專利名稱：肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的特異性檢測用引物探針組合和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種采用熒光PCR技術，特異性檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。
背景技術：
細菌性肺炎的病原體因宿主年齡、伴隨疾病與免疫功能狀態(tài)有較大差異。就獲得方式而言，社區(qū)獲得性肺炎病原體中常見的為肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌。肺炎鏈球菌是革蘭陽性球菌，是引起細菌性肺炎的最主要病原體，約占其2/3左 右，全年均可發(fā)病，冬春季高發(fā)。流感嗜血桿菌是革蘭陰性小桿菌，在4-18月齡的兒童中高發(fā)，可以引起細菌性肺炎和細菌性腦膜炎。根據WTO統計數據，每年有超過30萬人死于流感嗜血桿菌引起的肺炎和腦膜炎。肺炎鏈球菌的實驗室診斷主要依靠病原菌培養(yǎng)。傳統的檢測法需要培養(yǎng)分離出菌株之后才能鑒定，需要時間較長。且流感嗜血桿菌生長條件苛刻，營養(yǎng)要求很高，費時費力，不利于快速檢測，并對于操作人員來說具備一定的危險性。近年來針對病原體的PCR反應快速檢測技術開始出現。對于PCR檢測來說，引物的選擇至關重要，直接影響檢測的特異性。如果引物特異性不夠，則可能導致檢測的假陽性結果或者假陰性結果的出現。對于肺炎患者呼吸道分泌物中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的檢測是查明病因的重要步驟，對于臨床診斷和治療藥物選擇具有重要意義。本發(fā)明針對肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌特異的祀序列設計引物和Taqman探針，利用real-time PCR的方法，用來鑒別檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸，可以快速獲得特異性檢測結果。

發(fā)明內容
為了更加準確地檢測樣品肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸存在，本發(fā)明提供一種特異性檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的寡核苷酸序列組合和包含該組合的試劑盒，其特征在于序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于核酸擴增的引物為Pl :5'-AGTCGTTCCAAGGTAACAAGT-3'，P2 :5' -CACGCACCGACTACCTAAACC-3'，P3 5'-TGCAACTCCAGCTGCTAAAGTATT-3'，P4 5'-TCTTCACCGTAAGATACTGTGCC-3'。Pl和P2為針對肺炎鏈球菌基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物，P3和P4為針對流感嗜血桿菌基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物。本發(fā)明的特征還在于，序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針為Probel 5' -XfGATCAGATTGAAGCTGATAAAACGATACA-Yi-3'，
Probe2 :5' -X2-TAGGTCAACGTCGTGCAGATGCAGTT_Y2-3'。X1和X2為熒光報告基團，Y1和Y2為熒光淬滅基團。Probel為針對肺炎鏈球菌基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針，Probe2為針對流感嗜血桿菌基因組特異性序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針。本發(fā)明的特征還在于，試劑盒包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品。其中PCR反應液主要含有上述的引物和探針、反應緩沖液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動Taq酶，陰性質控品為去離子水，陽性質控品為含有檢測靶序列的核酸。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案為序列組合或試劑盒的PCR反應液中用于突光信 號監(jiān)測的寡核苷酸探針的突光基團分，其中Probel突光報告基團X1為Fam,突光淬滅基團Y1為Eclipse, Probe2熒光報告基團X2為Hex，熒光淬滅基團Y2為Eclipse。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案為試劑盒的包含上述兩對特異性引物和兩條特異性探針，屬于實時熒光雙重PCR檢測，可在同一個反應體系中對肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸進行檢測和鑒別。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案為試劑盒的PCR反應循環(huán)參數為95°C，2min ;進入循環(huán)階段95°C變性10s，60°C退火延伸lmin，共反應40個循環(huán)。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案，試劑盒選用的PCR反應體系為20 iil，包括2 X PCR緩沖液 IOu lU0mmol/L dNTP l.Ou l,25umol/L 引物各 0. 5 u I、10 y mol/L 探針各 0. 2u I,熱啟動Taq酶混合液0. 2 ill、樣品DNA 2 U I，加滅菌水至終體系20 yl。本發(fā)明提供的試劑盒對肺炎鏈球菌核酸的檢測下限為20個拷貝每反應體系；對流感嗜血桿菌核酸的檢測下限為20個拷貝每反應體系。本發(fā)明分別根據肺炎鏈球菌或流感嗜血桿菌基因組保守區(qū)分別設計特異性引物和探針，提供的試劑盒可以檢出肺炎鏈球菌或流感嗜血桿菌的核酸，但不能檢出非肺炎鏈球菌或流感嗜血桿菌病原體的核酸，說明試劑盒具有很好的特異性。本發(fā)明提供的試劑盒3小時內即可完成檢測，雙重檢測可節(jié)省50%的檢測費用，可為肺炎鏈球菌或流感嗜血桿菌的疾病監(jiān)測和臨床診斷提供實驗依據。


圖I為雙重實時熒光PCR檢測肺炎鏈球菌核酸靈敏度的擴增曲線圖。從左至右的5條曲線分別為肺炎鏈球菌特異性PCR片段構建質粒梯度稀釋(IO5-IO1)后擴增結果。橫坐標為反應循環(huán)數，縱坐標為不同循環(huán)數熒光檢測信號的△ Rn值。圖2為雙重實時熒光PCR檢測流感嗜血桿菌核酸靈敏度的擴增曲線圖。從左至右的5條曲線分別為流感嗜血桿菌特異性PCR片段構建質粒梯度稀釋(IO5-IO1)后擴增結果。橫坐標為反應循環(huán)數，縱坐標為不同循環(huán)數熒光檢測信號的ARn值。圖3為實時熒光雙重PCR檢測體系對肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸檢測特異性擴增曲線圖。肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌均出現S型擴增曲線，而其他病原微生物質控菌均未出現S型擴增曲線。橫坐標為反應循環(huán)數，縱坐標為不同循環(huán)數熒光檢測信號的ARn值。
具體實施方式
下面結合具體實施例詳細說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。需要指出的是，這里列出的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發(fā)明范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人員可根據需要選擇其他公司的相應試劑以實現本發(fā)明的目的。I、引物和TaqMan探針的設計與合成利用Blast工具對Genbank和國內外文獻中的所有的肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌基因組序列進行分析，分別選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測靶序列，并針對這兩個檢測靶序列設計和合成多套引物和探針(見表I)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，其中肺炎鏈球菌的檢測探針5’端標記FAM熒光基團，3’端標記Eclipse熒光淬滅基團，流感嗜血桿菌的檢測探針5’端標記Hex熒光基團，3’端標記Eclipse熒光淬滅基團。2、檢測菌種的準備
本實施例中所使用的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及其他陰性對照菌株(百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌、A群腦膜炎奈瑟氏菌、B群腦膜炎奈瑟氏菌、C群腦膜炎奈瑟氏菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌、肺炎衣原體和卡他莫拉菌)均購買于中國藥品生物制品檢定所。3、菌株DNA的抽提選用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit (貨號51306)提取菌株DNA。具體步驟試劑盒參考操作說明書。4、引物和探針的篩選采用設計的多套引物和探針分別檢測提取的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和陰性對照菌株細菌的基因組DNA，經反復實驗，篩選出靈敏度、特異性和重復性最佳的引物探針組合。(見序列表，肺炎鏈球菌正向引物pi、反向引物p2和探針probel ;流感嗜血桿菌正向引物P3、反向引物p4和探針probe2)5、標準品的構建與制備分別利用pi、p2和p3、p4引物，PCR擴增肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌特異性基因片段，將PCR產物克隆至pMD-18T載體，轉化DH5 a大腸桿菌，利用堿裂解法提取陽性克隆質粒，利用紫外可見分光光度計分別測定在波長260nm處、280nm處DNA的吸光率，然后計算質粒濃度與純度。然后10倍梯度稀釋至10個拷貝每微升。6、反應條件優(yōu)化對引物、探針、酶等要素逐一優(yōu)化，確定的反應體系為2XPCR緩沖液10iU、IOmmoI/L dNTP I. 0 y 1、25 y mol/L 引物各 0. 5 y I、10 y mol/L 探針各 0. 2 y I、熱啟動 Taq酶0. 2iU、模板2ul，加滅菌水至終體系20iU。根據擴增片段長、引物和探針的退火溫度以及酶的特性，主要對反應退火溫度和延伸時間進行了優(yōu)化，最終確定的循環(huán)參數為預變性95°C，2min ;擴增和檢測95°C變性10s，60°C退火延伸lmin，40個循環(huán)，每個循環(huán)在退火及延伸階段采集熒光信號。在擴增結束后按同一條件分析數據，確定各樣品的Ct值。7、檢測限的評價以上述5中的陽性標準品評價本發(fā)明的提供的試劑盒的檢測限，陽性標準品濃度為1 X IO5Copies/U I, I X IO4Copies/U I, I X IO3Copies/U I, I X IO2Copies/ U I,IX IO5COpies/ u I, I X IO5COpies/ U I,本發(fā)明提供的試劑盒對肺炎鏈球菌核酸的檢測下限為20個拷貝每反應體系；對流感嗜血桿菌核酸的檢測下限均為20個拷貝每反應體系。8、檢測特異性的評價以上述2中的菌株DNA為模板評價了本試劑盒的特異性。對肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌DNA進行檢測時均可見明確的擴增曲線，對上述9種其他咽部常見病原微生物DNA檢測時，未產生陽性擴增曲線，說明我們使用的探針和引物與我們選定的其他菌株之間不存在交叉反應。盡管上文中以優(yōu)選的方式，通過具體實施例示例性說明了本發(fā)明的某些實施方式，但是本領域技術人員應了解，本發(fā)明并不限于上面所公開的實施方式，而是可以根據本發(fā)明所屬技術領域的知識對其進行修改，所作修改不會超出本發(fā)明要求保護的范圍。例如，
本發(fā)明所使用的熒光實時PCR也可以根據需要采用說明書中所列出的實施例中指出的熒光基團和熒光淬滅基團以外的標記物質，如Tet、FAM、HEX、TAMRA, ROX, Cy3、TxRd、JOE等標記物；或使用Taqman技術之外的其他標記體系,例如MGB探針、分子信標MB探針、蝎形探針、熒光雙雜交探針等熒光探針標記技術；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green等飽和染料，只要其使用了本發(fā)明所述的特異性引物序列，即可定性或定量檢測目的基因的存在，進而特異性地檢測肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的存在。所以，這些本領域技術人員所了解的改變和慣用手段的替換也落入本發(fā)明的保護范圍內。本發(fā)明的保護范圍應由所附的權利要求書所限定。
權利要求
1.一種用于特異性檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸的引物組合，這套序列組合特征在于包括下列引物Pl 5'-AGTCGTTCCAAGGTAACAAGT-3',P2 5'-CACGCACCGACTACCTAAACC-3'，P3 5'-TGCAACTCCAGCTGCTAAAGTATT-3',P4 5'-TCTTCACCGTAAGATACTGTGCC-3'。
2.一種用于特異性檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸的引物和寡核苷酸探針組合，其中引物為權利要求I所述的引物，寡核苷酸探針為Probei ^'-X1-Gatcagattgaagctgataaaacgataca-Y1-S'，Probe2 :5'-X2-TAGGTCAACGTCGTGCAGATGCAGTT_Y2-3'。
X1和X2為熒光報告基團，Y1和Y2為熒光淬滅基團。
3.如權利要求2所述，這套序列組合特征還在于，其中Probel熒光報告基團X1為Fam，熒光淬滅基團Y1為Eclipse，Probe2熒光報告基團X2為Hex，熒光淬滅基團Y2為Eclipse。
4.如權利要求2所述，這套序列組合特征還在于，可用于雙重實時熒光聚合酶鏈反應檢測，即一個反應體系可同時檢測和鑒別肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸。
5.一種用于特異性檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸的試劑盒，其中包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品。其特征在于PCR反應液中用于核酸擴增反應的引物序列如下Pl 5'-AGTCGTTCCAAGGTAACAAGT-3',P2 5'-CACGCACCGACTACCTAAACC-3'，P3 5'-TGCAACTCCAGCTGCTAAAGTATT-3',P4 5'-TCTTCACCGTAAGATACTGTGCC-3'。
6.如權利要求5所述的試劑盒,其特征在于PCR反應液中用于突光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針的序列如下Probei ^'-X1-Gatcagattgaagctgataaaacgataca-Y1-S'，Probe2 :5'-X2-TAGGTCAACGTCGTGCAGATGCAGTT_Y2-3'。
X1和X2為熒光報告基團，Y1和Y2為熒光淬滅基團。
7.如權利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針其中Probel熒光報告基團X1為Fam，熒光淬滅基團Y1為Eclipse，Probe2熒光報告基團X2為Hex，熒光淬滅基團Y2為Eclipse。
8.如權利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應體系為20iil，包括2 X PCR緩沖液 IOu lUOmmol/L dNTP l.Ou l,25umol/L 引物各 0. 5 u I、10 y mol/L 探針各 0. 2u I,熱啟動Taq酶混合液0. 2 ill、樣品DNA 2 U I，加滅菌水至終體系20 yl。
9.如權利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應循環(huán)參數為 94°C,2min ;進入循環(huán)階段94°C變性10s,60°C退火延伸lmin,共反應40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用熒光PCR技術，特異性檢測樣品中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。該試劑盒能夠靈敏地檢測并鑒別樣品中存在的肺炎鏈球菌核酸和流感嗜血桿菌核酸，其檢測下限均為20拷貝每反應體系，在疾病監(jiān)測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。
文檔編號G01N21/64GK102660645SQ20121013706
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月7日 優(yōu)先權日2012年5月7日
發(fā)明者其他發(fā)明人請求不公開姓名, 文鋒 申請人:鎮(zhèn)江和創(chuàng)生物科技有限公司