專利名稱：前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及光激發(fā)偶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體是一種前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
1971年，Hara等人首先發(fā)現(xiàn)前列腺特異抗原(prostate specific antigen ,PSA)，它由前列腺上皮細(xì)胞合成并分泌至精液中，是精漿的主要成分之一。前列腺特異抗原具有器官特異性，僅存在于前列腺上皮細(xì)胞、導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)和黏液內(nèi)，具有糜蛋白酶樣和胰蛋白酶的活性。正常情況下，前列腺腺泡與淋巴系統(tǒng)之間存在由內(nèi)皮層、基細(xì)胞層和基底膜構(gòu)成的屏障相隔，外周血中不會出現(xiàn)前列腺特異抗原。當(dāng)發(fā)生腫瘤或其它病變時，破壞前列腺和淋巴系統(tǒng)組織間屏障，富含前列腺特異抗原的腺泡內(nèi)容物漏入淋巴系統(tǒng)，并相 繼進(jìn)入血液循環(huán)，使外周血中前列腺特異抗原升高。前列腺特異抗原是目前公認(rèn)的唯一具有器官特異性的血清腫瘤標(biāo)志物。血清前列腺特異抗原升高一般提示前列腺存在病變(前列腺炎、良性前列腺增生、前列腺癌)。檢測血清或血漿前列腺特異抗原含量，不僅可在高危人群中早期發(fā)現(xiàn)前列腺癌，同時也可用于前列腺癌患者治療后的監(jiān)控、手術(shù)治療效果評估等方面。前列腺特異抗原具有良好的免疫原性，能制備特異性抗體并通過免疫化學(xué)原理進(jìn)行測定。標(biāo)記免疫分析根據(jù)標(biāo)記物不同分為放射免疫分析、酶免疫分析和發(fā)光免疫分析，血 清前列腺特異抗原主要采用酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。無論采用何種分析方式，其檢測原理基本相同，即采用雙抗體夾心法測定未知前列腺特異抗原將其中一種抗體與固相載體連接作為捕獲抗體，用于捕獲待測標(biāo)本中前列腺特異抗原；將另一種抗體與示蹤物質(zhì)(辣根過氧化物酶或三聯(lián)吡啶釕)結(jié)合作為標(biāo)記(檢測)抗體，當(dāng)標(biāo)記抗體與前列腺特異抗原結(jié)合后，在固相載體表面形成捕獲抗體-待測抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物。將固相載體洗漆,去除過剩標(biāo)記物或未參加反應(yīng)的成分；酶免疫分析通過加入底物，通過酶促反應(yīng)強(qiáng)度，對未知抗原進(jìn)行定量分析。而電化學(xué)發(fā)光再加入三丙胺與電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，通過光信號對未知抗原進(jìn)行定量分析。
酶免疫分析檢測前列腺特異抗原的主要優(yōu)勢表現(xiàn)在檢測試劑已實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化、酶標(biāo)儀普及程度高；因此，酶免疫分析具有較低檢測成本，能夠在基層醫(yī)院開展工作。但是，由于采用辣根過氧化物酶作為示蹤物質(zhì)，穩(wěn)定性較差且酶活性干擾因素較多，導(dǎo)致酶免疫分析的精密度不夠理想。此外，酶免疫分析采用微孔反應(yīng)板作為固相材料，由于包被抗體的限制，不能實(shí)現(xiàn)理想檢測范圍。電化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前檢測性能較高標(biāo)記免疫分析技術(shù)，具有較高的自動化水平，較高的檢測性能(敏感度、精密度、穩(wěn)定性等方面)。但是，電化學(xué)發(fā)光檢測儀昂貴，檢測試劑依賴進(jìn)口，從而使檢測成本很高，且基礎(chǔ)醫(yī)療單位很難開展。基于上述原因，酶免疫分析法主要用于前列腺癌高危人群的篩查，而電化學(xué)發(fā)光免疫分析主要用于前列腺癌患者確診和手術(shù)治療效果評估以及監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)等方面。
在標(biāo)記免疫分析中，由于標(biāo)記抗體(或抗原)在反應(yīng)體系中是過量的，反應(yīng)達(dá)到平衡后，體系中仍存在剩余的、未結(jié)合抗原的標(biāo)記抗體。其中，非均相免疫分析采用固相吸附法分離結(jié)合標(biāo)記物和游離標(biāo)記物。固相吸附分離法是將抗原(抗體)吸附在固相載體表面，使免疫反應(yīng)在固相載體表面上進(jìn)行，待測物質(zhì)(抗體或抗原)、標(biāo)記抗體(抗原)均可通過免疫反應(yīng)結(jié)合在固相材料表面，未結(jié)合物質(zhì)(含游離標(biāo)記物)存在于液相中。此時，棄去液相并經(jīng)洗滌，便可去除游離標(biāo)記物。酶聯(lián)免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測血清中前列腺特異抗原，兩種檢測方法的從檢測原理上均屬于非均相免疫分析，酶免疫分析采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)板作為固相材料，電化學(xué)發(fā)光免疫分析采用磁性微球作為固相材料。固相吸附分離方法有兩個重要環(huán)節(jié)包被和洗滌。固相吸附分離方法設(shè)計(jì)巧妙，操作簡單，故應(yīng)用非常廣泛。但是，此種非均相反應(yīng)模式因包被和洗滌環(huán)節(jié)的存在，給標(biāo)記免疫分析造成很大缺陷，主要表現(xiàn)在以下兩個方面
I.在包被過程，無論物理吸附還是化學(xué)連接，包被后固相材料表面的抗體分子其構(gòu)象不同于處于液相中的抗體分子，與抗原分子結(jié)合能力因空間位阻效應(yīng)將受到一定限制；無論采用微球還是微孔板作為固相材料，由于包被面積有限，捕獲抗體分子不能最大限度滿足大量待測抗原的需要，由此將影響檢測范圍。2. “洗板”或“洗球”是非均相免疫分析中的重要環(huán)節(jié)且多次出現(xiàn)。洗滌過程增加檢測程序的復(fù)雜性，增加檢測時間并給實(shí)現(xiàn)自動化帶來障礙。此外，由于洗滌過程特別是酶免疫分析，難于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，每個測試孔之間洗滌效果不同，在一定程度上影響檢測的精密度，出現(xiàn)批間、批內(nèi)差異?？傊?，就血清前列腺特異抗原檢測項(xiàng)目而言，無論是采用酶免疫分析還是采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析，二者均存在一些方法學(xué)上的缺陷。有的操作煩瑣，有的實(shí)驗(yàn)條件要求過高；有的檢驗(yàn)時間太長，有的耗材費(fèi)用過高。這些不足之處不僅給患者增加就醫(yī)成本，同時也限制該檢測項(xiàng)目的普及應(yīng)用，影響基層醫(yī)療單位的診療工作開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決的現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，而提供一種對血清前列腺特異抗原含量能夠進(jìn)行方便、快速和準(zhǔn)確檢測的基于光激發(fā)偶聯(lián)免疫分析原理的前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。一種前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒，主要包括均相發(fā)光96孔測定板，前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品，鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液，而該試劑盒還包括有生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體，抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液。所述前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒，其抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液是按以下配比的原料制備的，
a.將欲標(biāo)記的抗前列腺特異抗原抗體置于0.IM pH 8.0磷酸鹽緩沖液透析，調(diào)整濃度至1_2暈克/暈升備用；
b.受體微球加入到0.IM pH 8.0磷酸鹽緩沖鹽水溶液中，離心16000轉(zhuǎn)/分洗滌微球，棄上清用上述溶液將微球濃度調(diào)整至10-20毫克/毫升；
c.按受體微球透析后抗前列腺特異抗原抗體為1:10的質(zhì)量比混合于0.IM pH 8.0磷酸鹽緩沖鹽水溶液中，依次加入體積百分比為0. 6-0. 625%的10%吐溫20溶液、4_5%新鮮配制的400 mM氰基硼氫化鈉溶液，充分混勻，37°C反應(yīng)48小時以上；
d.用800mM氫氧化鈉溶液配制溶度為65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加體積百分比為5%的羧甲氨基胺溶液于標(biāo)記后的離心管內(nèi)，37°C封閉反應(yīng)I小時；
e.吸取上清溶液，再加入pH8. 0的IOOmM Tris-HCl溶液，重新懸浮微球、離心洗球，最終調(diào)整濃度至5-10微克/毫升備用。所述前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒，其生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體是按以下配比的原料制備的，
a.將純化的抗前列腺特異抗原抗體調(diào)整為5.0毫克/毫升，用0. 1M，pH9. 5的碳酸鹽緩沖液透析，過夜并于A28tol計(jì)算抗體總量為5. 35毫克； b.將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素與純化的抗前列腺特異抗原抗體的摩爾比為20:1的比例將二者混合，反應(yīng)I小時；
c.將反應(yīng)后的液體用0.OlM磷酸鹽緩沖鹽水于4°C透析24小時，即制成生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體。
一種前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測方法，其是按以下步驟進(jìn)行的，
a.將分別瓶裝的生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體、前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品、抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液、鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液取出，至室溫平衡20分鐘；均相發(fā)光96孔測定板根據(jù)需要做好標(biāo)記；
b.測定板微孔內(nèi)依次加入25微升待測樣本(或前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品)、25微升生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體、25微升抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液，混勻后置37°C溫箱或水浴，溫育30分鐘；
c.各孔再加入100微升鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液，混勻后置37°C溫箱或水浴，繼續(xù)溫育15分鐘；
d.應(yīng)用均相發(fā)光免疫分析儀測定各孔發(fā)光強(qiáng)度，激發(fā)波長采用680納米，檢測波長采用615納米；
e.標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果，采用四參數(shù)擬合方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或獲得數(shù)學(xué)函數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或數(shù)學(xué)函數(shù)計(jì)算待測樣品前列腺特異抗原濃度；
本發(fā)明集酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析的優(yōu)點(diǎn)于一體，并克服兩種方法的缺點(diǎn)，準(zhǔn)確測定血清中前列腺特異抗原水平。整個測定過程減少由于“洗滌”而造成的偏差；具有很強(qiáng)抗干擾能力，較低背景信號，使檢測結(jié)果具有較高精度，特別是對待測物含量處于“灰區(qū)(臨界點(diǎn))”的標(biāo)本，均相發(fā)光免疫分析具有很高的分辨率。同批試劑盒可共用一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，每次測定不需單獨(dú)定標(biāo)。而只有發(fā)生抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，受體微球和供體微球才能靠近，進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的級聯(lián)放大反應(yīng)，是一種“混合后即測定”模式。適用于前列腺癌高危人群篩查、輔助診斷和治療效果評估，以及前列腺良性增生和惡性前列腺癌的鑒別診斷。


圖I是本發(fā)明的檢測原理示意 圖2是本發(fā)明的操作流程示意圖。
其中I :鏈霉親和素標(biāo)記供體微球2 :生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體
3 :抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球4 :待測前列腺特異抗原 5 :激發(fā)光源6 :突光檢測系統(tǒng)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。本實(shí)施例是基于光激發(fā)偶聯(lián)免疫分析，對血清中前列腺特異抗原含量的雙抗體檢測。一.檢測原理
光激發(fā)偶聯(lián)免疫分析方法系統(tǒng)由兩種100納米的微球組成，利用作為供體和受體的微球來檢測生物分子的相互作用，微球表面覆蓋了一層水凝膠，作為生物連接的功能基團(tuán)。當(dāng)·生物分子存在相互作用時會將供體和受體微球拉近，從而激發(fā)級聯(lián)放大的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生數(shù)倍增強(qiáng)信號。具體來說，在激光(波長680納米)的照射下，供體微球上的光敏劑將周圍環(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活躍的單體氧。單體氧擴(kuò)散至受體微球，與其表面的化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，進(jìn)一步激活了同樣在受體上的熒光基團(tuán)，使之發(fā)出熒光，波長為520-620納米?；诠饧ぐl(fā)偶聯(lián)免疫分析對血清中前列腺特異抗原含量的均相發(fā)光免疫試劑盒的測定原理如圖I所示。利用光激發(fā)偶聯(lián)免疫分析方法，在受體微球(發(fā)光微球)表面包被抗前列腺特異抗原抗體(多克隆抗體)，將抗前列腺特異抗原抗體(單克隆抗體)標(biāo)記生物素分子，制備生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體；同時，在供體微球(感光微球)表面已預(yù)先包被鏈霉親和素。如反應(yīng)體系中存在前列腺特異抗原(標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品)，前列腺特異抗原同時與生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體和受體微球表面的抗前列腺特異抗原抗體同時發(fā)生特異性結(jié)合，于受體微球表面形成雙抗體夾心復(fù)合物；此時，如加入鏈霉親和素包被的供體微球，生物素與鏈霉親和素結(jié)合而使得兩個微球相互靠近，在激光光源￠80納米)的激發(fā)下，供體微球表面的光敏劑將溶液中的常態(tài)氧分子轉(zhuǎn)換成帶一個電子的單線態(tài)氧。單線態(tài)的氧分子在溶液中擴(kuò)散，在溶液中碰到受體微球后產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，從而更進(jìn)一步的激發(fā)同一個微球上的熒光基團(tuán)產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)產(chǎn)生熒光(615納米)。此時，待測前列腺特異抗原越多，相互靠近的供體-受體微球越多，則熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。具體定量方法是，用已知的不同濃度的前列腺特異抗原為標(biāo)準(zhǔn)品，按上述模式反應(yīng)、測定后即可獲得一條劑量-反應(yīng)曲線(或數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系)；如將未知濃度待測標(biāo)本進(jìn)行同樣操作，則可利用上述劑量反應(yīng)曲線獲得標(biāo)本中待測前列腺特異抗原的濃度。二.試劑盒組分
前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒主要包括以下組分
1.生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體，
2.前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品，
3.抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液，
4.鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液，
5.均相發(fā)光96孔測定板。三.制備方法I.關(guān)鍵原料
①96孔發(fā)光免疫測定板，購自鉬金-埃爾默公司，不同于酶免疫分析反應(yīng)板，它只是反應(yīng)容器，未包被抗原或抗體。②受體微球50 ill 20 mg/ml，購自鉬金-埃爾默公司。③鏈霉親和素標(biāo)記供體微球200 ill 5 mg/ml，購自鉬金-埃爾默公司。④生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體，自行制備。⑤抗前列腺特異抗原抗體，購自英國Abcam公司。⑥前列腺特異抗原純品,購自美國Sigma公司。⑦活化的生物素(購自美國Sigma公司)。 2.試劑盒組分制備 ①前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品
稱取前列腺特異抗原純品，用含20%滅活小牛血清的0. IM pH 7.4磷酸鹽緩沖鹽水溶液配制成0、2、10、25、50、100納克/毫升的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，標(biāo)準(zhǔn)品須經(jīng)國際質(zhì)控血清校準(zhǔn)。②抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液
a.預(yù)處理抗體和含量測定將欲標(biāo)記的抗前列腺特異抗原抗體裝入透析袋中，置于
0.IM pH 8.0磷酸鹽緩沖液透析，去除Tris、甘氨酸等含有氨基的成分。透析后的抗體溶液，用紫外分光光度計(jì)測定抗體含量，調(diào)整濃度至2毫克/毫升。b.洗滌微球取50微升(20毫克/毫升)受體微球置于I. 5毫升塑料離心管中，加入0. IM pH 8. 0磷酸鹽緩沖鹽水溶液，離心洗滌2次，每次16000XG 15分鐘，吸干上清液待用。c.標(biāo)記上述離心管內(nèi)加入0. I毫克透析后抗前列腺特異抗原抗體，并用
0.IM pH 8. 0磷酸鹽緩沖鹽水溶液定容至200微升，再依次加入I. 25微升10%吐溫20(Tween-20)溶液、10微升新鮮配制的400 mM氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)溶液，充分混勻置37°C溫箱內(nèi)反應(yīng)48小時以上。d.封閉用SOOmM氫氧化鈉溶液配制溶度為65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液。加10微升羧甲氨基胺溶液與標(biāo)記后的離心管內(nèi)，置37°C溫箱內(nèi)反應(yīng)I小時。e.洗球?qū)㈦x心管置于離心機(jī)內(nèi)，16000XG離心15分鐘；用移液管吸取上清溶液，再加入200微升IOOmM Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液，重新懸浮微球；重復(fù)離心，再次懸浮至50微升備用。③生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原的抗體制備方法
a.將純化的抗前列腺特異抗原抗體調(diào)整為5.0毫克/毫升，用0. 1M，pH9. 5的碳酸鹽緩沖液透析，過夜并于A28tol計(jì)算抗體總量為5. 35毫克；
b.將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素與抗前列腺特異抗原抗體的摩爾比為20:1的比例將二者混合，反應(yīng)I小時。c.將反應(yīng)后的液體用0. OlM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)于4°C透析24小時，即制成生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體。④配制受體微球溶液用pH 8. 0 0. I M Tris-HCl緩沖液將標(biāo)記后受體微球稀釋至20微克/毫升 (25微升/測試，0.5微克)。
⑤IOXTris-HCl 測定緩沖液配制IM Tris, 0.1% Tween-20, 0. 05%Proclin-300，使用時用蒸餾水稀釋10倍。⑥配制供體微球溶液
用pH 8. 0 0. I M Tris-HCl緩沖液將標(biāo)記后供體微球稀釋至5微克/毫升(100微升/測試，0.5微克)。四.使用方法
基于光激發(fā)偶聯(lián)免疫分析對血清中前列腺特異抗原含量的均相發(fā)光免疫試劑盒的測定原理如圖2所示，檢測步驟如下。I.將分別瓶裝的生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體、前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品、抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液、鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液取出，至室溫平衡20分鐘；均相發(fā)光96孔測定板根據(jù)需要做好標(biāo)記；
2.測定板微孔內(nèi)依次加入25微升待測樣本(或前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品)、25微升生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體、25微升抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液，混勻后置37°C溫箱或水浴，溫育30分鐘；
3.各孔再加入100微升鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液，混勻后置37°C溫箱或水浴，繼續(xù)溫育15分鐘。4.應(yīng)用均相發(fā)光免疫分析儀測定各孔發(fā)光強(qiáng)度，激發(fā)波長采用680納米，檢測波長采用615納米。5.標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果，采用四參數(shù)擬合方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或獲得數(shù)學(xué)函數(shù)，通過標(biāo) 準(zhǔn)曲線或數(shù)學(xué)函數(shù)計(jì)算待測樣品前列腺特異抗原濃度。
權(quán)利要求
1.一種前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒，主要包括均相發(fā)光96孔測定板，前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品，鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液，其特征在于該試劑盒還包括有生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體和抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒，其特征在于 抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液是按以下配比的原料制備的， a.將欲標(biāo)記的抗前列腺特異抗原抗體置于0.IM pH 8.0磷酸鹽緩沖液透析，調(diào)整濃度至1_2暈克/暈升備用； b.受體微球加入到0.IM pH 8.0磷酸鹽緩沖鹽水溶液中，離心16000轉(zhuǎn)/分洗滌微球，棄上清，用上述溶液將微球濃度調(diào)整至10-20毫克/毫升； c.按受體微球透析后抗前列腺特異抗原抗體為1:10的質(zhì)量比混合，于0.IM pH 8. 0磷酸鹽緩沖鹽水溶液中，依次加入體積百分比為0. 6-0. 625%的10%吐溫20溶液、4_5%新鮮配制的400 mM氰基硼氫化鈉溶液，充分混勻，37°C反應(yīng)48小時以上； d.用800mM氫氧化鈉溶液配制溶度為65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加體積百分比為4-5%的羧甲氨基胺溶液于標(biāo)記后的離心管內(nèi)，37°C封閉反應(yīng)I小時； e.吸取上清溶液，再加入pH8. 0的IOOmM Tris-HCl溶液，重新懸浮微球、離心洗球，最終調(diào)整濃度至5-10微克/毫升備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒，其特征在于生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體是按以下配比的原料制備的， a.將純化的抗前列腺特異抗原抗體調(diào)整為5.0毫克/毫升，用0. 1M，pH9. 5的碳酸鹽緩沖液透析，過夜并于A28tol計(jì)算抗體總量為5. 35毫克； b.將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素與純化的抗前列腺特異抗原抗體的摩爾比為20:1的比例將二者混合，反應(yīng)I小時； c.將反應(yīng)后的液體用0.OlM磷酸鹽緩沖鹽水于4°C透析24小時，即制成生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體。
4.一種前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測方法，其是按以下步驟進(jìn)行的， a.將分別瓶裝的生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體、前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品、抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液、鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液取出，至室溫平衡20分鐘；均相發(fā)光96孔測定板根據(jù)需要做好標(biāo)記； b.測定板微孔內(nèi)依次加入25微升待測樣本、25微升生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體、25微升抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液，混勻后置37°C溫箱或水浴，溫育30分鐘； c.各孔再加入100微升鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液，混勻后置37°C溫箱或水浴，繼續(xù)溫育15分鐘； d.應(yīng)用均相發(fā)光免疫分析儀測定各孔發(fā)光強(qiáng)度，激發(fā)波長采用680納米，檢測波長采用615納米； e.標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果，采用四參數(shù)擬合方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或獲得數(shù)學(xué)函數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或數(shù)學(xué)函數(shù)計(jì)算待測樣品前列腺特異抗原濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開一種前列腺特異抗原均相發(fā)光免疫分析檢測試劑盒及其檢測方法。其包括均相發(fā)光96孔測定板，前列腺特異抗原標(biāo)準(zhǔn)品，鏈霉親和素標(biāo)記供體微球溶液；該試劑盒還包括生物素標(biāo)記抗前列腺特異抗原抗體和抗前列腺特異抗原抗體包被受體微球溶液。檢測時，測定板內(nèi)依次加入待測樣本、生物素標(biāo)記抗體、特異性抗體包被受體微球，混勻后溫育，加入鏈霉親和素標(biāo)記供體微球，繼續(xù)溫育；均相發(fā)光免疫分析儀測定各孔發(fā)光強(qiáng)度，四參數(shù)擬合方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品前列腺特異抗原濃度。成為混合后即測定模式，測定過程沒有洗滌步驟。集酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析之優(yōu)點(diǎn)，成本低，適合基層醫(yī)院推廣應(yīng)用，高通量適合用于大樣本的篩查。
文檔編號G01N33/574GK102721813SQ20121023537
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者于學(xué)林, 劉志永, 李會強(qiáng), 李嬋, 王辰, 蔡剛強(qiáng), 邵新華, 靳寶英 申請人:沃克(天津)生物科技有限公司