專利名稱：小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
精原干細(xì)胞是部分未分化的A型精原細(xì)胞，位于雄性哺乳動(dòng)物睪丸曲細(xì)精管生精上皮基膜內(nèi)，在復(fù)雜而高度有序的精子發(fā)生過(guò)程中占據(jù)極其重要的地位。精原干細(xì)胞是一種可以將基因傳遞給后代的干細(xì)胞，在雄性生物中精原干細(xì)胞正常的自我更新和增殖、分化保證了終生的生殖細(xì)胞供應(yīng)。精原干細(xì)胞維持一定的數(shù)目以及保持正常的增殖、分化功能是確保男性生育的關(guān)鍵。在合適的環(huán)境和條件下，精原干細(xì)胞能夠分化為其他組織的細(xì)胞精原干細(xì)胞的研究與應(yīng)用需要獲得長(zhǎng)期培養(yǎng)并維持其體內(nèi)分化能力的穩(wěn)定細(xì)胞系，這些穩(wěn)定細(xì)胞系的培養(yǎng)大都來(lái)自于幼年小鼠的睪丸組織，孫源等在《小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立[J].中華男科學(xué)雜志，2008，14(8) :695 700》中披露了以下內(nèi)容取出生后2 6d的雄性ICR小鼠30只，脫頸法處死，切取睪丸后，采用兩步酶消化法制成單細(xì)胞懸液，添加特定培養(yǎng)液，以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果小鼠精原干細(xì)胞在體外穩(wěn)定增殖，所得克隆AP強(qiáng)陽(yáng)性，標(biāo)記物檢測(cè) GFRa -l+/0ct-4+/VASA+/SCP3-，基因表達(dá) GFR a -l+/0ct_4+/SCP3-，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為處于未分化狀態(tài)的小鼠精原干細(xì)胞。在本研究建立的培養(yǎng)體系下小鼠精原干細(xì)胞可穩(wěn)定傳代并保持未分化狀態(tài)，為探索體外精子發(fā)生過(guò)程提供了良好的研究平臺(tái)?！蹲匀弧冯s志在2006 年第 440 卷第 7088 期第 1199 1203 頁(yè)刊登了《Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis》(成年小鼠精原干細(xì)胞的多潛能性)一文，文中提及，成年個(gè)體精原干細(xì)胞可發(fā)育成各種組織。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，《突變研究》(Mutat. Res.)雜志在1993年第 290 期 193 200 頁(yè)刊登了一篇名為《A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H/101 Fl hybrid mouse》 (C3H/101 Fl雜交鼠中精原干細(xì)胞自我更新的定量研究)的文章，文中提及，在幼年個(gè)體中，大約每1 萬(wàn)個(gè)睪丸細(xì)胞中才有2 3個(gè)精原干細(xì)胞，僅占睪丸所有生精上皮細(xì)胞總數(shù)的0. 02% 0. 03%，而成年睪丸中精原干細(xì)胞所占的比例更低，分化程度更高，因而長(zhǎng)期培養(yǎng)的難度更大。用成年小鼠精原干細(xì)胞建立細(xì)胞系并產(chǎn)生后代小鼠，在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此， 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何在體外培養(yǎng)成年小鼠精原干細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法。利用本發(fā)明的方法，可使得來(lái)源于幼體或成體小鼠的精原干細(xì)胞均能夠在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并增殖，能夠建立長(zhǎng)期維持穩(wěn)定生長(zhǎng)的精原干細(xì)胞系，并且維持其精子發(fā)生的功能。
一種小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟步驟一，收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備細(xì)胞懸液；

步驟二，利用免疫磁珠分選法分離出精原干細(xì)胞；步驟三，制備精原干細(xì)胞的培養(yǎng)液，對(duì)精原干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。步驟一中，所述免疫磁珠分選法使用的磁珠為T(mén)hyl磁珠。步驟一中，所述Thyl磁珠為⑶90。步驟三中，所述原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)時(shí)加入STO細(xì)胞飼養(yǎng)層，所述STO細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法具體為向STO細(xì)胞中加入含10 μ 1/ml絲裂霉素C的STO細(xì)胞培養(yǎng)液，之后于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；PBS緩沖液洗滌；加入0. 25%胰蛋白酶，置于培養(yǎng)箱中消化4-5min ；加入STO 細(xì)胞培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化，并用移液槍吹打，使細(xì)胞分散均勻；轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至離心管中，離心，棄去上清液，向離心管中加入STO細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液槍吹勻細(xì)胞，然后分至鋪有明膠的平皿中，加入STO細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液槍將培養(yǎng)液均勻分散處理的細(xì)胞，培養(yǎng)24h后， 得到的STO細(xì)胞即可作為精原干細(xì)胞的飼養(yǎng)層。所述STO 細(xì)胞培養(yǎng)液配方88% DMEM，10% FBS,0. 3mg/ml L-谷氨酰胺，100U/ml
青霄素。步驟三中，所述傳代培養(yǎng)具體為4-7天傳代1次。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于還提供一種小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法所使用的培養(yǎng)基，由STO細(xì)胞飼養(yǎng)層和精原干細(xì)胞培養(yǎng)液組成，所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液包括 MEM- α、FBS、L-谷氨酰胺、LIF、bFGF、胰島素、維生素C、EGF、⑶NF。優(yōu)選地，所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)一步包括非必需氨基酸、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉中的一種以上。優(yōu)選地，所述FBS的體積百分含量為8-10%，所述LIF的含量為102_104U/ml，所述bFGF的含量為0. 02-0. 03μ g/ml，所述IGF-IR激活劑的含量為0. 04-0. 06μ g/ml，所述 EGF的含量為0. 01-0. 02 μ g/ml，所述維生素C的含量為40-60 μ g/ml，所述⑶NF的含量為 0.01-0. 02 μ g/ml。優(yōu)選地，在所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述FBS的體積百分比為10%，所述LIF的含量為103u/ml，所述bFGF的含量為0. 025 μ g/ml，所述IGF-IR激活劑的含量為0. 05 μ g/ ml，所述維生素C的含量為50 μ g/ml，所述EGF的含量為0. 01 μ g/ml，所述⑶NF的含量為 0.01 μ g/ml。步驟三中，配制所述精原干細(xì)胞的培養(yǎng)液的具體步驟為100ml精原干細(xì)胞培養(yǎng)液的配制為取86. 8ml MEM- α，IOml FBS, Iml 30mg/ml L-谷氨酰胺，Iml非必需氨基酸， Iml 100mmol/L 丙酮酸鈉，0. 7μ 1β-巰基乙醇，100μ 1 106U/ml LIF, 5 μ 1 1 μ g/μ 1 胰島素，5 μ 1 lmg/ml 維生素 C，2. 5μ 1 1 μ g/ μ 1 bFGF, 1 μ 1 1 μ g/ μ 1 EGF, 1μ 11μ g/μ 1 ⑶NF ；將以上各組分混勻即得。所述非必需氨基酸購(gòu)買(mǎi)自Invitrogen公司。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果利用本發(fā)明的方法，可使得來(lái)源于幼體或成體小鼠的精原干細(xì)胞均能夠在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并增殖，能夠建立長(zhǎng)期維持穩(wěn)定的精原干細(xì)胞系，并且維持其精子發(fā)生的功能；同時(shí)，本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便，安全可靠，成本低廉。


圖1 穩(wěn)定的小鼠精原干細(xì)胞系的建立的照片。(a)顯示培養(yǎng)在絲裂霉素C處理過(guò)的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上24小時(shí)后的成年精原干細(xì)胞形態(tài)(箭頭所示)。(b)培養(yǎng)4個(gè)月后， 典型的精原干細(xì)胞簇和克隆的形態(tài)。比例尺10μπι in a;50ym inb。圖2 精原干細(xì)胞移植12周后的睪丸切片的照片，見(jiàn)精子發(fā)生。比例尺40μπι。圖3 :C57BL/6來(lái)源的成年小鼠精原干細(xì)胞系移植入C57BL/6XCD-1 Fl代受體小鼠后，與純種CD-I小鼠交配，并產(chǎn)生的后代。母親為純白色，后代均為黑色。圖4 =PCR檢測(cè)STPB-C轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的免疫熒光檢測(cè)照片；M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； P 陽(yáng)性對(duì)照；2和7 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠；1，3，4，5，6，8，9和10 野生型小鼠。圖5 =Southern雜交驗(yàn)證STPB-C轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的電泳圖譜；M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； P 陽(yáng)性對(duì)照；N 陰性對(duì)照；1和3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠；2，4，5和6 野生型小鼠。圖6 =PCR檢測(cè)STPB-C基因沉默小鼠的免疫熒光檢測(cè)照片；M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P 陽(yáng)性對(duì)照；6，7，8，9和13 =STPB-C基因沉默小鼠；1，2，3，4，5，10，11，12，14，15和16 野生型小鼠。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解為這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)見(jiàn)New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1小鼠精原干細(xì)胞系的建立與移植步驟一，幼年、成年或老年小鼠精原干細(xì)胞的分離將所需的幼年、成年或老年小鼠處死，用75%酒精棉球擦洗小鼠身體；迅速剖腹取雙側(cè)睪丸，將睪丸置于約含1/3體積D-Hanks液的冰浴平皿中，并去除睪丸組織的包膜； 另取一滅菌1. 5ml EP管，加入Iml D-Hanks液，將分離的生精小管轉(zhuǎn)移至其中；取3. 5ml 含lmg/ml膠原酶的D-Hanks液至15ml離心管，將含生精小管的D-Hanks液吸入其中，并用 500 μ 1含膠原酶IV的D-Hanks沖洗殘余組織，一起吸入15ml離心管中，使總體積為5ml ； 將15ml離心管置于37°C水浴，略振蕩消化15min，消化完畢后，IOOOrpm離心5min，棄去上清液；加入5ml D-Hanks液于離心管中，IOOOrpm離心5min，棄去上清液，同法洗滌3次；力口入5ml含0. 25%胰蛋白酶和0. 02% EDTA的D-Hanks液，37°C略振蕩消化lOmin，而后加入 500 μ 1 FBS終止消化；IOOOrpm離心5min，棄去上清液；在細(xì)胞中加入400ml免疫磁珠分選 BD buffer (緩沖液)(購(gòu)買(mǎi)自BD Biosciences公司)以及40 μ 1的Thyl磁珠(CD90)(購(gòu)買(mǎi)自BD Biosciences公司)，輕輕混勻后，于6_8°C冰箱放置30min ；將1. 5ml離心管安裝固定在磁珠分選架子上，加入混合液于離心管內(nèi)，然后在磁珠分選架上放置6-8min ；緩慢吸走BD buffer (緩沖液)混合液，取下該離心管(詳情參照BD Biosciences公司的產(chǎn)品手冊(cè)(protocol))；加入1.5ml干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸離心管中的磁珠分選的細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入 Φ35mm培養(yǎng)皿或24孔板培養(yǎng)；培養(yǎng)3_4h后，可在顯微鏡下觀察到混雜其中的體細(xì)胞開(kāi)始貼壁，小心傾斜培養(yǎng)皿，將尚未貼壁的精原細(xì)胞連同培養(yǎng)液(為精原干細(xì)胞培養(yǎng)液)一起吸出，另行接種培養(yǎng)。步驟二，小鼠精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)1、精原干細(xì)胞的培養(yǎng)液配方
IOOml精原干細(xì)胞培養(yǎng)液的配制具體為取86. 9ml MEM- α，IOml FBS, lml30mg/ ml L-谷氨酰胺，Iml非必需氨基酸(購(gòu)買(mǎi)自Invitrogen公司)，lmllOOmmol/L丙酮酸鈉， 0. 7μ 1β-巰基乙醇，ΙΟΟμ 1 106U/ml LIF,5y 1 1 μ g/μ 1 胰島素，5 μ 1 lmg/ml 維生素 C， 2. 5 μ 1 1 μ g/ μ 1 bFGF，1 μ 1 1 μ g/ μ 1 EGF, 1 μ 1 1 μ g/ μ 1 ⑶NF ；將以上各組分混勻即得。2、STO飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備(1)取若干新的Φ60πιπι平皿，分別加入Iml明膠，室溫于超凈工作臺(tái)放置2h后除
去明膠，繼續(xù)將培養(yǎng)板置于超凈工作臺(tái)，晾干后待用；(2)吸去STO培養(yǎng)平皿中舊的培養(yǎng)液，向STO培養(yǎng)平皿中加入含10 μ 1/ml絲裂霉素C的STO培養(yǎng)液2ml (此培養(yǎng)液需事先置于培養(yǎng)箱進(jìn)行平衡)，將STO培養(yǎng)平皿置于培養(yǎng)箱處理1. 5h，所述STO細(xì)胞培養(yǎng)液配方為88% DMEMUO % FBS,0. 3mg/ml L-谷氨酰胺和 100U/ml青霉素；(3)處理1.5h后，取出平皿，移去培養(yǎng)液，向STO培養(yǎng)平皿中加入Iml PBS緩沖液， 輕輕晃動(dòng)STO培養(yǎng)平皿，棄去PBS緩沖液，如此反復(fù)操作5次；(4)向STO培養(yǎng)平皿中加入Iml 0. 25%胰蛋白酶，置于培養(yǎng)箱中消化4-5min ；力口入等體積的新鮮STO培養(yǎng)液(不含絲裂霉素C)終止胰蛋白酶消化，并用移液槍吹打，使細(xì)胞分散均勻；(5)轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至12ml離心管中，IOOOrpm離心5min，棄去上清，向離心管中加入3ml STO培養(yǎng)液(不含絲裂霉素C)，用移液槍吹勻細(xì)胞，然后分至2-4個(gè)鋪有明膠的步驟 (1)所述的Φ60πιπι平皿中，加入新鮮STO培養(yǎng)液(不含絲裂霉素C)至4ml，并用移液槍將培養(yǎng)液均勻分散處理的細(xì)胞；(6)處理后的STO細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，即可作為精原干細(xì)胞的飼養(yǎng)層。3、精原干細(xì)胞的培養(yǎng)、建系37V,5% CO2條件下，于STO飼養(yǎng)層上培養(yǎng)精原干細(xì)胞，其中精原干細(xì)胞培養(yǎng)液的加入量，應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)孔或培養(yǎng)皿的大小決定，同時(shí)，為了維持該精原干細(xì)胞的特性，在精原干細(xì)胞的培養(yǎng)液中還需要加入其他特殊的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如LIF，胰島素，EGF,⑶NF，bFGF 等，具體配制詳見(jiàn)第一步。通常，24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500 μ 1精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，而 Φ60mm培養(yǎng)平皿中，需要加入2ml精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)每48小時(shí)換液1次，5-7天傳代 1次。細(xì)胞傳代方法傳代之前必須要制備新的STO飼養(yǎng)層細(xì)胞，詳見(jiàn)第2步操作。小心移去舊的精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0. 5ml 0. 25%胰蛋白酶清洗細(xì)胞表面，然后移去胰蛋白酶；加入Iml 0. 25%胰蛋白酶，置于37°C培養(yǎng)箱，時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5min，等到細(xì)胞約一半脫落時(shí)，加入3ml 新鮮精原干細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化；用移液槍輕輕吹散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管，IOOOrpm離心 5min,棄去上清液；加入2ml新鮮精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液槍吹散細(xì)胞，然后分至2_4個(gè)含有新處理的STO飼養(yǎng)層細(xì)胞的Φ60πιπι平皿中；各平皿加入新鮮精原干細(xì)胞培養(yǎng)液至4ml，并用移液槍將培養(yǎng)液均勻分散于整個(gè)平皿。圖1的(a)顯示了培養(yǎng)在絲裂霉素C處理過(guò)的 STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上24小時(shí)后的成年精原干細(xì)胞形態(tài)(箭頭所示)。(b)顯示培養(yǎng)4個(gè)月后， 典型的精原干細(xì)胞簇和克隆的形態(tài)。比例尺10μπι in (a) ；50ymin(b)o4、小鼠精原干細(xì)胞系的移植(1)受體小鼠的準(zhǔn)備針對(duì)4-6周齡雄性小鼠，按40mg/kg劑量腹腔注射白消安(Busulfan，Sigma公司)。注射后，混合飼料喂養(yǎng)至少4周，存活小鼠睪丸生精功能被破壞，可作為受體鼠進(jìn)行精原細(xì)胞移植。(2)精原干細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備用0. 25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)物(為培養(yǎng)了 40代的細(xì)胞)，轉(zhuǎn)移漂浮細(xì)胞至離心管，1，OOOrpm離心收集精原干細(xì)胞細(xì)胞，加入冷的滅菌PBS緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為約 IO3/μ 1。(3)精原干細(xì)胞的移植按75mg/kg劑量，腹腔注射巴比妥鈉麻醉雄鼠。用75%酒精棉球擦洗小鼠身體，沿腹中線附近切開(kāi)腹腔，擠出睪丸，用毛細(xì)玻璃管將細(xì)胞懸液多點(diǎn)注入小鼠曲細(xì)精管內(nèi)，注意避免傷及血管。注射完畢后，將睪丸還入腹腔，縫合切口。移植兩個(gè)月后，將術(shù)后雄鼠與雌鼠合籠。結(jié)果顯示將來(lái)自精原干細(xì)胞系的精原干細(xì)胞移植于不孕雄性小鼠曲細(xì)精管內(nèi)，經(jīng)體內(nèi)分化產(chǎn)生精子，與雌性小鼠交配產(chǎn)生小鼠后代，見(jiàn)圖2，3。圖2顯示了精原干細(xì)胞移植 12周后的睪丸切片，見(jiàn)有精子發(fā)生，比例尺40μπι。圖3顯示了 C57BL/6來(lái)源的成年小鼠精原干細(xì)胞系移植入C57BL/6 X⑶-1 Fl代受體小鼠后，與純種OT-I小鼠交配，并產(chǎn)生的后代。母親為純白色，后代均為黑色。實(shí)施例2獲得過(guò)量表達(dá)STPB-C的基因工程小鼠步驟一，pFB-STPBC載體構(gòu)建及重組病毒的收集1、pFB-STPBC 載體的構(gòu)建(1)目的基因片段的準(zhǔn)備pCMV-STPB-C質(zhì)粒以Hind III和BamH I雙酶切后，1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并切下含目的基因片段的電泳帶，用QIAEX-II Gel Extraction Kit從瓊脂糖凝膠中回收純化STPB-C編碼基因片段，重懸于TE溶液(500ml TE溶液中含有l(wèi)Ommol/L Tris-HCl (pH = 8. 0) 6. 057g,與 lmmol/L EDTA (pH = 8. 0) 1. 8612g)中。(2)載體的準(zhǔn)備將真核細(xì)胞表達(dá)載pFB-neo質(zhì)粒以HindIII和BamH I雙酶切。通過(guò)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切下含線性載體的電泳帶，凝膠回收純化，重懸于TE溶液中。(3)重組質(zhì)粒的連接 將酶切回收的目的基因片段和線性pFB-neo質(zhì)粒用T4 DNA連接酶連接(16°C，過(guò)夜)。(4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌用熱休克法將重組質(zhì)粒和陰性對(duì)照空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO，接種于含氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)平皿，37°C恒溫箱過(guò)夜。隨機(jī)挑取平皿上的單個(gè)菌落， 接種于含Amp的4ml LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖過(guò)夜。通過(guò)PCR方法進(jìn)行重組子的篩選，陽(yáng)性結(jié)果送至測(cè)序，進(jìn)一步分析確定。2、重組病毒顆粒的收集取一個(gè)滅菌的EP管 ，加入3yg pFB-STPBC重組質(zhì)粒、3yg pVPack-GP(gag-pol-expressing vector)禾口 3 μg ρVPack-VSV-G(env-expressing vector)，再加入Iml無(wú)水乙醇和0. 1倍體積的NaAc (3M)。用移液槍混勻后，置于_30°C共沉淀過(guò)夜。將混合質(zhì)粒于4°C，12，OOOrpm離心lOmin，棄去上清液。然后加入Iml 70%乙醇，12，OOOrpm離心5min，棄去上清液。將混合質(zhì)粒保存于4°C，過(guò)夜。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞a.觀察Φ60πιπι細(xì)胞培養(yǎng)平皿中293T細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%平皿時(shí)，方可用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。b.移去舊的培養(yǎng)液，加入4ml含MBS[來(lái)自 Stratagene公司的ViraPack Transfection kit (病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑盒))的新鮮培養(yǎng)液，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。c.取出含混合質(zhì)粒的離心管，加入450 μ 1滅菌超純水，再加入 50 μ 1 Solution I 和 500 μ 1 Solution II [Solution I 和 II 分別來(lái)自 Stratagene 公司的 ViraPack Transfection kit (病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑盒)]，用移液槍輕輕地混勻后，室溫靜置 IOmin0 d.取出培養(yǎng)的293T細(xì)胞，將上述液體加入到培養(yǎng)皿中，輕輕的搖晃平皿，注意不要將細(xì)胞漂浮。再將新細(xì)胞放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。e.3h后，移去平皿中的液體，加入4ml含25μΜ chloroquine的培養(yǎng)液。f. 6h后，再移去平皿中的液體，加入4ml不含chloroquine的培養(yǎng)液；收集病毒顆粒收集培養(yǎng)上清，用0. 45 μ m微孔濾器過(guò)濾至滅菌離心管中，立即置于液氮中，而后置于-70°C長(zhǎng)期保存。步驟二，pFB-STPBC病毒顆粒感染精原干細(xì)胞根據(jù)實(shí)施例1所述小鼠精原干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)精原干細(xì)胞4d后，將 STPB-C過(guò)表達(dá)載體病毒顆粒感染該細(xì)胞。感染方法如下(1)從-70°C低溫冰箱中取出上述方法制備的含STPB-C載體病毒顆粒培養(yǎng)液，置于37°C水浴中溶解。(2)溶解后迅速加入 DEAE ( 二乙基-2-羥基乙胺)至終濃度為10 μ g/ml。(3)移去干細(xì)胞培養(yǎng)皿中舊的培養(yǎng)液， 加入上述含病毒顆粒與DEAE的培養(yǎng)液(24孔培養(yǎng)板每孔加200 μ 1含病毒顆粒培養(yǎng)液)。 (4)3h后向24孔培養(yǎng)板每孔補(bǔ)加200 μ 1新鮮干細(xì)胞培養(yǎng)液。步驟三，精原干細(xì)胞移植1、受體小鼠的準(zhǔn)備對(duì)4-6周齡雄性小鼠按40mg/kg劑量腹腔注射白消安(Busulfan，Sigma公司)， 混合飼料喂養(yǎng)至少4周后，存活小鼠睪丸生精功能被破壞，作為受體鼠進(jìn)行精原細(xì)胞移植。2、pFB-STPBC病毒顆粒感染的精原干細(xì)胞細(xì)胞懸液準(zhǔn)備用0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)移漂浮細(xì)胞至離心管，1，OOOrpm離心收集細(xì)胞，加入冷的滅菌PBS緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約為IO3/μ 1。3、上述精原干細(xì)胞手術(shù)移植按75mg/kg劑量，腹腔注射巴比妥鈉麻醉雄鼠。用75%酒精棉球擦洗小鼠身體，沿腹中線附近切開(kāi)腹腔，擠出睪丸，并用毛細(xì)玻璃管將細(xì)胞懸液多點(diǎn)注入小鼠曲細(xì)精管內(nèi)，注意避免傷及血管。注射完畢后，將睪丸納入腹腔，縫合切口。移植兩個(gè)月后，將術(shù)后雄鼠與雌鼠合籠。
結(jié)果表明精原干細(xì)胞移植于3只不育雄性小鼠曲細(xì)精管內(nèi)，兩只獲得生育，共產(chǎn)生46只后代，經(jīng)PCR檢測(cè)以及Southern雜交進(jìn)一步證實(shí)，其中2只為STPB-C轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性后代，見(jiàn)圖4、5。其中圖4為PCR檢測(cè)的STPB-C轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠，M DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P 陽(yáng)性對(duì)照；2和7 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠；1，3，4，5，6，8，9和10 野生型小鼠。圖5為Southern雜交驗(yàn)證STPB-C轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠；M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P 陽(yáng)性對(duì)照；N 陰性對(duì)照；1和3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠；2，4，5和6 野生型小鼠。實(shí)施例3 對(duì)培養(yǎng)的精原干細(xì)胞的驗(yàn)證1、精原干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染根據(jù)本發(fā)明所述方法進(jìn)行體外分離并培養(yǎng)精原干細(xì)胞大約4天后，將表達(dá)目的基因或RNAi的DNA片段通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞。2、受體動(dòng)物的準(zhǔn)備受體動(dòng)物可分為先天不育和后天施用藥物導(dǎo)致不育兩種。對(duì)于正常動(dòng)物生精能力的破壞，目前多使用的是白消安(Busulfan，甲磺酸丁二醇二酯)，其作用機(jī)理是白消安能使DNA烷基化，從而破壞受體精原干細(xì)胞的增殖。因而通過(guò)注射白消安至少4周后可進(jìn)行移植，白消安的用量根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大小確定。3、精原干細(xì)胞的移植本發(fā)明采用曲細(xì)精管注射法來(lái)完成精原干細(xì)胞的移植。本方法是用手術(shù)顯微鏡注射裝置，將經(jīng)過(guò)基因改造的細(xì)胞系直接注射到受體動(dòng)物的曲細(xì)精管。注射完畢，縫合傷口， 消炎看護(hù)，保證成活率。曲細(xì)精管注射法比較簡(jiǎn)單，容易掌握。移植后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間雄鼠與雌鼠交配，可獲得經(jīng)過(guò)基因改造的子代小鼠。結(jié)果顯示STPB-C基因沉默的精原干細(xì)胞分次植入5只不育雄性小鼠曲細(xì)精管內(nèi)， 5只全部生育，共產(chǎn)生82只子代小鼠。通過(guò)PCR方法篩選并將其PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證，檢測(cè)到5只STPB-C基因沉默的陽(yáng)性小鼠(見(jiàn)圖6)。圖6顯示PCR檢測(cè)STPB-C基因沉默小鼠； M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P 陽(yáng)性對(duì)照；6，7，8，9和13 :STPB_C基因沉默小鼠；1，2，3，4，5，10，11， 12，14，15和16 野生型小鼠。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等同物界定。
權(quán)利要求
1.小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備細(xì)胞懸液；步驟二，利用免疫磁珠分選法分離出精原干細(xì)胞；步驟三，制備精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)精原干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟一中，所述免疫磁珠分選法使用的磁珠為T(mén)hyl磁珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述 Thyl磁珠為CD90。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟三中，所述原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)時(shí)加入STO細(xì)胞飼養(yǎng)層。
5.如權(quán)利要求1所述的小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法所使用的培養(yǎng)基，其特征在于，由STO細(xì)胞飼養(yǎng)層和精原干細(xì)胞培養(yǎng)液組成，所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液包括MEM- α、 FBS、L-谷氨酰胺、LIF、bFGF、胰島素、維生素C、EGF、⑶NF。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液還包括非必需氨基酸、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉中的一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述FBS的體積百分含量為8% -10 %， 所述LIF的含量為102-104U/ml，所述bFGF的含量為0. 02-0. 03 μ g/ml，所述IGF-IR激活劑的含量為0. 04-0. 06 μ g/ml，所述EGF的含量為0. 01-0. 02 μ g/ml，所述維生素C的含量為 40-60 μ g/ml，所述 GDNF 的含量為 0. 01-0. 02 μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供小鼠精原干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟步驟一，收集小鼠睪丸，采用兩步酶消化法制備細(xì)胞懸液；步驟二，利用免疫磁珠分選法分離出精原干細(xì)胞；步驟三，制備精原干細(xì)胞的培養(yǎng)液，對(duì)精原干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。本發(fā)明還提供所述方法使用的培養(yǎng)基，由STO細(xì)胞飼養(yǎng)層和精原干細(xì)胞培養(yǎng)液組成，所述精原干細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS、氨基酸、LIF、bFGF、IGF-1R激活劑、維生素C、EGF、GDNF。利用本發(fā)明的方法和培養(yǎng)基，可使來(lái)源于幼體或成體小鼠的精原干細(xì)胞均能夠在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并增殖，能夠建立長(zhǎng)期維持穩(wěn)定生長(zhǎng)的精原干細(xì)胞系，并且維持其精子發(fā)生的功能。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便，安全可靠，成本低廉。
文檔編號(hào)C12N5/076GK102382799SQ20101026993
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者吳際 申請(qǐng)人:吳際