專利名稱：一種基于表面等離子共振技術(shù)的食品中有害物質(zhì)多殘留同時檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種食品中有害物質(zhì)多殘留同時檢測技術(shù)。特別是基于表面等離子體共振技術(shù)，通過核酸適配體與未標記、標記樣品進行特異性競爭識別，采用多探頭光纖傳感器同時檢測食品中多種有害物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
食品中有害物質(zhì)殘留嚴重危害了公眾身體健康，面對食品安全問題的重大挑戰(zhàn)，分析檢測食品中有害物質(zhì)是保障食品安全的重要環(huán)節(jié)。其中，表面等離子共振(SurfacePlasmon Resonance, SPR),作為ー種超靈敏快速檢測手段,是食品安全檢測的理想工具之一。但SPR在檢測低分子量物質(zhì)時仍存在信噪比大、響應(yīng)值小、靈敏度低等不足，而食品中啶蟲脒、卡那霉素、土霉素(農(nóng)藥獸藥)、赭曲霉素(生物毒素)、孔雀石綠(化學污染物)等均為低分子量有害物質(zhì)。此外，食品中經(jīng)常同時存在多種有害物質(zhì)，使得檢測過程復雜繁瑣，目前普遍采用的單個物質(zhì)檢測已經(jīng)無法滿足要求。因此，迫切需要開發(fā)基于SPR技術(shù)的新型檢測方法，實現(xiàn)食品中多種低分子量有害物質(zhì)的超靈敏、快速、同時檢測。近幾年來，基于適配體識別的檢測方法在食品安全檢測中呈現(xiàn)出巨大應(yīng)用前景。適配體是能夠與靶標分子高特異性結(jié)合的核酸(DNA或RNA)片段。由于適配體具有高特異性和高親和性，因此被喻為“化學抗體”。跟抗體相比，適配體具有更高的化學穩(wěn)定性，不易失活，因此更具應(yīng)用潛力。此外，適配體制備不依賴動物或細胞，可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在體外大量合成。因此，基于適配體特異性識別，為同時檢測食品中多種有害物質(zhì)提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。結(jié)合表面等離子體共振技術(shù)，有望實現(xiàn)食品中多種有害物質(zhì)的超靈敏同時檢測。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種采用表面等離子體共振譜技術(shù)檢測食品中多種低分子量有害物質(zhì)殘留的方法，解決現(xiàn)有表面等離子體共振技術(shù)中難以同時檢測多種低分子量物質(zhì)的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種應(yīng)用表面等離子共振技術(shù)的食品中有害物質(zhì)多殘留同時檢測方法，對同一樣品中的多種有害物質(zhì)殘留組分的含量進行同時檢測，其特征在于包括下述步驟
(一)傳感器表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的多探頭光纖傳感器，每個探頭表面連接ー種適配體，通過通入5-50 u L濃度為1-50 u g/L已標記生物素的殘留組分對應(yīng)核酸適配體，在多探頭光纖傳感器上固定上不同殘留組分相應(yīng)的核酸適配體；
(ニ)對待測殘留組分進行分子探針標記，標記方法根據(jù)待測物基團不同，選擇EDC/NHS法交聯(lián)羧基與氨基或戊ニ醛法交聯(lián)兩個氨基；
(三)標準溶液配制用0. 01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液配置殘留組分的標、準樣品儲備液，儲備液濃度為0. Ing/mL至lmg/mL，分別等量量取殘留組分的標準儲備液，配制含有有害物質(zhì)殘留組分的混合標準原液，用磷酸鹽緩沖液將混合標準原液配制成不同濃度的標準溶液，取不同濃度未標記待測殘留組分的標準溶液和分子探針標記的待測殘留組分充分混合； (四)建立標準曲線采用表面等離子共振譜儀測量，以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準，通過微泵通入5-100 u L待測混合樣品，隨后通入5-100 u L濃度為5-100ng/mL的分子探針的適配體溶液，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖；取不同濃度待測樣品的表面等離子體共振譜圖穩(wěn)定值，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸曲線的方程；依次測得多種有害物質(zhì)殘留組分的工作曲線，進行多項式曲線擬合，獲得各自的標準曲線；
(五)定量檢測對于未知含量的多種殘留組分樣品進行檢測，同樣按照步驟(三)進行；再通入適量分子探針適配體溶液，采用表面等離子共振譜儀記錄多種有害物質(zhì)殘留的光譜圖；將光譜圖中不同殘留組分的穩(wěn)定值代入相應(yīng)的回歸曲線方程，計算出不同食品中殘留組分的濃度值；
(六)通入0.01-0. 05mol/L (pH為2_3)的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗多探頭光纖傳感器表面，進行傳感元件再生，用于下次測量。所述分子探針包括凝血酶或溶菌酶或免疫球蛋白E,標記方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法?？梢圆捎煤怂徇m配體為識別分子，核酸適配體序列與待測物直接相關(guān)?？梢圆捎枚嗵筋^光纖傳感器為表面等離子共振儀的傳感元件，每個探頭連接ー種適配體，總共連接4 16種不同的適配體。所述步驟(一)傳感器表面適配體固定，包括如下步驟
(1)將鏈霉親和素SA修飾的光纖傳感探頭插入表面等離子體共振檢測儀中，在工作通道中進行在線傳感表面修飾；
(2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液；
(3)通入5-50UL濃度為1-50 y g/L生物素修飾的標記分子適配體溶液，進行在線偶聯(lián)
至基線穩(wěn)定；
(4)重復步驟(2)至(3)，獲得標記分子適配體修飾的光纖傳感探頭?？梢圆捎梅肿犹结槝擞洿郎y物，與未標記樣品一起與核酸適配體發(fā)生特異性競爭識別。 所述步驟(四)和(五)中通入適量分子探針適配體溶液，提高表面等離子體共振譜儀響應(yīng)值，適用于測量響應(yīng)信號較小的小分子量有害物質(zhì)殘留組分。所述的小分子量有害物質(zhì)殘留組分的分子量〈1000 Da。本發(fā)明方法中采用的表面等離子體共振多探頭光纖傳感器，在傳感器表面固定多種不同的適配體，基于適配體特異性識別，可同時檢測多種物質(zhì)。本發(fā)明方法引入大分子標記物凝血酶或溶菌酶或免疫球蛋白E，基于表面等離子體共振傳感表面適配體競爭識別未標記和標記的目標分子，若待測樣品中目標分子少，則表面等離子體共振表面吸附的標記分子多，此時引起的表面等離子體共振響應(yīng)越大，反正則越小。由于分子探針分子量大，與分子探針適配體特異性識別吸附后，表面等離子體共振響應(yīng)值進ー步増大，因此，可實現(xiàn)小分子物質(zhì)的超靈敏檢測。本發(fā)明提供的基于表面等離子體共振譜儀，采用多探頭光纖傳感器，檢測食品中多種低分子量有害物質(zhì)殘留的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(I)采用高穩(wěn)定性的核酸適配體為識別分子，相比抗體-抗原識別檢測，大大提高了傳感元件的使用壽命，降低了檢測成本；(2)采用表面等離子體共振多探頭光纖傳感器，可同時檢測多種有害物質(zhì)，相比單個物質(zhì)檢測技木，大大提高了樣品檢測效率，縮短了樣品檢測時間；(3)引入具有大分子量的分子探針，基于競爭識別，可實現(xiàn)小分子有害物質(zhì)的超靈敏檢測，解決了表面等離子體共振技術(shù)檢測小分子量物質(zhì) 的響應(yīng)值小、靈敏度低等問題。


圖I是本發(fā)明所述基于表面等離子共振的多種小分子有害物質(zhì)同時檢測原理圖；其中!)為凝血酶適配體。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作以詳細描述。實施例選擇凝血酶為分子探針，凝血酶適配體序列為GGTTGGTGTGGTTGG。選擇五種典型食品中小分子有害物質(zhì)為檢測對象，分別為啶蟲脒、卡那霉素、土霉素、赭曲霉素、孔雀石綠，相應(yīng)適配體序列為
啶蟲脒適配體-CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTTGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTT
GATCGCTGACACCATATTATGAAGATAAGCTTGGCACCCGCATCGT
卡那霉素適配體-CACCTAATACGACTCSCTATAGCGGATCCGAAGATGGGGGTTG
AGGCTAAGCCGACCGTAAGTTGGGCCGTCTGGCTCGAACAAGCTTGC
土霉素適配體-CGTACGGAATTCGCTAGCCGAGTTGAGCCGGGCGCGGTACGGGT
ACTGGTATGTGTGGGGATCCGAGCTCCACGTGGGATCCGAGCTCCACGTG
赭曲霉素適配體-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
孔雀石綠適配體-GGAUCCCGACUGGCGAGAGCCAGGUAACGAAUGGAUCC。具體操作步驟如下
(1)傳感器表面適配體固定選擇鏈霉親和素(SA)修飾的多探頭光纖傳感器，每個探頭表面連接ー種適配體，通過通入IOy L濃度為30 y g/L已標記生物素的殘留組分對應(yīng)核酸適配體，在多探頭光纖傳感器上固定上不同殘留組分相應(yīng)的核酸適配體；
(2)分子標記物偶聯(lián)將五種待測物通過戊ニ醛法與凝血酶進行偶聯(lián)標記，標記方法根據(jù)待測物基團不同選擇，包括EDC/NHS法、戊ニ醛法等，如卡那霉素，可采用戊ニ醛法與凝血酶連接，待用；
(3)標準溶液配制分別稱取啶蟲脒、卡那霉素、土霉素、赭曲霉素、孔雀石綠5種標準品10mg，溶解于0. 02mol/L (pH = 7. 4)磷酸鹽緩沖液定容至10mL，即為lmg/mL的標準貯備液；分別等量量取5種標準貯備液，配制含有5種有害物質(zhì)殘留組分的混合標準原液10U g/mL ;用磷酸鹽緩沖液將混合標準原液配制成不同濃度的標準溶液，濃度在pg/mL ng/mL 致，イ衣&為 0,Ing/mL,2ng/mL,4ng/mL,6ng/mL,8ng/mL ；
(4)標準曲線繪制將上述濃度為0ng/mL未標記的標準溶液與適量的凝血酶標記有害物質(zhì)溶液充分混合，該標記溶液中5種有害物質(zhì)殘留組分含量也相等；采用表面等離子共振譜儀測量，通入0. 02mol/L (pH = 7. 4)磷酸鹽緩沖液作為測量基準，然后泵入待測混合樣品，響應(yīng)值穩(wěn)定后通入凝血酶適配體溶液，待表面等離子體共振響應(yīng)值穩(wěn)定后，記錄表面等離子體共振光譜 (5)通入0.02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-鹽酸溶液，沖洗多探頭光纖傳感器表面，破壞適配體和待測物的結(jié)合,完成傳感元件再生；
(6)濃度由低到高，依次通入其他濃度(l-8ng/mL)的待測標準樣品測量方法同(4)，獲得相應(yīng)表面等離子體共振光譜圖；取各有害物質(zhì)殘留組分的表面等離子體譜圖穩(wěn)定值，繪制標準曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得濃度-穩(wěn)定值關(guān)系回歸曲線方程；
(7)傳感芯片再生后，將實際未知濃度待測樣品按步驟(4)與適量凝血酶標記有害物質(zhì)溶液充分混合；泵入的表面等離子體共振譜儀中，同時記錄不同有害物質(zhì)殘留組分的光譜圖，確定相應(yīng)穩(wěn)定值，代入各自標準曲線，確定各組分含量，檢測限可達pg/mL ng/mL級；
(8)再次通入0.02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-鹽酸溶液，沖洗表面等離子體共振多探頭光纖傳感器，進行探頭再生，用于下次測量。本發(fā)明為了敘述的準確和方便，在實施例中以啶蟲脒、卡那霉素、土霉素、赭曲霉素、孔雀石綠為例進行詳細描述，但本發(fā)明同樣適用于食品中其他有害物質(zhì)的測定，如肉毒桿菌毒素、雌二醇、四環(huán)素類抗生素等的精確檢測和定性分析，因此上述內(nèi)容均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。此外，根據(jù)實施例的方法進行檢測樣品，與現(xiàn)有表面等離子體檢測技術(shù)相比，準確度提高2 10倍，檢測時間縮短5倍以上，探頭壽命延長20%，現(xiàn)有表面等離子體檢測技術(shù)不能準確檢測的啶蟲脒等小分子量(〈lOOODa)物質(zhì)，可以采用本發(fā)明的方法獲得準確的檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用表面等離子共振儀的食品中有害物質(zhì)多殘留同時檢測方法，對同ー樣品中的多種有害物質(zhì)殘留組分的含量進行同時檢測，其特征在于包括下述步驟 (一)傳感器表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的多探頭光纖傳感器，每個探頭表面連接ー種適配體，通過通入5-50 u L濃度為1-50 u g/L已標記生物素的殘留組分對應(yīng)核酸適配體，在多探頭光纖傳感器上固定上不同殘留組分相應(yīng)的核酸適配體； (ニ)對待測殘留組分進行分子探針標記，標記方法根據(jù)待測物基團不同，選擇EDC/NHS法交聯(lián)羧基與氨基或戊ニ醛法交聯(lián)兩個氨基； (三)標準溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液配置殘留組分的標準樣品儲備液，儲備液濃度為0. Ing/mL至lmg/mL，分別等量量取殘留組分的標準儲備液，配制含有有害物質(zhì)殘留組分的混合標準原液，用磷酸鹽緩沖液將混合標準原液配制成不同濃度的標準溶液，取不同濃度未標記待測殘留組分的標準溶液和分子探針標記的待測殘留組分充分混合； (四)建立標準曲線采用表面等離子共振譜儀測量，以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準，通過微泵通入5-100 u L待測混合樣品，隨后通入5-100 u L濃度為5-100ng/mL的分子探針的適配體溶液，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖；取不同濃度待測樣品的表面等離子體共振譜圖穩(wěn)定值，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸曲線的方程；依次測得多種有害物質(zhì)殘留組分的工作曲線，進行多項式曲線擬合，獲得各自的標準曲線； (五)定量檢測對于未知含量的多種殘留組分樣品進行檢測，同樣按照步驟(三)進行；再通入適量分子探針適配體溶液，采用表面等離子共振譜儀記錄多種有害物質(zhì)殘留的光譜圖；將光譜圖中不同殘留組分的穩(wěn)定值代入相應(yīng)的回歸曲線方程，計算出不同食品中殘留組分的濃度值； (六)通入0.01-0. 05mol/L (pH為2_3)的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗多探頭光纖傳感器表面，進行傳感元件再生，用于下次測量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述分子探針包括凝血酶或溶菌酶或免疫球蛋白E，標記方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于采用核酸適配體為識別分子，核酸適配體序列與待測物直接相關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于采用多探頭光纖傳感器為表面等離子共振儀的傳感元件，每個探頭連接一種適配體，總共連接4 16種不同的適配體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(一)傳感器表面適配體固定，包括如下步驟 (1)將鏈霉親和素SA修飾的光纖傳感探頭插入表面等離子體共振檢測儀中，在工作通道中進行在線傳感表面修飾； (2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液； (3)通入5-50UL濃度為1-50U g/L生物素修飾的標記分子適配體溶液，進行在線偶聯(lián)至基線穩(wěn)定； (4)重復步驟(2)至(3)，獲得標記分子適配體修飾的光纖傳感探頭。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于采用分子探針標記待測物，與未標記樣品一起與核酸適配體發(fā)生特異性競爭識別。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(四)和(五)中通入適量分子探針適配體溶液，提高表面等離子體共振譜儀響應(yīng)值，適用于測量響應(yīng)信號較小的小分子量有害物質(zhì)殘留組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的小分子量有害物質(zhì)殘留組分的分子量〈1000 Da。
全文摘要
一種基于表面等離子共振(SPR)技術(shù)的食品中有害物質(zhì)多殘留同時檢測方法，包括傳感表面適配體固定、樣品標記、樣品檢測、傳感元件再生四個步驟。采用多探頭光纖傳感器表面連接不同殘留組分相應(yīng)的核酸適配體，加入不同殘留組分相應(yīng)的分子探針標記物并通入傳感表面，未標記和標記的殘留組分特異性競爭識別相應(yīng)的核酸適配體。再通入分子探針適配體溶液，與連接在光纖傳感器表面的標記樣品結(jié)合，利用帶有多探頭光線傳感器進行SPR檢測。多探頭光纖傳感器可進行再生，實現(xiàn)傳感元件的反復使用。本發(fā)明基于SPR技術(shù)、適配體特異性競爭識別，實現(xiàn)了同一樣品中的多種有害物質(zhì)殘留組分的同時檢測，特別是適用于小分子量物質(zhì)的檢測。
文檔編號G01N21/55GK102645420SQ20121011073
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者王利兵, 蘇榮欣, 韓偉 申請人:王利兵