一種甲胎蛋白的定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種甲胎蛋白的定量檢測方法，該方法由以下步驟組成：（1）將甲胎蛋白抗體與醛化糖化酶溶液混合制備酶標抗體；將甲胎蛋白抗體負載到納米金磁微粒上；（2）甲胎蛋白抗原樣品和一系列不同濃度的甲胎蛋白抗原標準品加入到負載抗體的納米金磁微粒的免疫反應界面中進行溫育，然后用血糖儀測得葡萄糖濃度，從而得到甲胎蛋白濃度與葡萄糖濃度對應關系的線性方程，最后將甲胎蛋白抗原樣品的葡萄糖濃度值代入線性方程中換算出甲胎蛋白抗原樣品的甲胎蛋白濃度。本發(fā)明所述方法不僅靈敏度高，而且方便快捷、成本低。
【專利說明】一種甲胎蛋白的定量檢測方法【技術領域】[0001]本發(fā)明涉及借助于測定材料的化學或物理性質來測試或分析材料，具體涉及蛋白 質的檢測方法?！颈尘凹夹g】[0002]人體甲胎蛋白（AFP)來源于胎兒的糖蛋白，分子量約為70KDa，成人的甲胎蛋白可 由惡性腫瘤產(chǎn)生，特別是肝癌和胚胎細胞腫瘤，70-95%的原發(fā)性肝癌患者血清中AFP含量 有明顯升高，在肝炎和肝硬化的患者中甲胎蛋白也常有輕微的升高。因此，對AFP的臨床 分子診斷顯得十分重要，尤其是靈敏度檢測對及早發(fā)現(xiàn)腫瘤并制定治療方案極為重要。目 前，測定AFP免疫檢測方法較多，最常用的血清檢測方法有：酶免疫法（EIA)、放射免疫法 (RIA)、化學發(fā)光法以及時間分辨免疫熒光分析法（TRFIA)。其中，酶標法為半定量試劑，在 準確性、靈敏度上存在很大的局限性，并且對于酶的活性極易受標記反應以及溫度、PH值及 溶液中離子濃度等因素的影響、線性范圍窄、費時等缺點；放射性免疫法操作帶放射性以及 標志物放置時間短，試劑有效期較短等缺點；化學發(fā)光法的優(yōu)點是靈敏度高、線性范圍寬、 分析時間短，但該方法尚存在下述不足：1、化學發(fā)光的產(chǎn)生通常是瞬間完成的，發(fā)光峰值很 快衰減，而且成本較高；2、溫度和pH值對發(fā)光有很大影響，制約該方法的推廣使用。[0003]因此，尋求一種方便快捷且靈敏度高的定量檢測甲胎蛋白的方法一直成為業(yè)界的 努力方向。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明所要解決的問題是提供一種甲胎蛋白的定量檢測方法，該方法不僅靈敏度 高，而且方便快捷、成本低。[0005]本發(fā)明解決上述問題的技術方案如下：[0006]一種甲胎蛋白的定量檢測方法，該方法由以下步驟組成：[0007]( I)分別按下述方法制備酶標抗體和負載抗體的納米金磁微粒：[0008](I. I)制備酶標抗體：取8 μ L糖化酶溶于O. 2mL體積濃度為I. 25%的戊二醛，室 溫結合3h后用除鹽柱去除游離的戊二醛，得醛化糖化酶溶液；先將O. Img甲胎蛋白抗體溶 于13 μ L0. 15mol/L NaCl，再與所得到的醛化糖化酶溶液混合后，加入lmol/L pH9. 6的碳 酸鹽緩沖液，調節(jié)PH至9. 0-9. 5，4°C下結合12h后加入4 μ L0. 2mol/L賴氨酸，終止反應后 4°C放置2h ；[0009](I. 2)制備負載抗體的納米金磁微粒：取粒徑為50nm的納米金磁微粒5mg,用去離 子水洗三遍，加入NaOH調pH至9. O,然后依次加入O. 2mg甲胎蛋白抗體和30mg牛血清白蛋 白，4°C下反應6h，外加磁性條件下磁性分離，洗滌，得到負載抗體的納米金磁微粒；[0010](2)分別按下述方法進行定量線性方程的建立和甲胎蛋白抗原樣品的檢測：[0011](2. I)定量線性方程的建立：取甲胎蛋白抗原標準品，先按相同體積配制一系列不 同濃度的抗原標準品溶液，再分別將每一抗原標準品溶液50μ L加入到步驟（I. 2)所得負載抗體的納米金磁微粒的免疫反應界面中，先37°C溫育30min，洗滌；將步驟（I. I)制備的酶標抗體配成80 μ g/ml懸液,在金磁納米免疫反應界面中滴加50 μ L酶標抗體懸液，37°C 溫育30min，去離子水洗滌；然后，往所述免疫反應界面加入濃度為20mg/mL的液化淀粉溶液1(^1^，601：下反應301^11后用血糖儀測得葡萄糖的濃度；最后，采用平均斜率法以葡萄糖濃度對抗原標準品溶液濃度進行線性回歸便得到葡萄糖濃度與甲胎蛋白濃度對應關系的線性方程；其中，所述的液化淀粉溶液是先將淀粉用PBS調成20mg/mL的淀粉溶液并煮沸，然后按淀粉溶液：耐高溫α -淀粉酶=500 ： 3的體積比加入耐高溫α -淀粉酶得到；[0012](2. 2)甲胎蛋白抗原樣品的檢測：將甲胎蛋白抗原樣品加入到金磁納米免疫反應界面中，采用與步驟（2. I)中所述檢測甲胎蛋白抗原標準品中葡萄糖濃度的同樣方法和反應條件，用血糖儀測得甲胎蛋白抗原樣品中的葡萄糖濃度；然后，將甲胎蛋白抗原樣品的葡萄糖濃度值代入步驟（2. I)所得到的線性方程中即可算出甲胎蛋白抗原樣品的甲胎蛋白濃度。[0013]上述方案中，所述的納米金磁微粒為購于西安金磁納米生物技術有限公司的液態(tài)產(chǎn)品，該產(chǎn)品中納米金磁微粒的濃度為5mg/mL。[0014]上述方案中，所述的血糖儀是市面上常見的便攜式血糖儀，使用便攜式血糖儀檢測快、儀器試劑成本低。[0015]本發(fā)明所述的方法利用糖化酶標記的抗體作為二抗探針，利用糖化酶水解淀粉產(chǎn)生葡萄糖這一過程，實現(xiàn)將甲胎蛋白的檢測轉化為葡萄糖的檢測，夾心免疫反應在金磁納米顆粒界面進行。[0016]本發(fā)明所述的方法，其中，二抗探針為通過戊二醛交聯(lián)的方法制備的酶標抗體，所述糖化酶是一種廉價的市售水解酶，與靈敏度較高的電化學發(fā)光方法相比，由于化學發(fā)光法中發(fā)光材料成本較高,因此本法成本較電化學發(fā)光法相比成本更低?！緦＠綀D】

【附圖說明】[0017]圖I是所述方法的檢測過程原理示意圖。[0018]圖2是納米金磁微粒及利用其構建的免疫反應界面的透射電鏡圖像。[0019]圖3是納米金磁微粒及利用其構建的免疫反應界面的紫外-可見光譜的條形圖。[0020]圖4是檢測不同濃度AFP的與檢測到的葡萄糖濃度的線性關系圖。[0021]圖5是本發(fā)明所述方法與電化學發(fā)光方法準確性的對比圖?！揪唧w實施方式】[0022]實施例I[0023]I.制備負載抗體的納米金磁微粒[0024]取西安金磁納米生物 技術有限公司生產(chǎn)的GoldMag-CS納米金磁微粒懸浮液(該產(chǎn)品濃度為5mg/mL,納米金磁微粒的粒徑為50nm) ImL,分離出納米金磁微粒用去離子水洗三遍，加入NaOH調pH至9. 0，然后依次加入O. 2mg抗甲胎蛋白抗體（鄭州博賽生物技術股份有限公司）、30mg牛血清白蛋白（BSA)，4°C攪拌6小時后，外加磁性條件下磁性分離，洗滌，得到負載抗體的納米金磁微粒。[0025]參見圖2，將所到的負載抗體的納米金磁微粒在透射電鏡下進行觀察，可見在免疫磁性納米顆粒周圍有電子密度較低的陰影，說明制備抗體成功結合到納米金磁顆粒上。[0026]采用NanoDrop2000/2000c分光光度計的方法對構建過程進行表征（圖3)。由圖 3可見抗體與納米金磁微粒結合后溶液中抗體的濃度降低，表明抗體結合到納米金磁顆粒上。[0027]2.制備酶標抗體[0028]取8 μ L糖化酶溶于O. 2mL體積濃度為I. 25%的戊二醛，室溫結合3h后用除鹽柱去除游離的戊二醛，得醛化糖化酶溶液；先將O. Img甲胎蛋白抗體溶于13yL0. 15mol/ LNaCl，再與所得到的醛化糖化酶溶液混合后，加入lmol/L pH9. 6的碳酸鹽緩沖液，調節(jié)pH 至9. 0-9. 5,4°C下結合12h后加入4μ L0. 2mol/L賴氨酸,終止反應后4°C放置2h ；[0029]3.制備液化淀粉溶液[0030]淀粉的液化分為糊化和液化兩個過程。淀粉糊化：準確稱取一定量的淀粉加PBS 調成20mg/mL的淀粉溶液，加熱煮沸30分鐘；淀粉液化：取ImL淀粉溶液加入6 μ L耐高溫 α -淀粉酶。[0031]4.定量線性方程的建立：[0032](a)用去離子水將AFP抗原標準品（購于鄭州博賽生物技術股份有限公司）稀釋成 0.01ng/ml, O. lng/ml, lng/ml, 5ng/ml, lOng/ml, 20ng/ml, 50ng/ml, lOOng/ml,上述步驟 I所得到的負載抗體的納米金磁微粒的金磁納米免疫反應界面中分別加入50 μ L不同濃度的AFP抗原溶液標準品，并在37°C下溫育30min，反應完后用去離子水小心洗去未反應抗原。[0033](b)將步驟2合成的酶標抗體配成80 μ g/ml懸液，在金磁納米免疫反應界面中滴加50 μ L酶標抗體懸液，37°C溫育30min，去離子水小心洗滌。[0034](C)在金磁納米免疫反應界面中加入1(^1^夜化淀粉，601：反應301^11 ;用便攜式血糖儀檢測水解產(chǎn)生的葡萄糖的濃度。[0035](d)將步驟（C)所得到的葡萄糖濃度與對應抗原標準品溶液的濃度一組數(shù)據(jù)，采用平均斜率法以葡萄糖濃度對抗原標準品溶液濃度進行線性回歸分析，便得到葡萄糖濃度與抗原標準品溶液濃度對應關系的線性方程Λ Cglucose=0.07496Cafp+0. 90611，即如圖4所示的標準曲線。[0036]5.甲胎蛋白抗原濃度的檢測[0037]將南方醫(yī)院捐贈的甲胎蛋白抗原血清加入到金磁納米免疫反應界面中，采用與步驟4中所述檢測甲胎蛋白抗原標準品中葡萄糖濃度的同樣方法和反應條件，用便攜式血糖儀測得甲胎蛋白抗原樣品中的葡萄糖濃度；然后，將甲胎蛋白抗原樣品的葡萄糖濃度值代入步驟4所得到的線`性方程中即可算出甲胎蛋白抗原樣品的甲胎蛋白濃度。上述檢測原理如圖I所示。[0038]實施例2 (檢測低限）[0039]一、實驗材料[0040]I.抗原：將低濃度標準品（5ng/mL)用去離子水稀釋成0.005ng/mL ；[0041]抗體：甲胎蛋白單克隆一抗及二抗均購于鄭州博賽生物技術股份有限公司。[0042]2.酶標抗體：按實施例I步驟2所述方法制得。[0043]3.底物[0044]3. I、樣品：按實施例I制得的液化淀粉。[0045]3. 2、對照品[0046]對照品I :未經(jīng)任何處理的淀粉溶液，20mg/mL。[0047]對照品2 :糊化淀粉：準確稱取一定量的淀粉加PBS調成20mg/mL的淀粉溶液，加熱煮沸30min。[0048]二、實驗方法[0049]用與實施例I相同的檢測方法對空白和濃度為0.005ng/mL的AFP標準品重復測定10次，按照檢測低限=G+3S，G為空白組的信號響應均值，S為標準差。[0050]表1兩組濃度AFP響應量及計算結果項目空白 0.005ng/mL[0051]
【權利要求】
1.一種甲胎蛋白的定量檢測方法，該方法由以下步驟組成：(O分別按下述方法制備酶標抗體和負載抗體的納米金磁微粒：(1.0制備酶標抗體：取8 μ L糖化酶溶于O. 2mL體積濃度為I. 25%的戊二醛，室溫結合3h后用除鹽柱去除游離的戊二醛，得醛化糖化酶溶液；先將O. Img甲胎蛋白抗體溶于 13 μ LO. 15mol/L NaCl，再與所得到的醛化糖化酶溶液混合后，加入lmol/L ρΗ9· 6的碳酸鹽緩沖液，調節(jié)PH至9. 0-9. 5，4°C下結合12h后加入4 μ L0. 2mol/L賴氨酸，終止反應后4°C 放置2h ；(I. 2)制備負載抗體的納米金磁微粒：取粒徑為50nm的納米金磁微粒5mg,用去離子水洗三遍，加入NaOH調pH至9. O,然后依次加入O. 2mg甲胎蛋白抗體和30mg牛血清白蛋白， 4°C下反應6h，外加磁性條件下磁性分離，洗滌，得到負載抗體的納米金磁微粒；(2)分別按下述方法進行定量線性方程的建立和甲胎蛋白抗原樣品的檢測：(2. I)定量線性方程的建立：取甲胎蛋白抗原標準品，先按相同體積配制一系列不同濃度的抗原標準品溶液，再分別將每一抗原標準品溶液50 μ L加入到步驟（I. 2)所得負載抗體的納米金磁微粒的免疫反應界面中，先37°C溫育30min，洗滌；將步驟（I. I)制備的酶標抗體配成80 μ g/ml懸液,在金磁納米免疫反應界面中滴加50 μ L酶標抗體懸液,37°C溫育30min，去離子水洗滌；然后，往所述免疫反應界面加入濃度為20mg/mL的液化淀粉溶液 1(^1^，601：下反應301^11后用血糖儀測得葡萄糖的濃度；最后，采用平均斜率法以葡萄糖濃度對抗原標準品溶液濃度進行線性回歸便得到葡萄糖濃度與甲胎蛋白濃度對應關系的線性方程；其中，所述的液化淀粉溶液是先將淀粉用PBS調成20mg/mL的淀粉溶液并煮沸， 然后按淀粉溶液：耐高溫α -淀粉酶=500 ： 3的體積比加入耐高溫α -淀粉酶得到； (2.2)甲胎蛋白抗原樣品的檢測：將甲胎蛋白抗原樣品加入到金磁納米免疫反應界面中，采用與步驟（2. I)中所述檢測甲胎蛋白抗原標準品中葡萄糖濃度的同樣方法和反應條件，用血糖儀測得甲胎蛋白抗原樣品中的葡萄糖濃度；然后，將甲胎蛋白抗原樣品的葡萄糖濃度值代入步驟（2. I)所得到的線性方程中即可算出甲胎蛋白抗原樣品的甲胎蛋白濃度。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種甲`胎蛋白的定量檢測方法，其特征在于，所述的血糖儀為便攜式血糖儀。
【文檔編號】G01N33/68GK103558396SQ201310520866
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權日:2013年10月29日
【發(fā)明者】干寧, 鄭磊, 劉芹蘭, 王前 申請人:寧波大學, 南方醫(yī)科大學