專(zhuān)利名稱(chēng)：食物不耐受血清特異性IgG檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種食物不耐受血清特異性IgG檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
變態(tài)反應(yīng)性疾病是現(xiàn)代社會(huì)中常見(jiàn)的一種疾病，它是由廣泛存在的變應(yīng)原引發(fā)的，我國(guó)大約有5-10%的人受變應(yīng)原的侵?jǐn)_。引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)稱(chēng)為變應(yīng)原，其中食物是一種重要變應(yīng)原。人體對(duì)食物敏感可引起食物變態(tài)反應(yīng)，目前認(rèn)為主要有兩種類(lèi)型由IgE介導(dǎo)的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)，反應(yīng)通常發(fā)生迅速，病癥明顯；由IgG介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，此種反應(yīng)通常在接觸食物幾小時(shí)或幾天后才會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)癥狀，如長(zhǎng)期疲勞、關(guān)節(jié)炎、蕁麻疹、濕疹、頭痛、腸胃功能失調(diào)及其它慢性癥狀。通常情況下，將由食物引起，IgG介導(dǎo)的異常反應(yīng)稱(chēng)之為食物不耐受。食物不耐受患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生食物特異性IgG抗體，檢測(cè)血清特異性 IgG抗體對(duì)于確定不耐受食物鑒別和診斷具有重要價(jià)值。目前臨床上常采用檢測(cè)特異性抗體來(lái)確定引起患者不耐受的食物類(lèi)型，而酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)是常用的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的食物變應(yīng)原IgG抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)法通常采用的都是直接包被模式，即由生產(chǎn)廠家預(yù)先將變應(yīng)原固相化于作為載體的聚苯乙烯微孔板上，供檢測(cè)人員直接使用。其原理是將變應(yīng)原成份包被于固相載體表面，用其結(jié)合患者血清中的特異性抗體，再通過(guò)進(jìn)一步結(jié)合酶標(biāo)記抗體進(jìn)行顯色反應(yīng)來(lái)判斷結(jié)果，從而確定患者血清中是否存在包被抗原所對(duì)應(yīng)的特異性抗體。然而，引起食物過(guò)敏的物質(zhì)種類(lèi)繁多，同一患者可對(duì)多種食物過(guò)敏，并且存在明顯的個(gè)體差異。在檢測(cè)時(shí)往往需要同時(shí)進(jìn)行多種變應(yīng)原的檢測(cè)，而每一個(gè)患者所需的檢測(cè)組合又各不相同。傳統(tǒng)試劑常常由生產(chǎn)廠家將多種變應(yīng)原同時(shí)包被于微孔板制成類(lèi)似套餐性質(zhì)的檢測(cè)組合，由于采用直接包被法，組合方式無(wú)法改變。而實(shí)際工作中，每一患者的檢測(cè)需要各不相同，食物過(guò)敏組合是個(gè)性化的，這往往與廠家提供的項(xiàng)目組合產(chǎn)生沖突，造成多余的檢測(cè)和漏檢，同時(shí)會(huì)增加檢測(cè)成本。例如目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室主要使用由BI0MERICA公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫法試劑盒，該試劑盒可同時(shí)檢測(cè)6例患者，每例患者可檢測(cè)(必須檢測(cè))14種食物變應(yīng)原，組合方式不能改變。此外，該試劑盒在固定位置可測(cè)定2條標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)血清特異性IgG進(jìn)行定量。因此，此試劑盒只能進(jìn)行兩次測(cè)定，每次測(cè)定3例患者血清。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)直接包被模式制備的食物過(guò)敏酶標(biāo)反應(yīng)板無(wú)法滿(mǎn)足患者個(gè)性化需求的不足，本發(fā)明引入生物素-鏈霉親和素間接包被模式，對(duì)酶標(biāo)反應(yīng)板的包被制作環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)。變應(yīng)原不需預(yù)先包被，而是標(biāo)記上生物素，與包被了親和素的微孔反應(yīng)板同時(shí)提供給檢測(cè)人員。檢測(cè)人員可以根據(jù)被檢者的具體情況靈活選擇所需食物變應(yīng)原，將生物素標(biāo)記變應(yīng)原和待測(cè)血清同時(shí)加入微孔板，實(shí)現(xiàn)即時(shí)包被，并且包被和檢測(cè)過(guò)程同步進(jìn)行，大大降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)靈活性，真正實(shí)現(xiàn)個(gè)性化檢測(cè)。
生物素(biotin，B)分子量為244. 31，現(xiàn)已能人工合成，制備方便。生物素基本結(jié)構(gòu)為雙環(huán)結(jié)構(gòu)1環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的部位環(huán)為噻吩環(huán)，含一個(gè)戊酸側(cè)鏈，其末端羧基可與生物大分子連接，形成生物素標(biāo)記抗原、抗體等。生物素與生物大分子結(jié)合后并不影響生物大分子和生物素原有的生物活性，即生物素標(biāo)記抗體同時(shí)具備與親和素和相應(yīng)抗原結(jié)合之特性。鏈霉親合素(streptavidin, SA),分子量65KD,由四條相同的肽鏈組成,一個(gè)鏈霉親合素分子能結(jié)合四個(gè)生物素分子。與親和素相比，鏈霉親和素對(duì)生物素具有高度親和カ(親和常數(shù)為IO1Vmol)，與生物素結(jié)合后形成非常穩(wěn)定復(fù)合物，很難解離?；谏锼嘏c鏈霉親和素相結(jié)合這一特性所建立的體系稱(chēng)為生物素-親和素系統(tǒng)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是ー種食物不耐受血清特異性IgG酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，主要包括(I)預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板；(2)生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原；(3)生物素標(biāo)記抗人IgG抗體；(4)人 IgG 標(biāo)準(zhǔn)品；(5)陽(yáng)性質(zhì)控血清；(6)酶標(biāo)記抗人IgG抗體(7)常規(guī)酶標(biāo)清洗液(8)顯色液A :含0. 054% (VA)H2O2的磷酸鹽檸檬酸緩沖液；(9)顯示液B :含0. 48g/L TMB的檸檬酸緩沖液；(10)終止液lmol/L H2SO4 溶液。本發(fā)明試劑盒的主要作用過(guò)程如下在微孔板(酶標(biāo)反應(yīng)板)上包被連接了生物素的牛血清白蛋白，再進(jìn)ー步連接鏈霉親和素，形成生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素通用反應(yīng)板，即預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板；將常見(jiàn)的多種食物變應(yīng)原分別標(biāo)記生物素，使用時(shí)根據(jù)患者的病史等情況選擇所需的生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原分別加入酶標(biāo)反應(yīng)板，同時(shí)加入21倍稀釋的患者血清，血清中的特異性抗體(即特異性IgG)與相應(yīng)生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原結(jié)合形成免疫復(fù)合物(變應(yīng)原-特異性抗體復(fù)合物)；由于該復(fù)合物含有生物素分子，它通過(guò)生物素和預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板上的鏈霉親和素結(jié)合，從而將復(fù)合物固定于微孔板上，之后的反應(yīng)過(guò)程和結(jié)果判讀過(guò)程同傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)模式，即洗板去除未結(jié)合成分，再加入酶標(biāo)記的第二抗體(酶標(biāo)抗人IgG抗體)同固定于微孔板的待測(cè)抗體結(jié)合，通過(guò)酶催化底物顯色而得出結(jié)果。如果血清中不含該特異性抗體，則反應(yīng)不能順利進(jìn)行，最終不會(huì)顯色。特異性IgG含量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作需要5個(gè)測(cè)試孔，分別加入加入生物標(biāo)記抗人IgG抗體和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；洗板去除未結(jié)合成分，再加入酶標(biāo)記的第二抗體(酶標(biāo)抗人IgG抗體)同固定于微孔板的待測(cè)抗體結(jié)合，通過(guò)酶催化底物顯色而得出結(jié)果并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。陽(yáng)性質(zhì)控測(cè)試孔加樣方式同待測(cè)血清標(biāo)本。優(yōu)選的，所述試劑盒中，預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板的每個(gè)微孔中包被有O.75微克的生物素化牛血清白蛋白和O. 45微克的鏈霉親和素。生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原的蛋白濃度為10-20微克/毫升，優(yōu)選15微克/毫升；生物素標(biāo)記抗人IgG抗體的蛋白濃度為2-4微克/毫升，優(yōu)選3微克/毫升；用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線的人IgG標(biāo)準(zhǔn)品含有六個(gè)濃度，分別是0U/ml”、“50U/ml”、“100U/ml”、“200U/ml” 和 “400U/ml ；酶標(biāo)記抗人IgG抗體的稀釋比例I : 12000。優(yōu)選的，所述生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原為牛奶變應(yīng)原、雞蛋變應(yīng)原、蝦變應(yīng)原、小 麥變應(yīng)原、花生變應(yīng)原、腰果變應(yīng)原、蟹變應(yīng)原和黃豆變應(yīng)原中的一種或幾種，更優(yōu)選的，所述試劑盒包括了上述八種食物變應(yīng)原。優(yōu)選的，所述酶標(biāo)反應(yīng)板是可拆卸式96孔聚苯乙烯微孔板。本發(fā)明還提供了一種制備所述試劑盒的方法，包括如下步驟(I)在酶標(biāo)反應(yīng)板上包被生物素化牛血清白蛋白，再進(jìn)一步連接鏈霉親和素，得到預(yù)包被了生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板；(2)用生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原；(3)制備生物素標(biāo)記抗人IgG抗體；(4)預(yù)包被了生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板、生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原、生物素標(biāo)記抗人IgG抗體、人IgG標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性質(zhì)控血清、酶標(biāo)記抗人IgG抗體、常規(guī)酶標(biāo)清洗液、顯色液A、顯示液B和終止液組裝成成品。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是I、本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的直接包被模式不能滿(mǎn)足患者個(gè)性化檢測(cè)需求的不足，便于檢測(cè)人員根據(jù)需要靈活選擇項(xiàng)目組合，提高了檢測(cè)試劑的通用性和利用率，同時(shí)避免無(wú)關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)和試劑浪費(fèi)，相當(dāng)于從“雕版印刷”改進(jìn)為“活字印刷”，由于包被和檢測(cè)過(guò)程的同步進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間和操作程序并未增加，并且使得操作更加方便。2、簡(jiǎn)化試劑盒的制備工藝?，F(xiàn)有產(chǎn)品需要將96孔酶標(biāo)反應(yīng)板各孔分別包被不同的食物變應(yīng)原，并做好標(biāo)記，然后根據(jù)需要進(jìn)行組裝。本發(fā)明提供的酶標(biāo)反應(yīng)板所包被的生物分子相同(生物素化牛血清白蛋白和鏈霉親和素)，且包被程序完全相同，如此改進(jìn)大幅度簡(jiǎn)化酶標(biāo)板的制備工藝，且避免了由于變應(yīng)原組裝出現(xiàn)錯(cuò)誤影響檢測(cè)結(jié)果的情況。3、傳統(tǒng)直接包被模式中，食物變應(yīng)原直接包被在固相材料表面，由于受空間位阻效應(yīng)的影響，會(huì)影響抗原與待測(cè)抗體結(jié)合。本發(fā)明所采取的間接包被模式，將生物素標(biāo)記食物變應(yīng)原置于液相中，與液相中的待測(cè)抗體反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物后再通過(guò)生物素分子與酶標(biāo)板的鏈霉親和素結(jié)合，此種方式由于食物變應(yīng)原在液相中保持原有空間構(gòu)象，利于與待測(cè)抗體結(jié)合。


圖I是直接包被和間接包被模式的比較，圖2是標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定和特異性IgG測(cè)定反應(yīng)原理示意圖，圖3是直接包被和間接包被反應(yīng)模式的比較。圖4是血清IgG定量劑量-反應(yīng)曲線。圖I-圖 3 中，
I、酶標(biāo)反應(yīng)板的單個(gè)孔，2、食物變應(yīng)原(已知抗原)，3、生物素化牛血清白蛋白，4、鏈霉親和素，5、生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原，6、待測(cè)抗體(特異性IgG)，7、酶標(biāo)記抗人IgG抗體,8、生物素標(biāo)記抗人IgG抗體，9、人IgG標(biāo)準(zhǔn)品。圖I中的a為直接包被模式,食物變應(yīng)原直接包被于固相載體表面,不同反應(yīng)孔包被不同食物變應(yīng)原；圖I中的b為間接包被模式，微孔板各孔分別包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素；食物變應(yīng)原不直接包被而是標(biāo)記生物素，并置于液相中，檢測(cè)時(shí)生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原與待測(cè)抗體結(jié)合后再借助生物素親和素系統(tǒng)結(jié)合于固相材料表面。圖2中，a顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定IgG的原理生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體與不同濃度的人IgG標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)形成免疫復(fù)合物(生物素抗人IgG抗體-人IgG)，借助生物素-親和素系統(tǒng)，此復(fù)合物被固定于固相材料表面；再加入酶標(biāo)記抗人IgG抗體,形成雙抗體夾心復(fù)合物(生物素抗人IgG-人IgG-酶標(biāo)抗人IgG)。
圖2中，b顯示特異性IgG測(cè)定原理生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原(生物素抗原)與待測(cè)血清中特異性IgG反應(yīng)形成免疫復(fù)合物(生物素抗原-特異性IgG)，借助生物素-親和素系統(tǒng)，此復(fù)合物被固定于固相材料表面；再加入酶標(biāo)記抗人IgG抗體,形成雙抗體夾心復(fù)合物(生物素抗原-特異性IgG-酶標(biāo)抗人IgG)。此外，特異性IgG含量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。圖3中，a為直接包被模式，包被于固相材料的食物變應(yīng)原與液相中的待檢IgG結(jié)合形成免疫復(fù)合物，此過(guò)程為固相抗原與液相抗體之間的反應(yīng)。因食物變應(yīng)原已被固定于特定檢測(cè)孔，此孔只能用于檢測(cè)本抗原相對(duì)應(yīng)的IgG抗體。圖3中，b為間接包被模式，待測(cè)抗體和生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原均處于液相中，此種反應(yīng)效率高于固相與液相之間的反應(yīng)；二者形成免疫復(fù)合物的同時(shí)借助生物素-親和素系統(tǒng)再用固相載體結(jié)合。此為，微孔板各孔均為通用孔，可根據(jù)檢測(cè)食物抗體種類(lèi)不同，選擇相應(yīng)生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說(shuō)明，但不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例Iー種食物不耐受血清特異性IgG酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括如下組分(I)預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板(2)多種生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原，包括生物素標(biāo)記的牛奶變應(yīng)原、雞蛋變應(yīng)原、蝦變應(yīng)原、小麥變應(yīng)原、花生變應(yīng)原、腰果變應(yīng)原、蟹變應(yīng)原和黃豆變應(yīng)原；(3)生物素標(biāo)記抗人IgG抗體(羊抗人IgG抗體，ABCAM公司，貨號(hào)ab48386)(4)不同濃度的人IgG標(biāo)準(zhǔn)品(將純品IgG(ABCAM公司，貨號(hào)ab91102)用含1%小牛血清的PH 7. 40. IM PBS配制成5個(gè)不同濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別是“OU/ml”、“ 50U/ml ”、“ IOOU/ml ”、“ 200U/ml ”、“ 400U/ml ”，標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)國(guó)際質(zhì)控血清校準(zhǔn)。)(5)陽(yáng)性質(zhì)控血清(陽(yáng)性質(zhì)控血清由50例食物特異性IgG中等輕度陽(yáng)性血清(100 200U/ml)混合后獲得，此血清分別含有八種食物特異性IgG，使用時(shí)視為臨床標(biāo)本一同檢測(cè)。)
(6)酶標(biāo)記抗人IgG抗體(Southern Biotech公司，貨號(hào)6140-05 ;稀釋比例I 12000，用含10%小牛血清的pH 7. 40. IM PBS稀釋即可)(7)常規(guī)酶標(biāo)清洗液(8)顯色液A :含O. 054% (VA)H2O2的磷酸鹽檸檬酸緩沖液；(9)顯示液B :含O. 48g/L TMB的檸檬酸緩沖液；(10)終止液lmol/L H2SO 溶液。所述試劑盒通過(guò)如下方法制備得到(I)溶液配制(I)稀釋液 I
Tris (:」輕 Φ 麵· Φ 烷)6.06 g
NaCl (氣化_)8.77 g
Proclin 3000.5 腿i
ddH20 (雙蒸水)950 ml調(diào)pH 至 8.0，加 0.5ml Procilin 300，加 ddH20 定容至 1L。(2)生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液用稀釋液I將生物素化牛血清白蛋白稀釋?zhuān)K濃度為5μ g/ml，充分?jǐn)嚢杌靹颉?3)稀釋液 II
NaH2PO4* 2 H2O (磷 |—. 鈉)4.68 g
Na2HPO4 · 12H20 (_酸(4 .._ )7.16 g
L-Tryptophan (L-色Mjft)0.2 g
NaCl(M 化她)8.77g
CidH2O(雙蒸水)950 ml調(diào)pH 至 8. 0，加 ddH20 定容至 1L。(4)鏈霉親和素包被緩沖液用稀釋液II將鏈酶親和素稀釋?zhuān)K濃度為3μ g/ml，充分?jǐn)嚢杌靹颉?5)封閉溶液
NaH2PO4 · 2H20 (磷酸.—: 鈉) 0.145 g Na2HPO4 · HH2O (_酸鉍itt) I '45 g ACA(HilId酸) 1.5 g
NaCl()4.38 gCidH2O(雙蒸水)450 ml調(diào)pH 至 7. 3-7. 5BSA (牛血清白蛋白) 2. Og蔗糖17. 5gProcilin 300O. 25ml力卩ddH20 定容至 5OOml
(6)磷酸鹽緩沖液(0. lmol/L, pH7. 4)ddH20 (雙蒸水)3600mlNaH2PO4 2H20(磷酸ニ氫鈉)11. 84gNa2HPO4 12H20(磷酸氫ニ鈉)116g調(diào)pH 至 7. 3-7. 45，加 ddH20 定容至 4し(7)碳酸氫鈉緩沖液(0. lmol/L, pH9. 5)NaHCO3 (碳酸氫鈉) 8. 4g ddH20 (雙蒸水)800ml用lmol/L NaOH和6mol/L HCL調(diào)節(jié)pH值至9. 5,去離子水定容至1L。(8)顯色液A，市售商品，也可通過(guò)如下方法制備得到
JtiH2O(雙蒸水)450ml
I 酸鈉8.2g
檸f蒙酸1.58g
30%H2020.27ml調(diào)節(jié)pH至5. 3，ddH20定容至500ml，分裝，4°C儲(chǔ)存。(9)顯色液B，市售商品，也可通過(guò)如下方法制備得到
(JdH2O( 蒸水)400腿1
EDTA( Z..——————；胺_ 乙酸) 0.186g
朽:様酸0.96g
lOmol/L NaOH0.54ml
W -醇50ml
TMB-HCl (BJtf1II聯(lián)苯胺ニIfe酸Ife) 0.24g上述反應(yīng)注意避光，調(diào)節(jié)pH值3.0，用CldH2O定容至500ml，分裝，4°C儲(chǔ)存。(10)終止液用常規(guī)方法將98%的濃硫酸用ddH20配制成lmol/L的酶標(biāo)終止液，4°C儲(chǔ)存。(11)0. 1M, pH 8. 0 的 Tris-HCl 溶液Tris (三羥甲基氨基甲烷) 12. 12克ddH20 (雙蒸水)70毫升充分溶解后，用HCl調(diào)節(jié)pH至8. 0，加ddH20定容至100毫升(2)生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素酶標(biāo)反應(yīng)板的制備(I)在空白酶標(biāo)反應(yīng)板(可拆卸式96孔聚苯こ烯微孔板)的每個(gè)微孔中加入150微升生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液，將酶標(biāo)反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，18-250C，溫浴16-18小時(shí)；(2)甩凈包被緩沖液，用稀釋液I洗酶標(biāo)反應(yīng)板2次，300微升每孔，毎次需靜置10分鐘。(3)甩凈稀釋液，并在干凈的毛巾上拍干。(4)在酶標(biāo)反應(yīng)板的每個(gè)微孔再加入150微升鏈霉親和素包被緩沖液，將酶標(biāo)反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，18-25°C，溫浴2小時(shí)；(5)甩凈包被緩沖液，用稀釋液II洗酶標(biāo)板2次，300微升每孔，每次需靜置10分鐘。(6)重復(fù)(3)。(7)在酶標(biāo)反應(yīng)板的每個(gè)微孔再加入250微升封閉溶液，將酶標(biāo)反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，4°C，溫浴過(guò)夜；(8)甩凈封閉溶液，并在干凈的毛巾上拍干。將微孔板真空干燥至少6小時(shí)。取出后放置于干燥室及時(shí)真空包裝備用。(3)生物素標(biāo)記的變應(yīng)原的制備
(I)將用常規(guī)方法將純化好的用于檢測(cè)特異性抗體的食物變應(yīng)原濃度調(diào)整為約5毫克每毫升，分別用O. I摩爾每升，PH9. 5的NaHCO3緩沖液透析，過(guò)夜，并于280nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算蛋白總量，得蛋白溶液。(2)將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素與變應(yīng)原的摩爾比為20 I的比例，將生物素緩慢、逐滴加入得蛋白溶液中，邊滴加邊攪拌，全加入后室溫?cái)嚢钘l件下繼續(xù)反應(yīng)Ih ；。(3)將反應(yīng)后的液體用O. lmol/L磷酸鹽緩沖液于4°C透析24小時(shí)，其中換液數(shù)次，充分除去未結(jié)合的生物素，用O. 1M，pH 8. O的Tris-HCl溶液將生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原的蛋白濃度稀釋至為10-20微克/毫升，優(yōu)選15微克/毫升；(4)將每種候選的變應(yīng)原標(biāo)記生物素后，分別裝于試劑瓶中，與生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素酶標(biāo)反應(yīng)板配套使用。(4)生物標(biāo)記的抗人IgG抗體的制備方法同生物素標(biāo)記的變應(yīng)原的制備，用O. 1M，PH 8. O的Tris-HCl溶液將生物素標(biāo)記抗人IgG抗體的蛋白濃度稀釋至2_4微克/毫升，優(yōu)
選3微克/暈升。(4)將以下組分組裝成試劑盒A預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈酶親和素酶標(biāo)反應(yīng)板B生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原C生物素標(biāo)記的抗人IgGD人IgG標(biāo)準(zhǔn)品E陽(yáng)性質(zhì)控血清F酶標(biāo)記抗人I gG抗體G常規(guī)酶標(biāo)清洗液H顯色液AI顯色液BG終止液。實(shí)施例2一種實(shí)施例I制備的試劑盒的使用方法，包括如下步驟I、根據(jù)檢測(cè)目的和患者病史等情況，檢測(cè)人員可從提供的生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原中自由選擇出要檢測(cè)的一種或多種變應(yīng)原進(jìn)行項(xiàng)目組合，如選擇牛奶變應(yīng)原、雞蛋變應(yīng)原、蝦變應(yīng)原、小麥變應(yīng)原、花生變應(yīng)原、腰果變應(yīng)原、蟹變應(yīng)原和黃豆變應(yīng)原中的一種或幾種的組合物。2、通過(guò)如下方法使用所述試劑盒(I)準(zhǔn)備根據(jù)需要取出酶標(biāo)反應(yīng)板(預(yù)先包被有生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素)。測(cè)試孔數(shù)量為樣本數(shù)X系數(shù)+5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)+陽(yáng)性質(zhì)控血清，系數(shù)為每個(gè)樣本測(cè)定食物變應(yīng)原種類(lèi)數(shù)。將生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原試劑、酶標(biāo)記抗人IgG抗體、顯色液A、顯色液B、終止液等放置室溫條件下平衡20min以上。(2)稀釋標(biāo)本用pH7. 40. lmol/L PBS將血清標(biāo)本稀做21倍稀釋?zhuān)?0 U I待測(cè)血清加入200微升PBS溶液，血清稀釋可在稀釋微孔板中進(jìn)行。(3)加樣與溫浴標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試孔分別加入100 ill生物標(biāo)記的抗人IgG抗體和25ul不同濃度的人IgG標(biāo)準(zhǔn)品；樣品和質(zhì)控血清測(cè)試孔分別加入25 Ul已稀釋待檢樣本(或質(zhì)控血清)和100 u I生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原溶液，充分混勻，置37°C水浴60min。
(4)洗板取出酶標(biāo)反應(yīng)板，棄反應(yīng)液，用常規(guī)酶標(biāo)洗液將微孔板洗滌5次，最后ー次拍干液體。(5)加酶標(biāo)抗體加入酶標(biāo)抗人IgG (標(biāo)記抗體)，125 ii I/孔，置37°C中水浴30min。(6)洗板重復(fù)步驟“(4) ”。(7)顯色加入顯色液A和顯色液B,各50ii I/孔；室溫、避光條件下反應(yīng)15min ;各孔繼續(xù)加入終止液50 u I ;充分混勻后讀取A45(lnm。(8)結(jié)果判斷首先，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)⑴，相應(yīng)濃度的A45tol縱坐標(biāo)⑴，采用四參數(shù)擬合方式繪制劑量-反應(yīng)曲線，即特異性IgG定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得數(shù)學(xué)函數(shù)模型。其次，應(yīng)用繪制劑量-反應(yīng)曲線或數(shù)學(xué)函數(shù)模型，通過(guò)測(cè)定的A45tol獲得相應(yīng)特異性IgG的濃度。特異性IgG定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作如下分別以不同濃度的(“OU/ml”、“50U/ml”、“100U/ml”、“200U/ml”、“400U/ml”)人IgG標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo),吸光度(A450nm)為縱坐標(biāo),采用四參數(shù)Logistic曲線擬合方式，生物素標(biāo)記抗IgG抗體稀釋度為I : 8000 (2-4微克/毫升)，酶標(biāo)記杭-人IgG稀釋度為
I: 12000，標(biāo)準(zhǔn)曲線如所圖4所示。特異性IgG標(biāo)準(zhǔn)分為4級(jí)陰性小于等于50U/ml ;弱陽(yáng)性大于50U/ml并小于等于100U/ml ；中等陽(yáng)性大于100U/ml并小于等于200U/ml ；強(qiáng)陽(yáng)性大于200U/ml ；實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒的性能檢測(cè)如下精密度測(cè)定以蛋、奶為例分別選取陰性血清、蛋清和牛奶陽(yáng)性血清、強(qiáng)陽(yáng)性血清，分別進(jìn)行批內(nèi)測(cè)定和批間測(cè)定，各測(cè)定10次，獲得酶聯(lián)免疫法測(cè)定特異性IgG的批內(nèi)、批間精密度，如表I和表2所不。從表I和表2中結(jié)果可以看出，本發(fā)明的試劑盒具有較好的精密度，能夠達(dá)到酶聯(lián)免疫診斷試劑的基本要求。
表I蛋清特異性IgG精密度測(cè)試結(jié)果
Ij Λ_I JwJ,ψ4ψ·Λ ,J , φ·<τ JW*.· Α
吸光度mmm,；u
44ψ44r- j-1 %
(α,λ) BttJiiIiI,,, ι ι,,, Iittiiili RI1W ifit.,, . w . _M i11--IuUi I' M i11IuUI <Pl Ifr.lulii I HIfr.-I-Ulii I
I0. 184 0. .356 0.562 0. 192 0. 382 0.583
SI)0,027 0.038 0.048 0.020 0.032 0,0>M CV(1I)14.710.78.510.48.47.5表2牛奶特異性IgG精密度測(cè)試結(jié)果
ΠΙ ,, lfr批M粘密度批Λ精密度u,,P) wn±Mim 則件·沾則件愈沾剛件_沾陽(yáng)性
X0.2210. ；MiS 0. S96 ().241{). : 1 0. SH2
SI)0.029 0. IW2 0. (M2 0.021 0. 29 0.02
CV (I)_IUij_H1H_7J)_H1J_L6_I 6特異性測(cè)定以蛋奶為例，分別選取其他食物(蝦、蟹、豆類(lèi)、羊肉、牛肉)等不耐受患者血清，應(yīng)用間接包被模式測(cè)定蛋清特異IgG和牛奶特異IgG，分別計(jì)算與這些物質(zhì)交叉反應(yīng)率(蛋清或牛奶IgG/交叉物質(zhì)IgG)。結(jié)果顯示用本發(fā)明的試劑盒測(cè)定蛋清特異IgG時(shí)，與蝦、蟹、豆類(lèi)、羊肉、牛肉特異性IgG無(wú)交叉反應(yīng)(交叉反應(yīng)率低于O. 5%);測(cè)定牛奶特異性IgG時(shí)，與蝦、蟹、豆類(lèi)、羊肉等特異性IgG無(wú)交叉反應(yīng)(交叉反應(yīng)率低于0.5%)，但發(fā)現(xiàn)與牛肉特異性IgG存在交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率為4. 2%。與參比試劑比對(duì)結(jié)果以美國(guó)Biomerica酶聯(lián)免疫(間接法)作為參比方法，間接包被酶聯(lián)免疫法分別測(cè)定牛奶特異性IgG和蛋清特異性IgG。結(jié)果如表3、表4所示蛋清特異性IgG測(cè)定結(jié)果敏感度為90. 7% (39/43)，特異度為95.0% (38/40)，準(zhǔn)確度為92. 8% (77/83);陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為95. 1% (39/41)，陰性預(yù)測(cè)值為90. 5% (38/42)。同時(shí)，牛奶特異性IgG測(cè)定結(jié)果敏感度為92. 1% (35/38)，特異度為90.0% (36/40)，準(zhǔn)確度為91. 0% (71/78);陽(yáng)性預(yù)測(cè)值% 89. 7% (35/39)，陰性預(yù)測(cè)值為 92. 3% (36/39)。表3本發(fā)明試劑盒與參比試劑檢測(cè)結(jié)果(蛋清)
木發(fā)叫試劑mmm 酬忭__沽合汴iiifi 39 2 41
PJJf I·；43842
_fHl·_43_40_83表4本發(fā)明試劑盒與參比試劑檢測(cè)結(jié)果(牛奶)
權(quán)利要求
1.一種食物不耐受血清特異性IgG酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括 (1)預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板； (2)生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原； (3)生物素標(biāo)記抗人IgG抗體； ⑷人IgG標(biāo)準(zhǔn)品； (5)陽(yáng)性質(zhì)控血清； (6)酶標(biāo)記抗人IgG抗體； (7)常規(guī)酶標(biāo)清洗液； (8)顯色液A:含0. 054% (VA)H2O2的磷酸鹽檸檬酸緩沖液； (9)顯示液B:含0. 48g/L TMB的檸檬酸緩沖液； (10)終止液lmol/LH2SO4 溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于 預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板的每個(gè)微孔中包被有0. 75微克的生物素化牛血清白蛋白和0. 45微克的鏈霉親和素； 生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原的蛋白濃度為10-20微克/毫升，優(yōu)選15微克/毫升； 生物素標(biāo)記抗人IgG抗體的蛋白濃度為2-4微克/毫升，優(yōu)選3微克/毫升； 用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線的人IgG標(biāo)準(zhǔn)品含有六個(gè)濃度，分別是0U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml 和 400U/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原為牛奶變應(yīng)原、雞蛋變應(yīng)原、蝦變應(yīng)原、小麥變應(yīng)原、花生變應(yīng)原、腰果變應(yīng)原、蟹變應(yīng)原和黃豆變應(yīng)原中的一種或幾種。
4.一種制備權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述試劑盒的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)在酶標(biāo)反應(yīng)板上包被生物素化牛血清白蛋白，再進(jìn)一步連接鏈霉親和素，得到預(yù)包被了生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板； (2)用生物素標(biāo)記食物變應(yīng)原； (3)制備生物素標(biāo)記抗人IgG抗體； (4)預(yù)包被了生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板、生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原、生物素標(biāo)記抗人IgG抗體、人IgG標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性質(zhì)控血清、酶標(biāo)記抗人IgG抗體、常規(guī)酶標(biāo)清洗液、顯色液A、顯示液B和終止液組裝成成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(I)包括如下步驟 [I]配制稀釋液I、稀釋液II、封閉溶液； 稀釋液I由如下組分制備得到Tris6.06 gNaCl8.77 g Proclin 3000.5mlddli20950 ml調(diào) pH 至 8. 0，加 0. 5ml Procilin 300，加 ddH20 定容至 IL ； 稀釋液II由如下組分制備得到NaH2PO4 2H204,68 g Na2HPO4 * 12H20 7,16 g L-Tryptophan 0.2 g NaCl8.7 g CldH2O950 ml 調(diào)pH至8. 0，加ddH20定容至IL ； 封閉溶液由如下組分制備得到 NaH2PO4 * 2H20 0.145 g Na2HPO4 12H20 1.45 g ACA1.5 g NaCl4.38 gCldH2O450 ml 調(diào) pH 至 I. 3-7. 5 BSA 2. Og 鹿糖 17. 5g Procilin 300 0. 25ml 加ddH20定容至500ml ； [2]配制生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液 用稀釋液I將生物素化牛血清白蛋白稀釋至5 y g/ml ； [3]配制鏈霉親和素包被緩沖液 用稀釋液I將鏈霉親和素稀釋至3 u g/ml ； [4]制備預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板 ①在空白酶標(biāo)反應(yīng)板的每個(gè)微孔中加入150微升生物素化牛血清白蛋白包被緩沖液，將酶標(biāo)反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，18_25°C，溫浴16-18小時(shí)；②甩凈包被緩沖液，用稀釋液I洗酶標(biāo)反應(yīng)板2次，300微升每孔，每次靜置10分鐘； ③甩凈稀釋液，并拍干； ④在酶標(biāo)反應(yīng)板的每個(gè)微孔再加入150微升鏈霉親和素包被緩沖液，將酶標(biāo)反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，18-25°C，溫浴2小時(shí)；⑤甩凈包被緩沖液，用稀釋液II洗酶標(biāo)反應(yīng)板2次，300微升每孔，每次靜置10分鐘； ⑥甩凈稀釋液，并拍干； ⑦在酶標(biāo)反應(yīng)板的每個(gè)微孔再加入250微升封閉溶液，將酶標(biāo)反應(yīng)板放在密封的容器內(nèi)，4°C，溫浴過(guò)夜； ⑧甩凈封閉溶液，并拍干，將酶標(biāo)反應(yīng)板真空干燥至少6小時(shí)，得預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于用生物素標(biāo)記食物變應(yīng)原包括如下步驟 ①將純化好的用于檢測(cè)特異性抗體的變應(yīng)原調(diào)整為5毫克每毫升，分別用0. I摩爾每升，pH9. 5的NaHCO3緩沖液透析，過(guò)夜，并于280nm處測(cè)吸光度值，計(jì)算蛋白蛋白總量，得蛋白溶液；②將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素與變應(yīng)原的摩爾比為20 I的比例，將生物素緩慢滴入蛋白溶液中，邊滴加邊攪拌，全加入后室溫?cái)嚢钘l件下繼續(xù)反應(yīng)Ih ； ③將反應(yīng)后的液體用0.I摩爾每升的PBS于4°C透析24小時(shí)，充分除去未結(jié)合的生物素后，即得到所述生物素標(biāo)記的變應(yīng)原。
全文摘要
本發(fā)明提供一種食物不耐受血清特異性IgG檢測(cè)試劑盒及其制備方法。所述試劑盒包括(1)預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板、(2)生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原、(3)生物素標(biāo)記抗人IgG抗體、(4)人IgG標(biāo)準(zhǔn)品、(5)陽(yáng)性質(zhì)控血清、(6)酶標(biāo)記抗人IgG抗體、(7)常規(guī)酶標(biāo)清洗液、(8)顯色液A、(9)顯示液B和(10)終止液。本發(fā)明的試劑盒使得檢測(cè)人員可以根據(jù)被檢者的具體情況靈活選擇所需檢測(cè)的食物變應(yīng)原，將生物素標(biāo)記變應(yīng)原和待測(cè)血清同時(shí)加入微孔板內(nèi)，實(shí)現(xiàn)即時(shí)包被，并且包被和檢測(cè)過(guò)程同步進(jìn)行，大大降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)靈活性，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102809657SQ20121031395
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者李會(huì)強(qiáng), 王高升, 相平 申請(qǐng)人:沃克(天津)生物科技有限公司