專利名稱：一種基于表面等離子共振技術(shù)的塑料玩具中有害化合物檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種塑料玩具中有害化合物檢測技術(shù)。特別是基于表面等離子體共振技術(shù)，通過核酸適配體與未標記、標記樣品進行特異性競爭識別，采用凝血酶適配體修飾的傳感元件間接檢測塑料玩具中有害化合物的方法。
背景技術(shù)：
玩具一直是嬰幼兒的親密伙伴，但是也會帶來健康問題，有害化合物殘留就是潛藏在塑料玩具中的隱形殺手。嬰兒玩具中涉及有害化學物質(zhì)的種類繁多，如樹脂及穩(wěn)定劑、 增塑劑、著色劑等添加劑等。近年來出現(xiàn)的雙酚A事件引起了人們對塑料玩具中有害化學物質(zhì)的廣泛關(guān)注，雙酚A是制造環(huán)氧樹脂、聚碳酸樹脂、聚苯こ烯樹脂的主要原料，又是用于酚醛樹脂、聚氯こ烯、抗氧化劑等的穩(wěn)定劑。在嬰兒玩耍過程中，誤舔誤食均有可能引起雙酚A從玩具中遷移出來，而直接進入體內(nèi)，對嬰兒發(fā)育、免疫力造成影響，甚至致癌。2011年，歐盟頒布了 “新玩具安全指令”，明確規(guī)定在歐盟市場銷售的玩具必須符合新指令及適用標準，表明歐盟相關(guān)貿(mào)易壁壘再次升級。因此，塑料玩具中的有害化合物殘留越來越引起了國內(nèi)外的普遍重視。傳統(tǒng)檢測有害化合物殘留的方法主要有液相色譜、氣相色譜、氣液質(zhì)聯(lián)用儀等。這些方法雖然具有靈敏度高、使用范圍廣等優(yōu)點，但價格昂貴、處理復(fù)雜、實驗過程繁瑣費吋，所用大量的有機試劑易污染環(huán)境，不能進行在線檢測。目前，免疫分析技術(shù)是有害化合物快速檢測中應(yīng)用最普遍的技木。然而，現(xiàn)有免疫檢測技術(shù)所用試劑盒和傳感器往往具有專ー性；免疫標記物也存在不穩(wěn)定、容易失活等缺點，限制了相關(guān)免疫分析技術(shù)的進一歩發(fā)展。表面等離子體共振技術(shù)因其具有高靈敏度、操作簡單、響應(yīng)快、無須標記與耗樣量少等優(yōu)點，已廣泛用于生化檢測領(lǐng)域。該技術(shù)不僅可以檢測分析物，而且可以測定分子間相互作用的動力學常數(shù)，可以為塑料玩具中有害化合物快速檢測提供一種簡便可靠的方法；但與酶聯(lián)免疫吸附法、生物傳感器檢測法以及熒光分析法相比，仍然存在傳感芯片檢測專一性和成本高問題。例如，采用表面等離子體共振原理檢測的儀器BIACore，其常用傳感器芯片SA芯片成本為3000多元人民幣。因此，如何實現(xiàn)同一傳感芯片檢測不同有害化合物已成為表面等離子體共振檢測領(lǐng)域熱點研究問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有有害化合物免疫分析技術(shù)存在的傳感專一性、抗體穩(wěn)定性差、耗材量大、造價昂貴等問題，同時極大提高有害化合物的檢測限，本發(fā)明提供了一種基于表面等離子體共振儀檢測塑料玩具中有害化合物的檢測方法。該方法具有通用、高穩(wěn)定性、高靈敏度、操作簡單等優(yōu)點，滿足對玩具中各種有害化合物的檢測要求。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種應(yīng)用表面等離子體共振儀的塑料玩具中有害化合物檢測方法，利用同一傳感芯片對不同有害化合物的含量進行檢測；其特征在于包括以下步驟
(一)傳感芯片表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入5-50 L濃度為l-50ii g/L已標記生物素的凝血酶適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上凝血酶適配體； (ニ)對待測有害化合物進行凝血酶標記，標記方法根據(jù)待測物基團不同，選擇EDC/NHS法交聯(lián)羧基與氨基或戊ニ醛法交聯(lián)兩個氨基；
(三)標準溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液配置有害化合物的標準樣品儲備液，儲備液濃度為0. Ing/mL至lmg/mL,用磷酸鹽緩沖液將儲備液配制成不同濃度的標準溶液，取不同濃度未標記待測有害化合物的標準溶液和凝血酶標記的待測有害化合物分充分混合后，競爭結(jié)合有害化合物相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中凝血酶標記的有害化合物應(yīng)不少于加入的適配體量；
(四)建立標準曲線采用表面等離子共振譜儀測量，以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準，通過微泵通入5-100 u L待測混合樣品，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖，通過檢測凝血酶的含量，間接檢測有害化合物；取不同濃度待測樣品的表面等離子體共振譜圖穩(wěn)定值，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標準曲線；
(五)定量檢測對于未知含量的有害化合物進行檢測，同樣按照步驟(三)進行；采用表面等離子體共振檢測儀記錄有害化合物的光譜圖；將光譜圖中殘留組分的穩(wěn)定值代入相應(yīng)的回歸曲線方程，計算出塑料玩具中有害化合物的濃度值；
(六)通入0.01-0. 05mol/L (pH為2_3)的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗傳感芯片表面，進行傳感元件再生，用于其它有害化合物檢測。所述標記方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法?？梢圆捎煤怂徇m配體為識別分子，核酸適配體序列與待測物直接相關(guān)。所述步驟(一)傳感器表面適配體固定，包括如下步驟
(1)將鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片插入表面等離子體共振檢測儀中，在工作通道中進行在線傳感表面修飾；
(2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液；
(3)通入5-50UL濃度為1-50 y g/L生物素修飾的凝血酶適配體溶液，進行在線偶聯(lián)至
基線穩(wěn)定；
(4)重復(fù)步驟(2)至(3)，獲得凝血酶適配體修飾的傳感芯片?？梢圆捎媚笜擞洿郎y物，與未標記樣品一起與核酸適配體發(fā)生特異性競爭識別。所述步驟(三)中納米粒子可以是金屬納米粒子或磁性納米粒子或高分子化合物。所述步驟(四)和(五)中通過檢測凝血酶的含量，間接檢測有害化合物的濃度值，提高表面等離子體傳感芯片的可重復(fù)利用性，適用于各種有害化合物的檢測。本發(fā)明的有益效果
(I)本發(fā)明解決塑料玩具中有害化合物檢測芯片的專一性差問題，引入凝血酶作為標記分子，采用生物素標記的適配體對表面等離子體共振傳感芯片進行修飾，將塑料玩具中有害化合物的測量轉(zhuǎn)換為對凝血酶的測量，實現(xiàn)傳感芯片的通用性，使用同一傳感芯片對塑料玩具中不同有害化合物進行檢測。具體檢測原理見附圖I ;(2)本發(fā)明解決芯片穩(wěn)定性差問題，采用適配體作為芯片表面通用配體，再生容易。相對抗體可重復(fù)使用性強，極大地延長了芯片的使用壽命，降低檢測成本；
(3)本發(fā)明解決試劑消耗量大問題，采用待測樣品中有害化合物和凝血酶標記的危有害化合物競爭識別有害化合物的適配體時，相對于以往的競爭抑制結(jié)合思想，無須加入過量的適配體，既實現(xiàn)了響應(yīng)信號放大，也節(jié)省了試劑消耗；
(4)本發(fā)明提高了檢測靈敏度，操作中可選用納米粒子修飾的有害化合物適配體，基于表面等離子體共振檢測時，信號顯著增加。


圖I是本發(fā)明所述的塑料玩具中有害化合物檢測原理圖；其中0為有害化合物，I為凝血酶標記的有害化合物，.為有害化合物的適配體，Ij為凝血酶的適配體，.為納米粒子。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作以詳細描述。實施例選擇塑料玩具中兩種典型有害化合物雙酚A和こ醇胺為檢測對象，具體操作步驟如下
(1)傳感器表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入20yL濃度為30y g/L已標記生物素的凝血酶適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上凝血酶適配體；
(2)分子探針標記物偶聯(lián)將待測物通過戊ニ醛法與凝血酶進行偶聯(lián)標記，標記方法根據(jù)待測物基團不同選擇，包括EDC/NHS法、戊ニ醛法等，如雙酚A，可采用EDC/NHS法與凝血酶連接，待用；
(3)標準溶液配制稱取雙酚A標準品10mg，溶解于0. 02mol/L (pH = 7. 4)磷酸鹽緩沖液定容至10 mL,即為I mg/mL的標準貯備液；用磷酸鹽緩沖液將儲備液配制成不同濃度的標準溶液，濃度在 ng/mL ii g/mL 級，依次為 Ong/mL, 500ng/mL, I u g/mL, 2 u g/mL,4 ii g/mL,6 u g/mL ；
(4)標準曲線繪制將上述濃度為0ng/mL未標記的標準溶液與適量的凝血酶標記雙酚A溶液充分混合；再加入雙酚A相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中凝血酶標記的雙酚A應(yīng)不少于加入的適配體量；采用表面等離子共振譜儀測量，通入0. 02mol/L(pH =7. 4)磷酸鹽緩沖液作為測量基準，然后泵入待測混合樣品，待表面等離子體共振響應(yīng)值穩(wěn)定后，記錄表面等離子體共振光譜 (5)通入0.02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-鹽酸溶液，沖洗傳感芯片表面，破壞凝血酶與適配體的結(jié)合,完成傳感元件再生；
(6)濃度由低到高，依次通入其他濃度(500ng/mL-600iig/mL)的待測標準樣品測量方法同(4)，獲得相應(yīng)表面等離子體共振光譜圖；取雙酚A的表面等離子體譜圖穩(wěn)定值，繪制標準曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得濃度-穩(wěn)定值關(guān)系回歸曲線方程；
(7)傳感芯片再生后，將實際未知濃度待測樣品按步驟(4)與適量凝血酶標記雙酚A溶液充分混合；泵入的表面等離子體共振譜儀中，同時記錄雙酚A的光譜圖，確定相應(yīng)穩(wěn)定值，代入各自標準曲線，確定各組分含量，檢測限可達ng/mf u g/mL級，低于國家規(guī)定的最聞允許含量；
(8)再次通入0. 02mol/L (pH = 2. 4)甘氨酸-鹽酸溶液,沖洗表面等離子體共振傳感芯片，進行芯片再生，用于こ醇胺的檢測；將適配體變換為こ醇胺適配體，而雙酚A-凝血酶偶聯(lián)物變?yōu)椁炒及?凝血酶偶聯(lián)物；こ醇胺檢測中步驟(3)中配制的溶液濃度改為Oy g/mL, 100 u g/mL, 200 u g/mL, 500 u g/mL, lmg/mL, 2mg/mL。檢測限可達 ii g/mL 級,低于國家規(guī)定的最聞允許含量。本發(fā)明為了敘述的準確和方便，在實施例中以雙酚A和こ醇胺為例進行詳細描述，但本發(fā)明同樣適用于塑料玩具中其他有害化合物的測定，如2，6-ニ叔丁基酚、苯胺等的精確檢測和定性分析。傳感器表面再生所用溶液選擇0. 02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-鹽酸溶液，但還可以選擇鹽溶液或弱酸弱堿溶液或高離子強度電解質(zhì)溶液，如0. 5 mol/L氫氧化鈉溶液或10 mmol/L甘氨酸/鹽酸緩沖溶液，破壞凝血酶與適配體的結(jié)合，因此上述內(nèi)容 均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。此外，根據(jù)實施例I的方法進行檢測樣品，與現(xiàn)有表面等離子體檢測技術(shù)相比，準確度提高2 10倍，探頭壽命延長10倍以上，現(xiàn)有表面等離子體檢測技術(shù)不能準確檢測的雙酚A等小分子量(〈lOOODa)物質(zhì)，可以采用本發(fā)明的方法獲得準確的檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用表面等離子體共振技術(shù)的塑料玩具中有害化合物的檢測方法，利用同一傳感芯片對不同有害化合物的殘留量進行檢測；其特征在于包括以下步驟 (一)傳感芯片表面適配體固定選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入5-50 L濃度為l-50ii g/L已標記生物素的凝血酶適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上凝血酶適配體； (ニ)對待測有害化合物進行凝血酶標記，標記方法根據(jù)待測物基團不同，選擇EDC/NHS法交聯(lián)羧基與氨基或戊ニ醛法交聯(lián)兩個氨基； (三)標準溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液配置有害化合物的標準樣品儲備液，儲備液濃度為0. Ing/mL至lmg/mL,用磷酸鹽緩沖液將儲備液配制成不同濃度的標準溶液，取不同濃度未標記待測化合物的標準溶液和凝血酶標記的待測有害化合物分充分混合后，競爭結(jié)合有害化合物相應(yīng)的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中凝血酶標記的有害化合物應(yīng)不少于加入的適配體量； (四)建立標準曲線采用表面等離子共振譜儀測量，以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準，通過微泵通入5-100 u L待測混合樣品，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖，通過檢測凝血酶的含量，間接檢測有害化合物；取不同濃度待測樣品的表面等離子體共振譜圖穩(wěn)定值，繪制工作曲線，并進行多項式曲線擬合，獲得回歸標準曲線； (五)定量檢測對于未知含量的有害化合物進行檢測，同樣按照步驟(三)進行；采用表面等離子體共振檢測儀記錄有害化合物的光譜圖；將光譜圖中殘留組分的穩(wěn)定值代入相應(yīng)的回歸曲線方程，計算出塑料玩具中有害化合物的濃度值； (六)通入0.01-0. 05mol/L (pH為2_3)的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗傳感芯片表面，進行傳感元件再生，用于其它有害化合物檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述標記方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于采用核酸適配體為識別分子，核酸適配體序列與待測物直接相關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(一)傳感器表面適配體固定，包括如下步驟 (1)將鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片插入表面等離子體共振檢測儀中，在工作通道中進行在線傳感表面修飾； (2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸鹽緩沖液； (3)通入5-50UL濃度為1-50 yg/L生物素修飾的凝血酶適配體溶液，進行在線偶聯(lián)至基線穩(wěn)定； (4)重復(fù)步驟(2)至(3)，獲得凝血酶適配體修飾的傳感芯片。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于采用凝血酶標記待測物，與未標記樣品一起與核酸適配體發(fā)生特異性競爭識別。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(三)中納米粒子可以是金屬納米粒子或磁性納米粒子或高分子化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(四)和(五)中通過檢測凝血酶的含量，間接檢測有害化合物的濃度值，提高表面等離子體傳感芯片的可重復(fù)利用性，適用于各種有害化合物的檢測。
全文摘要
一種基于表面等離子共振技術(shù)的塑料玩具中有害化合物的檢測方法，屬于有害化合物殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括傳感表面適配體固定、樣品標記、樣品檢測、傳感元件再生四個步驟，利用同一傳感芯片對不同有害化合物的殘留量進行檢測；其特征在于以凝血酶作為標記分子探針，將傳感芯片表面連接凝血酶適配體；對樣品進行一系列預(yù)處理，加入待測有害化合物的凝血酶標記物，混合后競爭結(jié)合金屬納米粒子修飾的有害化合物相應(yīng)的適配體；利用表面等離子體共振檢測儀檢測凝血酶的含量，間接檢測有害化合物；并對傳感芯片進行再生，用于檢測其它有害化合物。本發(fā)明為塑料玩具中有害化合物的檢測提供了一種穩(wěn)定性高、可重復(fù)性強、靈敏度高的通用檢測方法，實現(xiàn)了同一表面等離子體共振傳感芯片對不同有害化合物的檢測，具有極高的通用性。
文檔編號G01N21/55GK102628801SQ20121011072
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者王利兵, 蘇榮欣, 黃仁亮 申請人:王利兵