權(quán)的bar/pat單克隆抗體和膠體金標(biāo)記技術(shù)，平行移動免疫親和層析一步法，快速檢測樣本中PAT蛋白的特異性檢測試條。本發(fā)明采用的克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞4C2分泌，其保藏編號為CGMCCNo.6341。檢測試條包括:高蛋白親和性的纖維素膜作為系統(tǒng)反應(yīng)的載體和顯示反應(yīng)結(jié)果，樣本墊吸取待檢測樣本并為反應(yīng)系統(tǒng)提供適合的反應(yīng)條件，膠體金墊為膠體金標(biāo)記抗體的固相載體，吸水墊吸收檢測后的樣本，塑料基板作為反應(yīng)體系的支撐板，不同規(guī)格的雙面和單面膠帶用于固定各反應(yīng)膜和吸水材料于支撐板上，透明保護(hù)膠帶用于固定和保護(hù)樣本墊和膠體金墊，彩色標(biāo)志膠帶作為該檢測試條的特征標(biāo)識。本發(fā)明的免疫膠體金試紙，可為判定待檢測樣本是否含轉(zhuǎn)基因植物樣本(轉(zhuǎn)bar/pat基因)提供直接證據(jù)，對轉(zhuǎn)基因篩選和轉(zhuǎn)基因安全評價，具有較為廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號G01N33/558GK102879574SQ20121040440
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者龍麗坤, 李飛武, 張明, 王月華 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司