專利名稱：一種卵裂球單細胞的固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種卵裂球單細胞的固定方法。
背景技術(shù)：
單個卵裂球細胞的固定是極難控制、掌握，但又非常重要的技術(shù)，是醫(yī)學(xué)界的一大難題，與傳統(tǒng)的多個細胞固定技術(shù)不同，卵裂球細胞的固定只對單個細胞進行操作，要求徹底去除胞漿蛋白，保留染色體DNA的完整性。細胞固定的好壞直接影響單細胞熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)的結(jié)果。傳統(tǒng)的細胞固定方法有兩種甲醇/冰醋酸法和Tween-20/HCl法。(I)甲醇/冰醋酸法細胞活檢后，用帶內(nèi)徑135um的細針Stripper將單個卵裂 球轉(zhuǎn)移到細胞低滲液中2-5min，后將細胞移至玻片背面已畫圈標記的區(qū)域內(nèi)，總液體量不超過2ul。在解剖顯微鏡下觀察直至細胞低滲液基本干透形成結(jié)晶之前用新鮮配制的甲醇/冰醋酸(3:1)從上方滴向標本固定細胞，此時細胞可能會隨著固定液形成的湍流而游走，但很快固定在玻片上，重復(fù)數(shù)次至胞漿完全溶解。并用鉆石筆標記細胞核的確切位置。(2)吐溫20/鹽酸(又稱Tween-20/HCl)法細胞活檢后，將單個卵裂球轉(zhuǎn)移到細胞低滲液中2-5min，后將細胞移至玻片上Iul細胞裂解液中固定，在倒置顯微鏡下觀察直至細胞膜破裂，胞漿去除，胞核游離固定，胞漿去除不全影響雜交效果。后滴幾滴甲醇/冰醋酸去殘留的胞漿，自然干燥，鉆石筆標記細胞核的確切位置。上述兩種傳統(tǒng)的方法的缺點是方法(I)所有的單細胞都需要低滲，因此耗時；細胞在固定過程中由于甲醇/冰醋酸揮發(fā)很快，因此細胞漂移非常迅速，極易導(dǎo)致細胞丟失而導(dǎo)致無法診斷；細胞固定的好壞與濕度相關(guān)，一般建議在30%濕度下進行，因此固定條件要求高；另外初學(xué)者很難掌握。方法(2)同樣需要低滲，并且需要自然干燥，因此耗時更長。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種卵裂球單細胞的固定方法，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)操作復(fù)雜繁瑣，要求條件苛刻，難以掌握，耗時長，細胞固定效果差，胞漿蛋白去除不徹底的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是包括以下步驟
(1)將單個卵裂球在磷酸鹽緩沖液中漂洗，得漂洗的卵裂球細胞；
(2)將步驟(I)所得卵裂球細胞移至載玻片的標定區(qū)域內(nèi)，標定區(qū)域內(nèi)滴加有l(wèi)-2yL的吐溫20和鹽酸的混合溶液，將載玻片置于35-38°C的顯微鏡熱臺上，液體自然蒸發(fā)過程中觀察細胞膨脹、破裂、核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復(fù)滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液；
(3)待在顯微鏡下觀察到步驟(2)中細胞的細胞膜破裂、細胞核游離后，停止滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液，室溫15-30°C下干燥后，再在載玻片上滴加甲醇和冰醋酸的混合溶液，除去殘留的胞漿。
本發(fā)明操作簡單方便，耗時短，容易掌握，細胞固定效果好，固定率高，簡單高效，大大節(jié)省了人力和物力。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。
本發(fā)明由以下步驟實現(xiàn)
(1)將單個卵裂球在磷酸鹽緩沖液中漂洗，得漂洗的卵裂球細胞；
(2)將步驟(I)所得卵裂球細胞移至載玻片的標定區(qū)域內(nèi)，標定區(qū)域內(nèi)滴加有1-2UL的吐溫20和鹽酸的混合溶液，將載玻片置于35_38°C的顯微鏡熱臺上，液體自然蒸發(fā)過程中觀察細胞膨脹、細胞膜破裂、細胞核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復(fù)滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液；
(3)待在顯微鏡下觀察到步驟(2)中細胞的細胞膜破裂、細胞核游離后，停止滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液，室溫15-30°C下干燥后，再在載玻片上滴加甲醇和冰醋酸的混合溶液，除去殘留的胞漿。所述的吐溫20和鹽酸的混合溶液的為10 μ L質(zhì)量濃度O. 01%的吐溫20、10 μ L摩爾濃度O. OlN的鹽酸和10 μ L水混合的混合溶液。所述的甲醇和冰醋酸的混合溶液為甲醇和冰醋酸按照體積比3:1的比例混合的混合溶液。所述的吐溫20和鹽酸的混合溶液的溫度為35_38°C。本發(fā)明所述的方法是對吐溫20/鹽酸(Tween-20/HCl)法進行了改良，省去了細胞低滲步驟，同時在37°C顯微鏡熱臺上觀察細胞固定以節(jié)約固定時間。即卵裂球不經(jīng)1%乙酸鈉低滲處理，直接在PBS中漂洗后移至載玻片標定區(qū)域內(nèi)的1-2 μ L的
O.01%Tween-20/0. OlN HCl溶液中(37°C顯微鏡熱臺上)，液體自然蒸發(fā)過程中觀察細胞膨脹、破裂、核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復(fù)滴加Tween-20 /HCl溶液。待細胞膜破裂、細胞核游離、干燥后再在載玻片上滴幾滴甲醇/冰醋酸液除去殘留的胞漿。本發(fā)明所述方法，經(jīng)反復(fù)多次顯微觀察以及雜交實驗證明，均取得了相同或者相近的結(jié)果，表明該方法穩(wěn)定可靠，固定率高，固定所得的單細胞雜交效果良好，且操作簡單聞效，有關(guān)試驗資料如下
在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)將活檢后的單個卵裂球直接置于37°C的Tween-20/HCl中，細胞膜出現(xiàn)腫脹；置于35-38°C的顯微鏡熱臺上，液體不斷蒸發(fā)，細胞膜逐漸腫脹、破裂，細胞核游離；經(jīng)甲醇/冰醋酸液除去殘留的胞漿，觀察到有明顯的完整細胞核結(jié)構(gòu)，說明染色體DNA保留完整。實驗I 本發(fā)明所述固定方法與現(xiàn)有卵裂球固定方法的比較
將288個細胞核明顯的卵裂球，隨機分為三組，使用三種不同的固定方法，A組甲醇/冰醋酸法；B組常規(guī)Tween-20/HCl法；C組本發(fā)明所述的改良后的Tween-20/HCl固定法。實驗結(jié)果見表I :三組方法總共成功固定了 268個單細胞，其中固定成功率A組與B、C組間有顯著差異(X2檢驗，X2 =6. 87,P =0. 032〈0. 05)，而B、C組間無顯著差異Gd >
O.05)。如表I所示。
表I卵裂球分組固定的效果
權(quán)利要求
1.一種卵裂球單細胞的固定方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將單個卵裂球在磷酸鹽緩沖液中漂洗，得漂洗的卵裂球細胞； (2)將步驟(I)所得卵裂球細胞移至載玻片的標定區(qū)域內(nèi)，標定區(qū)域內(nèi)滴加有l(wèi)-2yL的吐溫20和鹽酸的混合溶液，將載玻片置于35-38°C的顯微鏡熱臺上，液體自然蒸發(fā)過程中觀察細胞膨脹、細胞膜破裂、細胞核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復(fù)滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液； (3)待在顯微鏡下觀察到步驟(2)中細胞的細胞膜破裂、細胞核游離后，停止滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液，室溫15-30°C下干燥后，再在載玻片上滴加甲醇和冰醋酸的混合溶液，除去殘留的胞漿。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卵裂球單細胞的固定方法，其特征在于，所述的吐溫20和鹽酸的混合溶液為10 μ L質(zhì)量濃度O. 01%的吐溫20、10 μ L摩爾濃度O. OlN的鹽酸和10 μ L水混合的混合溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卵裂球單細胞的固定方法，其特征在于，所述的甲醇和冰醋酸的混合溶液為甲醇和冰醋酸按照體積比3:1的比例混合的混合溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的卵裂球單細胞的固定方法，其特征在于，所述的吐溫20和鹽酸的混合溶液的溫度為35-38°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種卵裂球單細胞的固定方法，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣，要求條件苛刻，難以掌握，細胞固定效果差的問題。解決的技術(shù)方案是將單個卵裂球在磷酸鹽緩沖液中漂洗，移至載玻片的標定區(qū)域內(nèi)，標定區(qū)域內(nèi)滴加有1-2μL的吐溫20和鹽酸的混合溶液，將載玻片置于35-38℃的顯微鏡熱臺上，液體自然蒸發(fā)過程中觀察細胞膨脹、破裂、核游離，若細胞膜未完全破裂，可重復(fù)滴加吐溫20和鹽酸的混合溶液；待觀察到細胞膜破裂、細胞核游離后，停止滴加吐溫20和鹽酸的混合液，室溫下干燥后，滴加甲醇和冰醋酸的混合液，除去殘留的胞漿。本發(fā)明操作簡單方便，容易掌握，細胞固定效果好，固定率高，簡單高效，大大節(jié)省了人力和物力。
文檔編號G01N1/28GK102706716SQ201210221309
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月30日
發(fā)明者孫瑩璞, 宋文妍, 彭兆鋒, 戴善軍, 李剛, 石森林, 辛志敏, 郭藝紅, 金海霞 申請人:鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院