專利名稱：分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄t型鈣通道電流的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別涉及一種分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法。
背景技術(shù)：
T型鈣離子通道主要存在于心臟、神經(jīng)組織、腎臟、平滑肌、精子以及多種內(nèi)分泌器官。T型鈣流存在于心臟浦肯野纖維細胞、竇房結(jié)、潛在起搏細胞上，有助于起搏細胞的復極，動作電位的始動，竇房結(jié)自律性，在起搏細胞動作電位平臺期上發(fā)揮著重要的作用。同時，T型鈣通道也參與了肌肉興奮-收縮偶聯(lián)，內(nèi)分泌腺的興奮-分泌偶聯(lián)及細胞的調(diào)控過程。研究證明，T型鈣通道不僅是治療腎性高血壓和心律失常，也是治療意識喪失型癲癇及神經(jīng)性疼痛的重要藥物靶點。此外，細胞內(nèi)鈣超載與房顫、心衰、偏頭痛、阿爾茨海默病、睡眠障礙等發(fā)病有關(guān)。因此，觀察藥物對T型鈣通道的作用已成為協(xié)助評價治療心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物藥效的重要手段。膜片鉗技術(shù)被稱為研究離子通道的“金標準”，是研究離子通道的最重要的技術(shù)。傳統(tǒng)的胰蛋白酶化學消化法分離細胞及含血清培養(yǎng)基維持細胞生長雖簡便易行，但存在接種的細胞貼壁不良，生長時間較短及神經(jīng)元純度欠佳等問題。細胞外灌流液中直接去除了鈉離子，造成實驗過程中細胞存活時間明顯縮短等缺陷，需要進行改良劑提高，從而確保實驗的成功率，穩(wěn)定性和重復性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種易操作、能提高神經(jīng)細胞收獲率和純度的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，包括以下步驟A、選取新生24h的SD大鼠，處死并在無菌條件下取出全腦后，用解剖液清洗數(shù)次；B、置于冰浴中解剖，小心分離得到皮層，仔細剔除皮層上的微細血管后，充分剪碎皮層組織；C、將剪碎的皮層組織置于廣口瓶內(nèi)，加入同體積的O. 25%的胰蛋白酶，瓶口用錫箔紙蓋上，置于5%二氧化碳、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化18-25分鐘；D、充分消化后，加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，用尖頭吸管輕吹打數(shù)分鐘至液體成迷糊狀即停止吹打，用70微米網(wǎng)篩過濾，收集細胞懸液；E、將細胞懸液以IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，調(diào)整細胞密度，接種于放置了多聚賴氨酸包被處理的蓋玻片培養(yǎng)皿，用添加了 B27的Neurobasal培養(yǎng)液，置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-21天，得到生長有皮層神經(jīng)細胞的蓋玻片；
F、將生長有皮層神經(jīng)細胞的蓋玻片加入灌流槽中，置于倒置顯微鏡載物臺上，用細胞外灌流液灌流清洗細胞，流速保持1-1. 5毫升/分鐘；選擇生長飽滿的細胞進行膜片鉗實驗，采用標準的全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗模式下記錄T型鈣通道電流；實驗在22-25°C下進行，使用的玻璃電極充滿細胞內(nèi)灌流液，電阻為3-5兆歐。上述分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其中，步驟A中所述的解剖液由500毫升HBSS、5毫升青霉素及鏈霉素、5毫升濃度為I摩爾的氯化鎂、3. 5毫升濃度為I摩爾的HEPES和5毫升濃度為200毫摩爾的L-glutamine配制而成，經(jīng)過濾且高壓滅菌后4°C冷藏備用。
上述分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其中，步驟F中所述的細胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2、CaCl2、4-羥乙基哌嗪乙磺酸和葡萄糖配制而成，并用NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 4，配制成的溶液中，NaCl的濃度為135mM，CsCl的濃度為5. 4mM,MgCl2的濃度為1禮，CaCl2的濃度為I. 8mM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為5mM，葡萄糖的濃度為10mM，溶液的滲透壓為290m0sm ；上述分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其中，步驟F中所述的細胞內(nèi)灌流液由CsCl、四乙基氯化銨、CaCl2、鎂-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH調(diào)節(jié)pH至7. 2，配制成的溶液中，CsCl的濃度為120mM，四乙基氯化銨的濃度為20mM，CaCl2的濃度為1禮，鎂-三磷酸腺苷的濃度為5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的濃度為llmM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為IOmM ;溶液的滲透壓為 310m0Sm。上述分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其中，步驟E中所述的置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-21天的具體做法是，每六天換培養(yǎng)液一次，每次換半量。上述分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其中，步驟F中所述的電壓鉗模式為，鉗制電壓-90毫伏，施予50毫秒的-40毫伏預脈沖后給予300毫秒、O毫伏去極化脈沖。本發(fā)明分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法的優(yōu)點在于I、采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法，收獲的細胞產(chǎn)量增加，接種后細胞貼壁良好，生長時間顯著延長以及后期神經(jīng)元純度高；2、采用低濃度胰蛋白酶溶液，長時間消化，均勻振搖分散的方法，消化過程中細胞損傷小，減少了分離過程中的化學和機械損傷。3、取出全腦后，分離得到皮層，剔除微細血管等取材過程，均在冰浴上進行，充分保證了細胞的活力。4、Neurobasal培養(yǎng)液中添加了 B27，以抑制膠質(zhì)細胞的增殖，同時又保證了神經(jīng)細胞的健康生長所需營養(yǎng)因子的供給。5、細胞外灌流液中加入了正常濃度的鈉離子，維持了細胞內(nèi)胎的離子平衡，有效延長了實驗中細胞的存活時間，也保證了細胞狀態(tài)的穩(wěn)定性?？傊?，本發(fā)明中穩(wěn)定培養(yǎng)的新生鼠皮層神經(jīng)細胞具有正常的離子通道的功能，適用于膜片鉗技術(shù)對其生理特性及藥理特性的研究，本實驗操作易于掌握，是一種簡單有效的穩(wěn)定培養(yǎng)分離新生鼠皮層神經(jīng)細胞的方法。
具體實施例方式本發(fā)明分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，包括以下步驟一、新生鼠皮層神經(jīng)細胞的分離與培養(yǎng)選取新生24h的SD大鼠數(shù)只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，斷頭處死，無菌條件下分層剪開頭皮，顱骨，用彎鑷拉開腦區(qū)視野，小心取出全腦，解剖液清洗數(shù)次。小心分離皮層，置于冰浴中解剖，仔細剔除微細血管，充分剪碎組織；加入同體積的O. 25%的胰蛋白酶，瓶口用錫箔紙蓋上，5% 二氧化碳，37攝氏度培養(yǎng)箱內(nèi)消化20分鐘左右，期間輕搖數(shù)次；充分消化后，加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，用尖頭吸管輕吹打數(shù)分鐘至液體成糊狀即停止吹打,隨后用70微米網(wǎng)篩過濾，收集細胞懸液；以IOOOrpm離心數(shù)分鐘，棄上清；根據(jù)計數(shù)結(jié)果，調(diào)整細胞密度，接種于放置了多聚賴氨酸包被處理的蓋破片的培養(yǎng)皿，用添加了 B27的Neurobasal培養(yǎng)液,置于37度攝氏度,含5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每六天，換維 持培養(yǎng)液一次，每次換半量。二、T型鈣通道電流的記錄體外培養(yǎng)7-21天的神經(jīng)細胞，可用于電生理實驗。將生長有皮層神經(jīng)細胞的蓋玻片加入灌流槽中，置于倒置顯微鏡載物臺上，細胞靜置后沉底貼壁，細胞外灌流液灌流清洗細胞，流速保持1-1. 5毫升/分鐘。選擇邊緣整齊，表面無顆粒，橫紋清晰，無收縮的細胞進行膜片鉗實驗。所有實驗在室溫(22-25攝氏度)下進行。使用的玻璃電極在充滿細胞內(nèi)灌流液時的電阻約為3-5兆歐。采用標準的全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗模式下記錄通道電流。記錄T型鈣通道電流時，鉗制電壓-90毫伏，施予100毫秒的-30毫伏去極化脈沖。本發(fā)明中所采用的解剖液由500毫升HBSS、5毫升青霉素或鏈霉素、5毫升濃度為I摩爾的氯化鎂、3. 5毫升濃度為I摩爾的HEPES和5毫升濃度為200毫摩爾的L-glutamine配制而成，經(jīng)過濾且高壓滅菌后4°C冷藏備用。本發(fā)明中所采用的細胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2, CaCl2、4_羥乙基哌嗪乙磺酸和葡萄糖配制而成，并用NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 4，配制成的溶液中，NaCl的濃度為135mM，CsCl的濃度為5. 4mM, MgCl2的濃度為ImM，CaCl2的濃度為I. 8mM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為5mM，葡萄糖的濃度為10mM，溶液的滲透壓為290m0sm.本發(fā)明中所采用的細胞內(nèi)灌流液由CsCl、四乙基氯化銨、CaCl2、鎂-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH調(diào)節(jié)pH至7. 2，配制成的溶液中，CsCl的濃度為120mM，四乙基氯化銨的濃度為20mM，CaClJ^濃度為1禮，鎂-三磷酸腺苷的濃度為5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的濃度為llmM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為IOmM ;溶液的滲透壓為310m0Sm。
權(quán)利要求
1.一種分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于，包括以下步驟 A、選取新生24h的SD大鼠，處死并在無菌條件下取出全腦后，用解剖液清洗數(shù)次； B、置于冰浴中解剖，小心分離得到皮層，仔細剔除皮層上的微細血管后，充分剪碎皮層組織； C、將剪碎的皮層組織置于廣口瓶內(nèi)，加入同體積的O.25%的胰蛋白酶，瓶口用錫箔紙蓋上，置于5%二氧化碳、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化18-25分鐘； D、充分消化后，加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，用尖頭吸管輕吹打數(shù)分鐘至液體成迷糊狀即停止吹打，用70微米網(wǎng)篩過濾，收集細胞懸液； E、將細胞懸液以IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，調(diào)整細胞密度，接種于放置了多聚賴氨酸包被處理的蓋玻片培養(yǎng)皿，用添加了 B27的Neurobasal培養(yǎng)液，置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-21天，得到生長有皮層神經(jīng)細胞的蓋玻片； F、將生長有皮層神經(jīng)細胞的蓋玻片加入灌流槽中，置于倒置顯微鏡載物臺上，用細胞外灌流液灌流清洗細胞，流速保持1-1. 5毫升/分鐘；選擇生長飽滿的細胞進行膜片鉗實驗，采用標準的全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗模式下記錄T型鈣通道電流；實驗在22-25°C下進行，使用的玻璃電極充滿細胞內(nèi)灌流液，電阻為3-5兆歐。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于步驟A中所述的解剖液由500毫升HBSS、5毫升青霉素及鏈霉素、5毫升濃度為I摩爾的氯化鎂、3. 5毫升濃度為I摩爾的HEPES和5毫升濃度為200毫摩爾的L-glutamine配制而成，經(jīng)過濾且高壓滅菌后4°C冷藏備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于步驟F中所述的細胞外灌流液由NaCl、CsCl、MgCl2, CaCl2、4_羥乙基哌嗪乙磺酸和葡萄糖配制而成，并用NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 4，配制成的溶液中，NaCl的濃度為135mM，CsCl的濃度為5. 4mM,MgCl2的濃度為ImM，CaCl2的濃度為I. 8mM，4_羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為5mM，葡萄糖的濃度為10mM，溶液的滲透壓為290m0sm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于；步驟F中所述的細胞內(nèi)灌流液由CsCl、四乙基氯化銨、CaCl2、鎂-三磷酸腺苷、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸配制而成，并用CsOH調(diào)節(jié)pH至7. 2，配制成的溶液中，CsCl的濃度為120mM，四乙基氯化銨的濃度為20mM，CaClJ^濃度為1禮，鎂-三磷酸腺苷的濃度為5mM，乙二醇二乙醚二胺四乙酸的濃度為llmM，4-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為IOmM ;溶液的滲透壓為310m0Sm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于步驟E中所述的置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-21天的具體做法是，每六天換培養(yǎng)液一次，每次換半量。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，其特征在于步驟F中所述的電壓鉗模式為，鉗制電壓-90毫伏，施予100毫秒的-30毫伏去極化脈沖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離培養(yǎng)新生鼠皮層神經(jīng)細胞記錄T型鈣通道電流的方法，穩(wěn)定培養(yǎng)的新生鼠皮層神經(jīng)細胞具有正常的T型鈣離子通道的功能，適用于膜片鉗技術(shù)對其生理特性及藥理特性的研究，本實驗操作易于掌握，是一種簡單有效的穩(wěn)定培養(yǎng)分離新生鼠皮層神經(jīng)細胞的方法。本發(fā)明中通過穩(wěn)定培養(yǎng)分離的新生鼠皮層神經(jīng)細胞，從而顯著提高了實驗的成功率，穩(wěn)定性和可重復性。
文檔編號G01N27/26GK102809596SQ201210299399
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者談學海, 林佩元, 陳景才, 范柳 申請人:輝源生物科技(上海)有限公司