專利名稱：用于治療影響神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的病癥的藥用產(chǎn)品及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)藥用產(chǎn)品的物質(zhì)，所述物質(zhì)給予患者時使生長激素濃度增加。
本發(fā)明還涉及治療影響神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的病癥的方法。
背景技術(shù)：
人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的創(chuàng)傷性、窒息性、缺氧性、局部缺血性、中毒性、感染性、退化性或代謝性損傷可引起幾種不同細(xì)胞類型某種程度的損害。創(chuàng)傷、窒息、毒素、局部缺血或感染對大腦的損害常常引起神經(jīng)病性缺陷和認(rèn)知性缺陷。退化性疾病可引起特定細(xì)胞群的喪失。如帕金森氏病與黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元的特異性喪失有關(guān)，同樣，多發(fā)性硬化癥與髓磷質(zhì)和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的喪失有關(guān)。特定類型神經(jīng)元的選擇性喪失引起的退化性病癥的其它實例為與膽堿能神經(jīng)元喪失有關(guān)的Alzheimer病。還有許多CNS損傷或疾病能引起少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞損害的其它情況。
此外，已發(fā)現(xiàn)少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達的表面分子抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)束中軸索損傷和脊髓損傷后軸索的再生和萌芽。
祖細(xì)胞隨如表皮生長因子(EGF)的生長因子生長和繁殖，表皮生長因子屬于不同于GH的一類物質(zhì)。
總而言之，哺乳動物腦組織變性或損害后沒有替換神經(jīng)元的特性。因此認(rèn)為神經(jīng)元的喪失是永久性的。關(guān)于海馬結(jié)構(gòu)的粒細(xì)胞層描述了出生后神經(jīng)發(fā)生延長(Altman，J.和Das，G.D.，J.Comp.Neurol.124319-335(1965)；Altman，J.和Das，G.D.，Nature 2141098-1101(1967)；Caviness，V.S.Jr.，J.Comp Neurol.151113-120(1973)；Gueneau，G.，Privat，A.，Drouet，J.和Court，L.，Dev.Neurosci.5，345-358(1982)；Eckenhoff，M.F.和Rakic，P.，J.Neurosci.82729-2747(1988))。最近證實人類神經(jīng)發(fā)生一直持續(xù)到成人期(Eriksson，P.S.，Perfilieva，E.，Rjrk-Eriksson，T.，Alborn，A.，Nordborg，C.，Peterson，D.A.，Gage，F(xiàn).H.，Nature Med.出版中)。神經(jīng)元祖細(xì)胞位于齒狀回的分顆粒區(qū)(subgranularzone，SGZ)，在此它們持續(xù)增殖、移行入粒細(xì)胞層中并分化成各種粒細(xì)胞(Kuhn，H.，Dickinson-Anson，H.和Gage，F(xiàn).H.，J.Neurosci.162027-2033(1996)；Cameron，H.A，Wooley，C.S.，McEwen，B.S.和Gould，E.，Neuroscience 56337-344(1933)；Seki，T.和Arai，Y.，J.Neurosci.132351-2358(1933))。所述粒細(xì)胞層中的這些新生神經(jīng)元表達分化的神經(jīng)元的標(biāo)志物并具有相當(dāng)于分化的各類粒細(xì)胞的形態(tài)特點(Kaplan，M.S.和Bell，D.H.，J.Neurosci.41429-1411(1984)；Cameron，H.A.，Woolley，C.S.，McEwen，B.S.和Gould，E.Neuroscience 56337-344(1993)；Cameron，H.A.，Woolley，C.S.和Gould，E.，Brain Res.611342-346(1993))。此外，它們將軸索過程轉(zhuǎn)換成苔鮮纖維途徑并與其海馬CA3的靶組織形成突觸連接(Seki，T.和Arai，Y.，J.Neurosci.132351-2358(1993)；Stanfield，B.B.和Trice，J.E.Exp.Brain Res.72399-406(1988)。海馬與空間感知和記憶有關(guān)(McNamara，R.K.和Skelton，R.W.，Brain Res.Rev.1833-49(1993))。給予n-甲基-d-天門冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑或去除腎上腺可影響祖細(xì)胞的增殖(Cameron，H.A.和Gould，E.Neuroscience 61203-209(1994)；Cameron，H.A.，Tanapat，P.和Gould，E.，Neuroscience 82349-354(1998))。隨著年齡增長可塑性降低，并且最近的研究證實，隨年齡增長祖細(xì)胞的增殖也減少但不是完全消除(Kuhn，H.，Dickinson-Anson，H.和Gage，F(xiàn).H.，J.Neurosci.162027-2033(1996))。最近將從成年嚙齒動物腦中分離的干細(xì)胞移植到成年動物的腦中，在成年動物腦中這些干細(xì)胞分化成具有神經(jīng)元特點的細(xì)胞(Suhonen，J.O.，Peterson，D.A.，Ray，J.和Gage，F(xiàn).H.，Nature 383624-627(1996)。
此外，已表明豐富環(huán)境促進幼鼠齒狀回的神經(jīng)發(fā)生。表明處于豐富環(huán)境導(dǎo)致新形成的粒細(xì)胞神經(jīng)元存活數(shù)量增加，以及齒狀回神經(jīng)元總數(shù)增加(Kempermann，G.，Kuhn，H.G.和Gage，F(xiàn).H.，Nature 386493-495(1997))。
發(fā)明概述目前發(fā)現(xiàn)使用生長激素或其類似物或另一種導(dǎo)致生長激素或其類似物濃度增加的物質(zhì)，調(diào)節(jié)來自成人CNS的神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖和/或分化是可能的。因此本發(fā)明提供治療主要影響少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新的可能性，所述治療調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中增殖細(xì)胞的發(fā)生和/或神經(jīng)元干細(xì)胞或祖細(xì)胞的分化。
還發(fā)現(xiàn)控制干細(xì)胞、祖細(xì)胞和具有產(chǎn)生神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞潛力的其它細(xì)胞、特別是源自中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的體外增殖是可能的。此類細(xì)胞可例如用于患者的治療。
因此，本發(fā)明涉及使用一種物質(zhì)的生產(chǎn)治療影響神經(jīng)干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的病癥的藥用產(chǎn)品，所述物質(zhì)給予患者時將使生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆餄舛仍黾印?br>
本發(fā)明還涉及治療影響神經(jīng)干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的病癥的方法，此方法中，給予患者將使生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆餄舛仍黾拥乃帉W(xué)有效量的物質(zhì)。
此外，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)祖細(xì)胞、干細(xì)胞和/或衍生自祖細(xì)胞、干細(xì)胞的細(xì)胞譜系定向(lineage determination)、繁殖和/或誘導(dǎo)或保持產(chǎn)生神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，該方法在體外給予干細(xì)胞、祖細(xì)胞、神經(jīng)元星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和/或少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有效量的生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆铩?br>
本發(fā)明的另一方面涉及緣于CNS中生長激素濃度過高引起的CNS病癥。
因此本發(fā)明還涉及使用一種物質(zhì)生產(chǎn)治療影響干細(xì)胞、祖細(xì)胞和/或衍生自干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞的病癥的藥用產(chǎn)品的方法，所述物質(zhì)給予患者時將使生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆餄舛认陆?，以及本發(fā)明涉及減少患者中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中的或衍生自中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的祖細(xì)胞或干細(xì)胞產(chǎn)生少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法，其中給予所述患者藥學(xué)有效量的使生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆餄舛冉档偷奈镔|(zhì)。
由以下描述和所附權(quán)利要求書可了解本發(fā)明的特征性特點。
本發(fā)明詳述包括人腦在內(nèi)的哺乳動物的腦組織終生保持其在腦的某些區(qū)域產(chǎn)生神經(jīng)元的能力。新的神經(jīng)元和星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞由干細(xì)胞或祖細(xì)胞通過細(xì)胞發(fā)生產(chǎn)生。在完成本發(fā)明的研究過程中發(fā)現(xiàn)生長激素(以下以GH表示)使成年腦中從祖細(xì)胞/干細(xì)胞的細(xì)胞發(fā)生增加。還發(fā)現(xiàn)海馬新生細(xì)胞數(shù)量的增加與學(xué)習(xí)和記憶的改善有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)使得我們認(rèn)識到通過控制存在于所述細(xì)胞周圍環(huán)境中的GH含量，控制患者神經(jīng)病學(xué)缺陷如記憶和學(xué)習(xí)缺陷是可能的。
因此發(fā)現(xiàn)通過增加包括神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞衍生細(xì)胞數(shù)量治療創(chuàng)傷后CNS損傷或缺陷是可能的。
還發(fā)現(xiàn)通過提高患者GH濃度以誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖和/或分化，同時增加細(xì)胞發(fā)生，從而增加患者包括神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞衍生細(xì)胞的數(shù)量，治療CNS損傷后所引起的神經(jīng)損傷是可能的。
最后發(fā)現(xiàn)通過提高患者GH濃度以誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖和/或分化，同時增加細(xì)胞產(chǎn)生，從而增加患者包括神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞衍生細(xì)胞的數(shù)量，以便有助于通過手術(shù)切除分離含所述細(xì)胞的腦組織小樣本，以進一步在體外擴增，并再移植入所述患者體內(nèi)，而治療CNS損傷后所引起的神經(jīng)損傷是可能的。
因此，本發(fā)明涉及使用一種物質(zhì)生產(chǎn)治療影響神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞和/或衍生自神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞的病癥的藥用產(chǎn)品，所述物質(zhì)給予患者時將使生長激素或其類似物濃度增加，以及本發(fā)明涉及治療影響神經(jīng)干細(xì)胞、祖細(xì)胞和/或衍生自神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞的病癥的方法，其中給予患者使生長激素濃度增加的藥學(xué)有效量的一種物質(zhì)。
使生長激素濃度增加的物質(zhì)或其類似物可以為例如生長激素本身或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆?。術(shù)語“其功能相當(dāng)?shù)念愃莆铩鄙婕八挟?dāng)給予患者時具有與GH基本相同的生物學(xué)和藥理學(xué)作用的物質(zhì)。這樣的類似物可以是例如合成的GH模擬物。也可以使用一種化合物，所述化合物當(dāng)給予患者時例如通過使內(nèi)源性GH釋放增加，從而使患者CNS的GH或天然GH類似物或其介質(zhì)(mediator)的有效濃度增加。例如，可使用正向調(diào)節(jié)GH結(jié)合蛋白，如GH釋放物質(zhì)生長激素釋放肽(GHRP)及其類似物。
按照本發(fā)明的藥用產(chǎn)品最好是所述活性物質(zhì)包含于諸如本領(lǐng)域已知的那些藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中。
按照本發(fā)明使用的所述藥用產(chǎn)品或物質(zhì)優(yōu)選通過靜脈內(nèi)外周輸注或通過肌內(nèi)或皮下注射給予患者。還可以通過手術(shù)插入的分流管將所述藥用產(chǎn)品或藥用活性物質(zhì)給予到患者腦室。
優(yōu)選皮下給予的所述藥學(xué)活性物質(zhì)劑量為每周約0.01-1IE/kg患者體重。
本文所用術(shù)語“患者”是指需要按照本發(fā)明的治療的任何人或非人類哺乳動物。
本文所用術(shù)語“治療”既指治愈或減輕疾病或病癥的治療，又指防止疾病或病癥發(fā)生的治療。術(shù)語治療還指CNS或PNS(周圍神經(jīng)系統(tǒng))神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷后，通過誘導(dǎo)神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生，影響由干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞發(fā)生，或者指阻止CNS或PNS中生理性年齡相關(guān)的衰退，該術(shù)語還指培養(yǎng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞并移植入患者CNS或PNS。所述治療可以急性方式進行或以長期治療的方式進行。
如上所述，按照本發(fā)明使用的藥學(xué)活性物質(zhì)適用于治療影響神經(jīng)干細(xì)胞、祖細(xì)胞和/或衍生自神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞的異常病癥。因此該物質(zhì)可用來預(yù)防、治療或改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的損傷、病癥或缺陷。按照本發(fā)明使用的藥學(xué)活性物質(zhì)尤其適合治療影響少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和/或神經(jīng)元細(xì)胞的病癥。此類病癥可以是諸如CNS損傷或缺陷、神經(jīng)元細(xì)胞喪失或記憶喪失。此類病癥可由許多不同因子或疾病引起，如多發(fā)性硬化癥、缺氧性損傷、局部缺血性損傷、創(chuàng)傷性損傷、帕金森氏病及脫髓鞘病。
按照本發(fā)明使用的藥學(xué)活性物質(zhì)的作用緣于該物質(zhì)具有誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中或來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的祖細(xì)胞衍生細(xì)胞的細(xì)胞發(fā)生或繁殖和/或分化的能力。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，可以使用生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆镆员阍诮M織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)中繁殖祖細(xì)胞或干細(xì)胞或其它神經(jīng)細(xì)胞。因此這類細(xì)胞可用于將細(xì)胞移植入罹患神經(jīng)元細(xì)胞喪失或這類內(nèi)源性細(xì)胞缺乏引起的病癥。用來開始培養(yǎng)的細(xì)胞可來源于患者自身或動物供體。
當(dāng)需要從患者體內(nèi)取出細(xì)胞進行體外繁殖時，可能最好首先增加患者體內(nèi)祖細(xì)胞的數(shù)量。這樣有助于隨后從患者體內(nèi)分離所述細(xì)胞。使用本發(fā)明的方法或藥用產(chǎn)品可提高祖細(xì)胞的數(shù)量，即使用給予患者時使生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆餄舛仍黾拥奈镔|(zhì)。
生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆锟蓡为毷褂没蚺c其它藥物或設(shè)計用于誘導(dǎo)CNS或PNS的細(xì)胞發(fā)生或細(xì)胞增殖的生長因子如表皮生長因子(EGF)或成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)聯(lián)合使用。生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆锟蓡为毷褂?，或與其它藥物、肽類、生長因子、類固醇類、脂質(zhì)、糖基化蛋白或肽類或者同時或依次聯(lián)合使用，以便促進體外或體內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生或特殊細(xì)胞類型的產(chǎn)生。生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆镞€可用于誘導(dǎo)未成熟細(xì)胞或多潛能細(xì)胞激活特異性發(fā)育程序及前述細(xì)胞中的特異性基因。
以上所述細(xì)胞發(fā)生是指在成人CNS或PNS中或體外從多潛能細(xì)胞、祖細(xì)胞或干細(xì)胞產(chǎn)生諸如神經(jīng)元少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞許旺氏細(xì)胞及星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的新細(xì)胞。
此外，本發(fā)明還涉及降低患者活性GH或天然GH類似物含量，并因此減少軸索或脊髓損傷患者少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生的物質(zhì)的治療用途。此類物質(zhì)的實例為負(fù)向調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白、GH受體拮抗劑、藥物或抗體或化合物或肽類。已表明少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達的某些分子抑制軸索再生和脊髓損傷。而且，還可使用增加內(nèi)源性肽類的藥物或抗體或化合物或肽類，或者降低內(nèi)源性GH生物活性的蛋白質(zhì)。
如果閱讀下列實施例，將對本發(fā)明有更全面的了解。但是不應(yīng)認(rèn)為這些實施例限制本發(fā)明的范疇。
附圖簡述以下實施例中，涉及附圖，其中
圖1顯示與只用氫化可的松(C)和L-甲狀腺素(T)處理的垂體切除(Hx)的大鼠及對照組大鼠相比，按照本發(fā)明用生長激素(GH)和C以及T處理7天后的垂體切除大鼠齒狀回中BrdU-陽性細(xì)胞的密度。
圖2顯示最后一次用BrdU注射垂體切除動物后4周，按照本發(fā)明用可的松、甲狀腺素和GH處理的動物，比只用可的松和甲狀腺素處理的垂體切除動物的粒細(xì)胞神經(jīng)元明顯增加。
圖3顯示，與對照組(●)相比，按照本發(fā)明新生細(xì)胞數(shù)增加的動物(○)在用于測定空間行為的平臺隱藏型水迷宮作業(yè)中具有明顯更好的表現(xiàn)。
實施例在此實施例中，將按照本發(fā)明用生長激素(GH)、氫化可的松(C)和L-甲狀腺素(T)處理的垂體切除(Hx)大鼠齒狀回中BrdU-陽性細(xì)胞的密度，與用氫化可的松(C)和L-甲狀腺素(T)處理的垂體切除(Hx)大鼠齒狀回中BrdU-陽性細(xì)胞的密度以及與未處理未手術(shù)的對照組中BrdU-陽性細(xì)胞的密度作對比。
完整或50天齡切除垂體的Fisher大鼠(Harlan Sprague Dawley)保持在溫度(24-26℃)、濕度(50-60％)及燈光(0500-1900h)的標(biāo)準(zhǔn)條件下。
所述大鼠自由進食標(biāo)準(zhǔn)實驗食物和水。垂體切除后7-10天開始進行激素治療。所有垂體切除大鼠每日均皮下注射(在0800h)給予生理鹽水稀釋的氫化可的松磷酸鹽(400μg/kg/天；Solu-Cortef，Upjohn，Puurs，Belgium)和L-甲狀腺素(10μg/kg/天；Sigma，USA)。用pH8.6、含有1.6％甘油和0.02％疊氮化鈉的0.05M磷酸鹽緩沖液稀釋重組牛GH(bGH)。以24小時間隔每日一次皮下注射給予GH 1mg/kg/天。該治療持續(xù)7天。此后處死大鼠并取出腦組織，將其制備用于免疫組化。
10只垂體切除大鼠只用可的松和L-甲狀腺素替代。15只垂體切除大鼠用可的松(cortisole)、L-甲狀腺素和生長激素替代。將10只120g重的大鼠指定為對照組。在7天的治療期中，所有動物均每日腹膜內(nèi)注射溴脫氧尿苷(BrdU；Sigma)(50mg/kg體重)。該胸腺嘧啶核苷類似物BrdU在有絲分裂時加入遺傳物質(zhì)中，然后在所得細(xì)胞中通過免疫組化觀察該胸腺嘧啶核苷類似物BrdU。在第20天，通過致死劑量的麻醉劑處死并用4％多聚甲醛經(jīng)賁門(transcardially)灌注所有動物。取出腦組織并在4％多聚甲醛中后固定24小時，然后在30％蔗糖溶液中貯存。將冠狀冷凍切片機切得的切片(40μm)在-20℃下貯存于低溫防護劑(25％乙二醇、25％甘油、0.05M磷酸鹽緩沖液)中，直到作免疫組化或免疫熒光處理。
使用無系統(tǒng)誤差的計數(shù)技術(shù)，計數(shù)海馬齒狀回中的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。為檢測組織切片中BrdU標(biāo)記的細(xì)胞核，在用1∶400的小鼠抗-BrdU抗體(Boeringer Mannheim)溫育之前進行如下的DNA變性步驟于65℃下在50％甲酰胺/2×SSC(0.3M NaCl、0.03M檸檬酸鈉)中溫育2小時，以2×SSC輕洗5分鐘，在2N HCl中于37℃下溫育30分鐘，在pH8.5的0.1M硼酸中輕洗10分鐘。所有染色在自由漂浮的40mm切片上進行。將自由漂浮的切片用溶于tris緩沖鹽水(TBS)(0.15M NaCl、0.1M Tris-HCl，pH7.5)的0.6％H2O2處理30分鐘以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。在TBS中輕洗幾次之后，在TBS/0.25％Triton X-100/3％正常馬血清(TBS-TS)中溫育30分鐘，并于4℃下在TBS-TS中與一抗溫育過夜。在TBS-TS中輕洗之后，將切片用生物素化的馬抗小鼠IgG、1∶160的二抗(Vector Laboratories，USA)溫育3小時。TBS輕洗后涂覆抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物1小時，然后進行5分鐘的過氧化物酶檢測(0.25mg/ml二氨基聯(lián)苯胺、0.01％H2O2、0.04％NiCl)。
對于免疫熒光，如上所述處理切片以使DNA變性，接著在TBS-TS中溫育30分鐘。隨后將這些切片于4℃下用1∶2000的小鼠-抗-Calbindin-D28k(Sigma)溫育16小時，并用Texas紅偶聯(lián)的驢抗-小鼠IgG檢測。用FITC偶聯(lián)的兔抗-BrdU抗體檢測BrdU。使用聚焦掃描激光顯微鏡(Bio-Rad MRC 1024，Richmond，CA)檢測并處理熒光信號。
在包含齒狀回的相距240mm的7-9張冠狀切片中，檢測在粒細(xì)胞層、亞粒狀細(xì)胞層和齒狀核門(hilus)及其相應(yīng)樣品體積中的BrdU陽性細(xì)胞總數(shù)。按照光學(xué)解剖器方法進行細(xì)胞計數(shù)以避免取樣誤差。
結(jié)果見圖1。7天后，與只用可的松和甲狀腺素替代的動物相比，在用GH、可的松和甲狀腺素取代的垂體切除動物齒狀回中新生細(xì)胞數(shù)量明顯增加。而且，替代一周后，測得將GH給予氫化可的松和L-甲狀腺素處理的垂體切除動物后，細(xì)胞增殖速率顯著增加。這些結(jié)果清楚地表明GH提高了海馬齒狀回祖細(xì)胞的增殖速率。
此外，替代一周后，測得將GH給予氫化可的松和L-甲狀腺素處理的垂體切除動物后，細(xì)胞增殖速率顯著增加。這一結(jié)果提示GH影響海馬齒狀回祖細(xì)胞的增殖速率。
而且，與正常對照及與替代一周并在此后的3周未替代的垂體切除動物相比，用GH處理一周的正常動物的細(xì)胞增殖增加。用可的松和L-甲狀腺素或者用可的松、L-甲狀腺素和GH處理后一個月，評估BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果見表2。
該結(jié)果提示GH或者直接或者間接促進齒狀回中神經(jīng)細(xì)胞祖細(xì)胞增殖所產(chǎn)生的細(xì)胞的增殖或存活。
本發(fā)明的發(fā)明者首次表明生長激素能調(diào)節(jié)成年動物腦神經(jīng)元的增殖及隨后的增殖。
注射BrdU之后4周，連續(xù)4天檢測并比較新生細(xì)胞數(shù)增加的大鼠與新生細(xì)胞數(shù)較少的大鼠。用錄像跟蹤系統(tǒng)在水迷宮中檢測大鼠。監(jiān)測到達平臺的時間(潛隱期，latency)。救生平臺(escape platform)隱藏在水面下1cm處的固定位置。通過在水中加入干奶粉使之不透明。在整個實驗期間水溫保持恒定的22℃。每天檢測每只動物4次。每次試驗持續(xù)45秒。將未能在45秒內(nèi)發(fā)現(xiàn)隱藏平臺的動物潛隱期指定為45秒，并放置于平臺上，允許在平臺停留15秒。
用雙因素方差分析在水迷宮檢測期間發(fā)現(xiàn)平臺的潛隱期，并使用Scheffe F-檢驗對每次監(jiān)測的間隔時間進行重復(fù)性后比較檢驗(repeatedpostcomparative test)。結(jié)果見圖3。各小鼠在游泳速度上沒有顯著差別。顯然由于按照本發(fā)明處理而齒狀回新生細(xì)胞數(shù)量增多的動物，在空間感知任務(wù)中明顯完成得比較好。這些動物組的數(shù)據(jù)在圖中以○表示。新生細(xì)胞數(shù)較低大鼠的數(shù)據(jù)在圖中以●表示。
權(quán)利要求
1.一種物質(zhì)用于生產(chǎn)治療影響神經(jīng)干細(xì)胞、祖細(xì)胞和/或衍生自神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞的病癥的藥用產(chǎn)品的用途，其中所述物質(zhì)給予患者時使生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆餄舛仍黾印?br>
2.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述物質(zhì)為生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆铩?br>
3.按照權(quán)利要求1的用途，其中給予所述物質(zhì)將增加內(nèi)源性生長激素的釋放。
4.按照權(quán)利要求1-3任意一項的用途，其中所述病癥影響少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和/或神經(jīng)元細(xì)胞。
5.按照權(quán)利要求1-4任意一項的用途，其中所述病癥影響非膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞、膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
6.按照權(quán)利要求1-5任意一項的用途，其中所述病癥為CNS損傷或缺陷。
7.按照權(quán)利要求1-6任意一項的用途，其中所述病癥為神經(jīng)細(xì)胞喪失。
8.按照權(quán)利要求1-7任意一項的用途，其中所述病癥為記憶喪失。
9.按照權(quán)利要求1-8任意一項的用途，其中所述病癥由多發(fā)性硬化癥、缺氧性損傷、局部缺血性損傷、創(chuàng)傷性損傷、帕金森氏病和/或脫髓鞘病引起。
10.按照權(quán)利要求1-9任意一項的用途，其中所述藥用產(chǎn)品配制用于靜脈輸注、肌肉注射或皮下注射。
11.按照權(quán)利要求1-10任意一項的用途，其中配制所述藥用產(chǎn)品以便當(dāng)將所述藥用產(chǎn)品給予患者時，所述活性物質(zhì)將進入所述患者腦室中。
12.按照權(quán)利要求1-11任意一項的用途，其中配制所述藥用產(chǎn)品以便當(dāng)將所述藥用產(chǎn)品給予患者時，所述活性物質(zhì)將進入所述患者腦脊液中。
13.一種物質(zhì)用于生產(chǎn)治療影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病癥的藥用產(chǎn)品的用途，其中所述物質(zhì)給予患者時使生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆餄舛冉档汀?br>
14.按照權(quán)利要求13的用途，其中所述物質(zhì)為負(fù)向調(diào)節(jié)生長激素結(jié)合蛋白、其功能相當(dāng)?shù)念愃莆?、抗生長激素的抗體、生物活性生長激素受體抑制劑和/或內(nèi)源性生長激素釋放的抑制劑。
15.按照權(quán)利要求13或14的用途，其中所述病癥為由以下原因所致震蕩所致的軸索損傷、頭部創(chuàng)傷所致的軸索損傷、CNS小血管病所致的軸索損傷、疾病和/或創(chuàng)傷對脊髓的損傷。
16.一種方法，該方法通過給予體外干細(xì)胞、祖細(xì)胞、神經(jīng)元星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和/或少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有效量的生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆?，從而誘導(dǎo)譜系定向(lineage determination)、繁殖和/或誘導(dǎo)或保持由祖細(xì)胞、干細(xì)胞和/或衍生自所述細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
17.一種方法，該方法誘導(dǎo)譜系定向、或者誘導(dǎo)或保持由患者中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中的祖細(xì)胞或干細(xì)胞或衍生自患者中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的祖細(xì)胞或干細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其中給予所述患者藥學(xué)有效量的使生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆餄舛仍黾拥奈镔|(zhì)。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其中所述物質(zhì)為生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆铩?br>
19.按照權(quán)利要求17的方法，其中所述物質(zhì)為使內(nèi)源性生長激素釋放增加的物質(zhì)。
20.按照權(quán)利要求17的方法，用于治療影響患者神經(jīng)系統(tǒng)的病癥。
21.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥影響少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和/或神經(jīng)元細(xì)胞。
22.按照權(quán)利要求22的方法，其中所述病癥影響非膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞、膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
23.按照權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥為CNS損傷或缺陷。
24.按照權(quán)利要求23的方法，其中所述病癥為神經(jīng)細(xì)胞喪失。
25.按照權(quán)利要求23的方法，其中所述病癥為記憶喪失。
26.按照權(quán)利要求23的方法，其中所述病癥由至少一種源自多發(fā)性硬化癥、缺氧性損傷、局部缺血性損傷、創(chuàng)傷性損傷、帕金森氏病和脫髓鞘病的因素引起。
27.按照權(quán)利要求17的方法，其中通過靜脈內(nèi)輸注、肌肉注射或皮下注射給予所述物質(zhì)。
28.按照權(quán)利要求17的方法，其中所述給藥后從所述患者取出腦細(xì)胞，然后將所述腦細(xì)胞在體外增殖，接著將所獲得的細(xì)胞移植回所述患者腦中。
29.按照權(quán)利要求28的方法，其中在所述腦細(xì)胞體外增殖期間給予其有效量的生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆铩?br>
30.一種方法，該方法減少由患者中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中的祖細(xì)胞或干細(xì)胞或者衍生自患者中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的祖細(xì)胞或干細(xì)胞產(chǎn)生少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其中給予所述患者藥學(xué)有效量的使生長激素或其功能相當(dāng)?shù)念愃莆餄舛认陆档奈镔|(zhì)。
31.按照權(quán)利要求30的方法，其中將所述物質(zhì)給予到所述患者的外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
32.按照權(quán)利要求30的方法，其中所述物質(zhì)選自負(fù)向調(diào)節(jié)生長激素的結(jié)合蛋白、其功能相當(dāng)?shù)念愃莆?、抗生長激素的抗體、生物活性的生長激素受體抑制劑以及內(nèi)源性GH釋放抑制劑。
33.按照權(quán)利要求30的方法，用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
34.按照權(quán)利要求33的方法，其中所述損傷為由源自以下的一種因素所致震蕩所致的軸索損傷、頭部創(chuàng)傷所致的軸索損傷、CNS小血管病所致的軸索損傷、疾病或創(chuàng)傷后對脊髓的損傷。
全文摘要
一種物質(zhì)用于生產(chǎn)治療影響神經(jīng)干細(xì)胞、祖細(xì)胞和/或衍生自神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的細(xì)胞的病癥、特別是影響少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和/或神經(jīng)元細(xì)胞的病癥的藥用產(chǎn)品的用途,其中所述物質(zhì)給予時使諸如生長激素、其功能相當(dāng)?shù)念愃莆锏纳L激素濃度增加,或者所述物質(zhì)使內(nèi)源性生長激素釋放增加。通過給予所述細(xì)胞一種增加生長激素濃度的物質(zhì),從而體外或體內(nèi)誘導(dǎo)譜系定向、繁殖和/或誘導(dǎo)或保持由祖細(xì)胞、干細(xì)胞和/或衍生自祖細(xì)胞、干細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法。本發(fā)明還公開了減少由祖細(xì)胞或干細(xì)胞產(chǎn)生少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法,其中給予所述患者藥學(xué)有效量的使生長激素或其功能相當(dāng)類似物濃度降低的物質(zhì)。
文檔編號A61P25/28GK1333691SQ99815708
公開日2002年1月30日 申請日期1999年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月25日
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