一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，為解決目前蛋白的快速實(shí)時(shí)檢測中ELISA等檢測方法復(fù)雜耗時(shí)費(fèi)試劑的缺點(diǎn)、電化學(xué)檢測方法的非特異性吸附和界面修飾等缺點(diǎn)，本發(fā)明提出了一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，將待測蛋白樣本、修飾了待測蛋白識別小分子的親和素或鏈霉親合素、調(diào)節(jié)探針、擴(kuò)增模板、切口酶、DNA聚合酶、緩沖液、dNTPs、氯化鎂、SYBR Green I 熒光染料制成混合溶液，在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，將待測蛋白濃度與等溫?cái)U(kuò)增曲線的出峰時(shí)間之間建立定量關(guān)系，實(shí)現(xiàn)蛋白的實(shí)時(shí)定量檢測。本方法具有簡單、特異性高、通用性強(qiáng)和可以實(shí)時(shí)定量檢測等優(yōu)勢，其檢測限能達(dá)到亞納摩爾級，可以滿足一般的蛋白檢測要求。
【專利說明】
一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種基于位阻效應(yīng)的實(shí)時(shí)定量蛋白檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來與疾病和癌癥相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的研究越來越受到重視，對這些蛋白標(biāo)志物的檢測在疾病診斷和臨床醫(yī)療中具有十分重要的地位。目前臨床上和實(shí)驗(yàn)室所采用的的蛋白檢測方法主要有:酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)、WeStern blot、表面等離子共振技術(shù)(SPR)和膠體金免疫試紙條等。這些檢測方法雖然具有較高的檢測靈敏度，但是也有操作步驟多、需要多次清洗、耗費(fèi)試劑量大和前處理過程復(fù)雜等缺點(diǎn)，整個(gè)分析過程通常需要幾個(gè)小時(shí)甚至更長，從而使得這些檢測方法在實(shí)際應(yīng)用上受到一定的限制。膠體金免疫試紙條技術(shù)雖然簡便易行，適合于現(xiàn)場快速檢測，但是由于只能進(jìn)行半定量分析、檢測結(jié)果的穩(wěn)定性較差而且檢測限較低，因此該檢測方法不宜定量較低濃度的蛋白。
[0003]相較于上述復(fù)雜的蛋白檢測方法，一步均相檢測法則具有較大的優(yōu)勢。一步均相檢測法將蛋白的特異性結(jié)合與信號的產(chǎn)生融合在均相溶液中，無需反復(fù)的洗滌和額外的試劑添加。雖然一步均相檢測法還達(dá)不到ELISA等方法的靈敏度，但是所需的檢測時(shí)間和投入的精力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于后者，這使得一步均相檢測法在現(xiàn)場檢測和高通量檢測等實(shí)際應(yīng)用中具有一定的優(yōu)勢。在近期的一些研究中，大量的一步均相檢測法被應(yīng)用于蛋白檢測中。這些方法主要是基于以下幾種策略:I)直接熒光調(diào)制檢測，包括直接熒光檢測、熒光偏振檢測和基于FRET技術(shù)的熒光檢測；2)調(diào)節(jié)變構(gòu)酶的活性檢測，通過蛋白與變構(gòu)酶的作用改變酶活性從而改變信號的產(chǎn)生;3)調(diào)節(jié)超分子空間結(jié)構(gòu)檢測，通過蛋白將超分子相互作用的結(jié)構(gòu)域分開或拉近，從而產(chǎn)生相應(yīng)的信號。在這些策略中，基于電化學(xué)檢測的方法由于快速便攜、試劑耗量少、通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛研究。但是電化學(xué)檢測基于界面吸附這一特性使得檢測的特異性容易受到電極表面非特異性吸附的影響，另外，電極表面的修飾、前處理和保存等也是其缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決目前蛋白的快速實(shí)時(shí)檢測中ELISA等檢測方法復(fù)雜耗時(shí)費(fèi)試劑的缺點(diǎn)、電化學(xué)檢測方法的非特異性吸附和界面修飾等缺點(diǎn)，本發(fā)明提出了一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，具有簡單、特異性高、通用性強(qiáng)和可以實(shí)時(shí)定量檢測等優(yōu)勢，其檢測限能達(dá)到亞納摩爾級，可以滿足一股的蛋白檢測要求。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法為將待測蛋白樣本、修飾了待測蛋白識別小分子的親和素或鏈霉親合素、調(diào)節(jié)探針、擴(kuò)增模板、切口酶、DNA聚合酶、緩沖液、dNTPs、氯化鎂、SYBR Green I熒光染料制成混合溶液，在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，將待測蛋白濃度與等溫?cái)U(kuò)增曲線的出峰時(shí)間之間建立定量關(guān)系，實(shí)現(xiàn)蛋白的實(shí)時(shí)定量檢測。切口酶首先與調(diào)節(jié)探針中的切口酶識別序列結(jié)合，修飾了待測蛋白識別小分子的親和素或鏈霉親合素與調(diào)節(jié)探針中所修飾的生物素結(jié)合，當(dāng)存在待測蛋白時(shí)，待測蛋白會立即與親和素或鏈霉親合素上的識別小分子特異性結(jié)合，由親和素或鏈霉親合素-待測蛋白組合所產(chǎn)生的位阻效應(yīng)將結(jié)合在該探針上的切口酶釋放，釋放的切口酶進(jìn)而參與等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對等溫?cái)U(kuò)增速率的調(diào)節(jié)，建立起待測蛋白與等溫?cái)U(kuò)增信號之間的定量關(guān)系。該方法只需要改變親和素或鏈霉親合素上所修飾的識別小分子就可以實(shí)現(xiàn)對其它大蛋白的測定。
[0006]作為優(yōu)選，所述蛋白檢測體系的終濃度組成為:0.01?5μΜ調(diào)節(jié)探針、0.01?5μΜ修飾了待測蛋白識別小分子的親和素或鏈霉親合素，且調(diào)節(jié)探針與修飾了待測蛋白識別小分子的親和素或鏈霉親合素的摩爾濃度比為1:1，0.0I?5μΜ擴(kuò)增模板、0.1?1U切口酶、0.1?1U DNA聚合酶、I?1x緩沖液(1x的組成和濃度為100mM NaCl、500mM Tris-HCl、1000yg/mL BSA)、0.1 ?ImM dNTPs、l?1mM氯化鎂、0.05?Ix SYBR Green I熒光染料。待測蛋白可與其他組份同時(shí)加入制成混合溶液或可以在其它組份制成混合溶液后再加入待測蛋白。
[0007]調(diào)節(jié)探針的結(jié)構(gòu)為一條寡核苷酸鏈構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)或由兩條寡核苷酸鏈雜交形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)探針上修飾有生物素。
[0008]莖環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針由莖、環(huán)、5’側(cè)臂、3’側(cè)臂、生物素組成，莖的一端與環(huán)連接，另一端分別與5’側(cè)臂、3’側(cè)臂連接，復(fù)合結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針由莖、5’側(cè)臂、3’側(cè)臂、生物素組成，莖的一端分別與5 ’側(cè)臂、3 ’側(cè)臂連接，5 ’側(cè)臂、3 ’側(cè)臂分別為單鏈側(cè)臂。
[0009]作為優(yōu)選，調(diào)節(jié)探針的5’側(cè)臂的堿基數(shù)目和3’側(cè)臂的堿基數(shù)目至少有一個(gè)大于3。調(diào)節(jié)探針的結(jié)構(gòu)對調(diào)節(jié)探針結(jié)合切口酶的性能具有很大的影響，以保證切口酶與調(diào)節(jié)探針之間的適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合力大小，進(jìn)而調(diào)節(jié)擴(kuò)增反應(yīng)速率。
[0010]調(diào)節(jié)探針的莖為雙鏈，莖或莖環(huán)包含切口酶識別序列和非切口酶識別序列，切口酶識別序列靠近兩側(cè)臂端。切口酶與調(diào)節(jié)探針中的識別序列相結(jié)合，非切口酶序列的核苷酸數(shù)多3。親和素或鏈霉親合素與調(diào)節(jié)探針中修飾的生物素進(jìn)行結(jié)合，待測蛋白與親和素或鏈霉親合素上修飾的小分子進(jìn)行特異性結(jié)合。
[0011]調(diào)節(jié)探針上生物素修飾在莖或莖環(huán)上的非切口酶識別序列上，緊鄰切口酶識別序列一側(cè)的非切口酶識別序列中的第4或第5個(gè)堿基上，優(yōu)選為第4個(gè)堿基上修飾。調(diào)節(jié)探針上生物素修飾的位置對調(diào)節(jié)探針結(jié)合切口酶的性能具有很大的影響，否則結(jié)合在切口酶識別序列上的調(diào)節(jié)探針無法有效結(jié)合切口酶，無法調(diào)節(jié)擴(kuò)增反應(yīng)的速率。本發(fā)明識別小分子的修飾既不影響切口酶與探針的結(jié)合，又使得待測蛋白與調(diào)節(jié)探針結(jié)合后能和切口酶之間產(chǎn)生最佳的有效位阻效應(yīng)。
[0012]莖環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針的環(huán)結(jié)構(gòu)是單鏈結(jié)構(gòu)，其核苷酸數(shù)目多O。
[0013]擴(kuò)增模板從3’到5’依次為結(jié)合序列、切口酶識別序列和擴(kuò)增序列，其中擴(kuò)增序列和結(jié)合序列的一部分或全部完全相同。擴(kuò)增反應(yīng)可以使用與擴(kuò)增模板的結(jié)合序列互補(bǔ)的引物來觸發(fā)，也可以僅僅依靠擴(kuò)增模板的非特異性等溫?cái)U(kuò)增來產(chǎn)生信號。
[0014]所述切P 酶選自 Nt.BstNBI 'Nb.BsrDKNb.BtsKN.AlwKNt.BsmAKNt.BspQI 中一種；
[0015]所述DNA聚合酶是具有鏈置換活性的核苷酸聚合酶。優(yōu)選為BstDNA聚合酶、Vent(exo_)聚合酶、Klenow DNA聚合酶。
[0016]擴(kuò)增反應(yīng)的溫度為30?80°C，優(yōu)選反應(yīng)溫度為切口酶和DNA聚合酶發(fā)揮作用所對應(yīng)的最佳溫度；
[0017]本發(fā)明所述反應(yīng)緩沖液主要用于提供合適的反應(yīng)環(huán)境，使相應(yīng)的酶發(fā)揮酶催化功能，并維持核酸分子的穩(wěn)定。
[0018]本發(fā)明的檢測方法的基本過程如下:
[0019](I)修飾了待測蛋白識別小分子的親和素或鏈霉親合素與調(diào)節(jié)探針中修飾的生物素相結(jié)合;待測蛋白通過和修飾在調(diào)節(jié)探針上的識別小分子特異性結(jié)合；
[0020](2)待測蛋白會立即與親和素或鏈霉親合素上修飾的識別小分子特異性結(jié)合；
[0021](3)由親和素或鏈霉親合素-待測蛋白組合所產(chǎn)生和施加的位阻效應(yīng)，使得結(jié)合在調(diào)節(jié)探針相應(yīng)識別位點(diǎn)上的切口酶與調(diào)節(jié)探針分離；
[0022](4)因位阻效應(yīng)與調(diào)節(jié)探針分離的切口酶被釋放到溶液中，參與發(fā)生在擴(kuò)增模板上的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號被實(shí)時(shí)監(jiān)測，最終得到時(shí)間相關(guān)的信號曲線。
[0023]在本發(fā)明中，我們利用位阻效應(yīng)來調(diào)節(jié)溶液中相關(guān)酶的有效濃度，建立起待測蛋白和酶催化信號之間的定量關(guān)系
[0024]本方法為一步均相檢測方法，既克服了ELISA等檢測方法復(fù)雜耗時(shí)費(fèi)試劑的缺點(diǎn)，又沒有電化學(xué)檢測方法的非特異性吸附和界面修飾等缺點(diǎn)。另外，目前的一步均相蛋白檢測方法均為終點(diǎn)單點(diǎn)信號檢測方式，使得其在快速高通量檢測領(lǐng)域受到一定的限制。本發(fā)明方法利用了等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，將蛋白的檢測模式從傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量模式轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)時(shí)定量模式(類似于Real-time PCR的檢測模式)，從而建立起待測蛋白濃度與等溫?cái)U(kuò)增曲線出峰時(shí)間之間的定量關(guān)系，使得本發(fā)明方法的優(yōu)勢更加明顯。
[0025]本發(fā)明只需要改變親和素或鏈霉親合素上所修飾的識別小分子就可以實(shí)現(xiàn)對其它大蛋白的測定。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:具有簡單、特異性高、通用性強(qiáng)和可以實(shí)時(shí)定量檢測等優(yōu)勢，其檢測限能達(dá)到亞納摩爾級，可以滿足一股的蛋白檢測要求。
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明所述調(diào)節(jié)探針的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028]其中:A為莖環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針，B為復(fù)合結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針；
[0029]圖2為本發(fā)明所述蛋白檢測方法的原理示意圖；
[0030]圖3(A)為實(shí)施例1中檢測不同濃度梯度的IgG存在時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光定量曲線；(B)為實(shí)施例1對應(yīng)的IgG蛋白濃度與出峰時(shí)間之間的定量曲線(B);
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合說明附圖，通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0032]本發(fā)明所述調(diào)節(jié)探針的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，A為莖環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針，B為復(fù)合結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針。實(shí)施例選用莖環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針，其結(jié)構(gòu)如圖1 (A)所示，調(diào)節(jié)探針:
[0033]5’-GCTCATCACTGCACTGACTCACGTTTT(T-b1tin)CGTGAGTCAACTCCTGTAAG-3’(SEQID N0.1)(用識別小分子生物素b1tin修飾T堿基)；
[0034]擴(kuò)增模板:
[0035]5’-CTCACGCTACGGACGACTCTCTCACGCTAC-3’(SEQ ID N0.2)；
[0036]以IgG(地高辛抗鼠抗體)蛋白作為待測蛋白，親和素上修飾有地高辛抗鼠抗體的識別小分子地高辛-Dig，
[0037]實(shí)施例1
[0038](I)取5個(gè)EP管，各加入2.5yL反應(yīng)緩沖液(100mM NaCl、500mM Tris-HCl、600yg/mL BSA)，0.2yL切口酶Nt.BstNBI(濃度為 10UAxL)，0.1yL Bst DNA聚合酶(濃度為8U/yL)，IyL dNTPs(濃度為 10mM)，4yL MgCl2(濃度為 25mM)，I.25yL 1xSYBR Green I，1.25yL 擴(kuò)增模板(濃度為ΙμΜ)、2.5yL調(diào)節(jié)探針(濃度為200ηΜ)、2.5yL親和素(濃度為200nM)和7.3yL水，標(biāo)號厶1、厶2、厶3、厶4、八5，
[0039](2)往六1管內(nèi)加入2.5yL IgG蛋白溶液(濃度為200nM);往六2管內(nèi)加入2.5yL IgG蛋白溶液(濃度為150nM);往A3管內(nèi)加入2.5yL IgG蛋白溶液(濃度為10nM);往A4管內(nèi)加入2.5yL IgG蛋白溶液(濃度為50nM);往六5管內(nèi)加入2.5yL水作為對照組。
[0040](3)將上述5管溶液置于55°C溫育，使反應(yīng)充分進(jìn)行并測定混合溶液的熒光隨時(shí)間的變化，采集時(shí)間間隔為I分鐘。
[0041]實(shí)施例1對親和素的檢測靈敏度進(jìn)行測定的擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光曲線結(jié)果如圖3A所示。由圖3A可見，在測定不同濃度的IgG蛋白時(shí)，調(diào)節(jié)探針存在時(shí)的擴(kuò)增曲線的出峰時(shí)間隨著IgG蛋白濃度的增大而顯著縮短，表明IgG蛋白和調(diào)節(jié)探針-親和素組合結(jié)合后與已結(jié)合在探針上的切口酶之間的位阻效應(yīng)能將切口酶有效釋放到溶液中，且IgG蛋白濃度越大，釋放的切口酶越多，擴(kuò)增速率越快，擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間越短。因此能夠?qū)gG蛋白的濃度和擴(kuò)增出峰時(shí)間之間建立一種線性定量關(guān)系，該線性定量關(guān)系如圖3B所示。
[0042]在圖3B中，橫坐標(biāo)為親和素濃度，縱坐標(biāo)為不同親和素濃度下的出峰時(shí)間，該線性曲線符合線性方程T = -0.53C+19.7，R2為0.99104，其中T表示擴(kuò)增的S型曲線信號變化最大處的時(shí)間，C表示親和素濃度。由此可見本方法檢測的線性較好，其檢測限可達(dá)可達(dá)亞納摩爾級，與近期的其他一步均相蛋白檢測法的靈敏度相似并有所提高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法為將待測蛋白樣本、修飾了待測蛋白識別小分子的親和素或鏈霉親合素、調(diào)節(jié)探針、擴(kuò)增模板、切口酶、DNA聚合酶、緩沖液、dNTPs、氯化鎂、SYBR Green I熒光染料制成混合溶液，在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，將待測蛋白濃度與等溫?cái)U(kuò)增曲線的出峰時(shí)間之間建立定量關(guān)系，實(shí)現(xiàn)蛋白的實(shí)時(shí)定量檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，其特征在于，調(diào)節(jié)探針的結(jié)構(gòu)為一條寡核苷酸鏈構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)或由兩條寡核苷酸鏈雜交形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)探針上修飾有生物素。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，其特征在于，莖環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針由莖、環(huán)、5’側(cè)臂、3’側(cè)臂、生物素組成，莖的一端與環(huán)連接，另一端分別與5’側(cè)臂、3’側(cè)臂連接，復(fù)合結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針由莖、5’側(cè)臂、3’側(cè)臂、生物素組成，莖的一端分別與5’側(cè)臂、3’側(cè)臂連接。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，其特征在于，調(diào)節(jié)探針的5’側(cè)臂的堿基數(shù)目和3’側(cè)臂的堿基數(shù)目中任意一個(gè)或兩個(gè)大于3。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，其特征在于，調(diào)節(jié)探針的莖或莖環(huán)包含切口酶識別序列和非切口酶識別序列，切口酶識別序列靠近兩側(cè)臂端，非切口酶序列的核苷酸數(shù)多3。6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，其特征在于，調(diào)節(jié)探針上生物素修飾在緊鄰切口酶識別序列一側(cè)的非切口酶識別序列中的第4或第5個(gè)堿基上。7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，其特征在于，莖環(huán)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)探針的環(huán)結(jié)構(gòu)是單鏈結(jié)構(gòu)，其核苷酸數(shù)目多0。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，其特征在于，擴(kuò)增模板從3’到5，依次為結(jié)合序列、切口酶識別序列和擴(kuò)增序列，其中擴(kuò)增序列和結(jié)合序列的一部分或全部完全相同。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白實(shí)時(shí)定量檢測方法，其特征在于，所述切口酶選自Nt.BstNB1、Nb.BsrDKNb.Bts1、Ν.Alw1、Nt.BsmA1、Nt.BspQI 中一種；所述 DNA 聚合酶是具有鏈置換活性的核苷酸聚合酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK106093415SQ201610285142
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】周建光, 吳望華, 張濤, 于東冬, 秦亞洲
【申請人】浙江大學(xué)