專利名稱：利用生物分析儀測(cè)定液體樣品的被分析物含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用生物分析儀測(cè)定液體樣品的被分析物含量的方法。
背景技術(shù)：
生物傳感器可被細(xì)分成基于親和性的生物傳感器和代謝性生物傳感器，用于待檢測(cè)液體樣品中包含的預(yù)定被分析物的優(yōu)選選擇性和特異性檢測(cè)各用于濃度測(cè)量。在這樣的情形中，一大類各式各樣的生物傳感器包含:受體層，其可以具有固定在表面上的大量受體，所述受體例如抗體、半抗原、DNA、細(xì)胞或酶；信號(hào)轉(zhuǎn)換器，其輸出與結(jié)合在所述受體層上的被分析物的量相關(guān)的測(cè)量信號(hào)；以及信號(hào)處理系統(tǒng)，其用于放大和/或進(jìn)一步處理由所述信號(hào)轉(zhuǎn)換器輸出的測(cè)量信號(hào)。被分析物可以是液體樣品中的待檢測(cè)物質(zhì)，所述物質(zhì)例如為生物化學(xué)、生物學(xué)或醫(yī)學(xué)系統(tǒng)中待檢測(cè)的蛋白質(zhì)、肽、抗體、酶或一些其他物質(zhì)。然而，被分析物也可以是在環(huán)境監(jiān)測(cè)或水質(zhì)監(jiān)測(cè)的情形中需要檢測(cè)或測(cè)定的細(xì)胞、細(xì)胞組分或DNA或例如活性成分。在基于親和性的生物傳感器的情形中，在給定情況下，除了被分析物之外，可能還必需使其他物質(zhì)連接于受體層的受體。優(yōu)選以高特異性和選擇性結(jié)合于受體的物質(zhì)，在這里被統(tǒng)稱為靶分子，或者也被稱為這樣的受體的配體。因此，在給定生物傳感器的情況下，被分析物表示受體的靶分子。然而，其他靶分子也可以是不同于真正被分析物的分子，并且，這些分子類似地連接于受體層的受體，并與例如被分析物競(jìng)爭(zhēng)受體層的結(jié)合位置。在代謝性生物傳感器的情形中，被分析物和/或其他靶分子在瞬時(shí)結(jié)合于受體層后發(fā)生催化轉(zhuǎn)化，在代謝性生物傳感器的情形中所述受體層含有至少一種酶、細(xì)胞、細(xì)胞組分或其他催化有效的生物分子，它們?cè)诮o定情況下能夠催化轉(zhuǎn)化所述被分析物和另外存在的物質(zhì)。為了檢測(cè)液體樣品中的被分析物或測(cè)定其濃度，將液體樣品與受體層進(jìn)行接觸，使得被分析物分子以及在給定情況下存在于液體樣品中的其他靶分子連接于受體層或被受體層轉(zhuǎn)化。通過這種方式實(shí)現(xiàn)物理和/或化學(xué)變化，例如涂層厚度、折射率、光吸收或電荷的變化?？梢岳眯盘?hào)轉(zhuǎn)換器來檢測(cè)和/或定量測(cè)定這些變化。用于記錄所述變化的適合的信號(hào)轉(zhuǎn)換器包括例如光電傳感器和測(cè)量電流或電壓的傳感器。也可以用具有例如發(fā)光或磁特性的標(biāo)記物直接或間接標(biāo)記結(jié)合在受體層上的祀分子，或者在祀分子結(jié)合到受體層上之后進(jìn)行直接或間接的后續(xù)標(biāo)記。在這種情況下，光學(xué)傳感器適合作為用于記錄發(fā)光的信號(hào)轉(zhuǎn)換器，或者磁性傳感器適合用于記錄磁特性。適合作為標(biāo)記物的其他物質(zhì)還包括催化后續(xù)化學(xué)反應(yīng)的酶，其中可以用相應(yīng)的適合的信號(hào)轉(zhuǎn)換器來記錄所述反應(yīng)的過程。已知有大量不同的各式各樣的生物傳感器方法。下面將提及并通過實(shí)例簡(jiǎn)要解釋最常用的方法:-肓接法:被分析物結(jié)合在受體層的受體上，并且不存在其他靶分子。在這種方法的改良中，被分析物在結(jié)合到受體上之前或之后與一種或多種附加物質(zhì)(標(biāo)記物)反應(yīng)，這一般來說用于直接或間接引入被分析物不具有的物理特性，并因此可以通過測(cè)定這種所提供的物理特性來檢測(cè)被分析物的結(jié)合。因此，在直接法的情形中，被分析物在受體層上的結(jié)合被直接檢測(cè)到，或通過檢測(cè)與被分析物反應(yīng)的標(biāo)記物而被間接檢測(cè)到。
-競(jìng)爭(zhēng)法:一般來說，向待檢測(cè)被分析物含量的液體樣品添加已知濃度或活性的其他靶分子(競(jìng)爭(zhēng)物)，然后將如此獲得的待測(cè)量液體施加到受體層。在這樣的情況下，在被分析物與競(jìng)爭(zhēng)物之間存在對(duì)在受體層的受體上的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。一般來說，競(jìng)爭(zhēng)物具有標(biāo)記物，這繼而直接或間接地向系統(tǒng)中引入可以被檢測(cè)到的物理特性。因此，在競(jìng)爭(zhēng)法的情形中，競(jìng)爭(zhēng)物在受體層上的結(jié)合被直接檢測(cè)到，或通過檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)物的標(biāo)記物而被間接檢測(cè)到。然后可以從測(cè)量信號(hào)推導(dǎo)出液體樣品的原始被分析物濃度。
-結(jié)合抑制試驗(yàn):向待檢測(cè)被分析物含量的液體樣品添加已知濃度或活性的與被分析物結(jié)合的互補(bǔ)分子。隨后，將如此形成的測(cè)量液體引導(dǎo)到具有受體的受體層上，所述受體結(jié)合游離的互補(bǔ)分子，但不與被分析物結(jié)合?？梢岳眠m合的方法直接檢測(cè)這種結(jié)合。可選地，互補(bǔ)分子在結(jié)合到受體上之前或之后或與被分析物結(jié)合之前或之后，可以與標(biāo)記物直接或間接反應(yīng)。因此，在結(jié)合抑制試驗(yàn)的情形中，直接檢測(cè)互補(bǔ)分子在受體上的結(jié)合，或者直接或間接檢測(cè)互補(bǔ)分子上的標(biāo)記物。然后，可以從測(cè)量信號(hào)推導(dǎo)出液體樣品的被分析物濃度。
為了制備受體層，將受體固定在固體載體材料上，即與固體載體材料結(jié)合。這可以通過例如受體在載體材料即所謂的基底的表面上的非特異性吸附來進(jìn)行。然而，受體的共價(jià)鍵合或經(jīng)由大量其他結(jié)合層的結(jié)合，也是用于制備受體層的已建立的方法。因此，例如，可以將鏈霉親和素共價(jià)鍵合于固體載體表面上，并且為了制備受體層，利用生物素與鏈霉親和素之間的親和相互作用將生物素偶聯(lián)的抗體連接在鏈霉親和素結(jié)合層上。一般來說，人們將構(gòu)建在固體載體材料表面上的整個(gè)層系統(tǒng)稱為生物傳感器的“傳感器基質(zhì)”，其中最后一層是受體層。
在許多應(yīng)用中，將具有受體層的傳感器基質(zhì)施加于被集成在微流體系統(tǒng)中的生物芯片上。一般來說，這些生物芯片是單次使用的產(chǎn)品，其在單次執(zhí)行被分析物的測(cè)定或濃度測(cè)量后被丟棄，相應(yīng)地用新的生物芯片更換。此外，在代謝性生物傳感器的情形中，含有傳感器基質(zhì)的芯片或筒盒也必須定期更換。其中的原因是生物受體的穩(wěn)定性和穩(wěn)健性一般來說低，并且靶分子與受體結(jié)合的親和性通常高。因此，一般來說，使結(jié)合在受體上的靶分子從受體脫離的條件，也伴有受體層或多或少的破壞。從相關(guān)技術(shù)文獻(xiàn)只能了解到很少的特殊情況在其中描述了受體層的這種再生，即在保持受體層的功能性基本上不變的同時(shí)幾乎完全移除靶分子。然而，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)，這對(duì)于絕大多數(shù)生物傳感器、特別是用于測(cè)定蛋白質(zhì)的生物傳感器來說是不可能的。
其中使用帶有受體層的單次使用芯片的自動(dòng)或半自動(dòng)生物分析儀是已知的。因此，例如在歐洲專利EP I 343 011 BI中，描述了一種用于核苷酸序列的電化學(xué)檢測(cè)的裝置。這種裝置具有用于導(dǎo)入液體樣品的可更換的分析盒，優(yōu)選實(shí)施為單次使用的部件。所述盒具有帶有受體層的測(cè)量電極，核苷酸序列選擇性且特異性地結(jié)合在所述受體層上。所述分析盒可以經(jīng)由模擬接口與計(jì)算系統(tǒng)相連，其中可以利用所述計(jì)算系統(tǒng)來執(zhí)行核苷酸序列的電化學(xué)檢測(cè)。
相反，為了將生物傳感器、特別是基于親和性的生物傳感器應(yīng)用于過程測(cè)量技術(shù)，例如用于自動(dòng)監(jiān)測(cè)工業(yè)工廠中的生物技術(shù)過程或用于自動(dòng)監(jiān)測(cè)例如水中的藥物殘留或內(nèi)分泌活性物質(zhì)的含量，希望能夠一個(gè)接一個(gè)地執(zhí)行多個(gè)測(cè)量，而不需每個(gè)測(cè)量都更換或調(diào)換芯片或含有傳感器基質(zhì)的其他部件。對(duì)于這樣的測(cè)量任務(wù)來說，生物傳感器的一種可能應(yīng)用可以是生物分析儀，待監(jiān)測(cè)的過程介質(zhì)的液體樣品被特別是在線地供應(yīng)給所述生物分析儀。任選地，可以用執(zhí)行上面描述的方法的試劑例如用其他靶分子、標(biāo)記物等，優(yōu)選自動(dòng)地對(duì)液體樣品進(jìn)行預(yù)處理。生物分析儀還包括:受體層，液體樣品或通過預(yù)處理獲得的待測(cè)量液體被供應(yīng)給所述受體層；信號(hào)轉(zhuǎn)換器，其輸出與結(jié)合在受體層上的被分析物或靶分子的數(shù)量相關(guān)的測(cè)量信號(hào)；以及信號(hào)處理系統(tǒng)，其進(jìn)一步處理測(cè)量信號(hào)并輸出測(cè)量值，特別是從測(cè)量信號(hào)推導(dǎo)出的測(cè)量值。在自動(dòng)或半自動(dòng)分析儀中，可以利用泵裝置、氣動(dòng)系統(tǒng)或其他液體運(yùn)輸系統(tǒng)來執(zhí)行樣品和在給定情況下的試劑向受體層的供應(yīng)，以及液體樣品或待測(cè)量液體在蒸發(fā)測(cè)量后的排出。為了維持所需試劑量以及蒸發(fā)分析后待廢棄的液體體積，用于樣品和在給定情況下的試劑的小的供應(yīng)和排出管線應(yīng)該具有盡可能小的橫截面，例如在亞毫米范圍內(nèi)。這樣的具有在亞毫米范圍內(nèi)的橫截面的液體管線，在后文中也被稱為微流體管道。具有這樣的微流體管道的生物分析儀模塊，也被稱為微流體單元。為了將用于這些目的的生物分析儀的維護(hù)工作降至最低，或者為了提高自動(dòng)化程度，對(duì)適合于一個(gè)接一個(gè)地執(zhí)行多個(gè)測(cè)量并且其中傳感器基質(zhì)及其相應(yīng)的受體層可以在現(xiàn)場(chǎng)、以高的可重復(fù)性被基本上完全再生或更新的生物傳感器，存在著需求。關(guān)于如何能夠使生物傳感器的傳感器基質(zhì)或受體層再生，從文獻(xiàn)中已知有不同的方法。在這樣的情況下，通常改變?nèi)軇┮员阋鹗荏w與靶分子之間的結(jié)合的解開。為此，通常改變?nèi)芤旱腜H值。此外，也常常進(jìn)行離子強(qiáng)度或溶劑極性的改變或添加特異性作用物質(zhì)，以便實(shí)現(xiàn)受體層的再生。然而，這些方法的缺點(diǎn)在于，為了能夠多次再生受體層，對(duì)于每種受體-靶分子相互作用來說，必須在復(fù)雜的試驗(yàn)運(yùn)行中確定最佳再生效率與受體的最小破壞之間的最適折衷。根據(jù)這些方法，受體或受體層的更新是不可能的。A.T.Ttidos , E.R.Lucas-van-den Bos, E.C.A.Stigter, “脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的基于表面等離子體共振的快速抑制測(cè)定法”(Rapid surface plasmon resonance-basedinhibition assay of deoxynivalenol), Journal of Agricultural and FoodChemistry51 (2003), 5843-5848，描述了這樣的一種受體層再生方法，所述受體層使用半抗原作為特別小且穩(wěn)健的受體。宣稱了在499和717個(gè)之間的再生循環(huán)。對(duì)于免疫測(cè)定法來說，在受體是蛋白質(zhì)的情況下，沒有已知的受體層可以類似地成功進(jìn)行多次再生。從EP 2 189 793 Al 了解到，為了從相應(yīng)受體層的受體移除靶分子，可以使用選擇性分解與受體相連的靶分子的酶。然而，在這樣的情況下，必須注意所使用的酶不會(huì)同等地攻擊受體，這強(qiáng)烈限制了應(yīng)用這種技術(shù)的能力。由于結(jié)合的靶分子的這種酶性分解的化學(xué)特性，在多次執(zhí)行方法后維持所述受體的密度顯得極為不可能。用于再生生物傳感器的受體層的另一種方法包括經(jīng)由寡核苷酸、因此經(jīng)由短的DNA或RNA分子來結(jié)合受體。為此，將寡核苷酸共價(jià)鍵合到表面，并將形成用于結(jié)合受體的相應(yīng)結(jié)合層的受體或分子與互補(bǔ)的寡核苷酸偶聯(lián)?；パa(bǔ)寡核苷酸之間的特異性親和相互作用導(dǎo)致受體固定在表面上，并由此導(dǎo)致形成受體層?；パa(bǔ)寡核苷酸之間的親和相互作用可以通過化學(xué)方法或通過提高溫度來移除，以便從表面釋放受體。然而，在蛋白質(zhì)存在下，例如在存在作為受體的抗體的情況下，這種方法一般是不可執(zhí)行的，這是由于在面對(duì)升高至超過40°C的溫度時(shí)或者在釋放所需的試劑存在下，蛋白質(zhì)一般來說會(huì)變性。在這樣的情況下，特別是在蛋白質(zhì)含量高的情況下、在蛋白質(zhì)變性的情況下，可能形成難以溶解的蛋白質(zhì)聚集物，在不使用攻擊性化學(xué)清潔的情況下，所述蛋白質(zhì)聚集物只能被不完全地移除，并且，所述蛋白質(zhì)聚集物通過粘著并積聚到例如液體供應(yīng)和排出系統(tǒng)的液體管線，可以極為麻煩地影響自動(dòng)或半自動(dòng)生物分析儀的功能。當(dāng)結(jié)合在受體層上的分子彼此橋接或交聯(lián)時(shí)，情況也是如此。在這種情況下，也必須使用攻擊性化學(xué)條件來釋放這些橋接或交聯(lián)的分子。此外，在面對(duì)移除蛋白質(zhì)聚集物所需的攻擊性化學(xué)條件時(shí)，表面鍵合的寡核苷酸也不再穩(wěn)定。
此外，從文獻(xiàn)中了解到第一類用于電化學(xué)移除結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的生物層的方法。與使用純化學(xué)手段例如通過酸、堿溶液或溶劑來化學(xué)移除傳感器基質(zhì)、相應(yīng)的受體層相比，在電化學(xué)移除受體層的情形中，實(shí)現(xiàn)了經(jīng)由帶有受體層的基底的電流流動(dòng)，這導(dǎo)致受體層、相應(yīng)的傳感器基質(zhì)的氧化或還原釋放(解吸附)。
因此，例如在Seokheun Choi, Junseok Chae, “微流體應(yīng)用中經(jīng)由現(xiàn)場(chǎng)電化學(xué)表面再生的可重復(fù)使用的生物傳感器”(Reusable biosensors via in situelectrochemical surface regeneration in microfluidic applications), Biosensorsand Bioelectronics25 (2009) 527-531, Seokheun Choi, Junseok Chae, “微流體裝置中使用短鏈自組裝單層的電化學(xué)解吸附的再生性生物傳感表面” (A regenerative biosensingsurface in microfluidics using electrochemical desorption of short—chainself-assembled monolayer), Microfluidics and Nanofluidics7 (2009) 819-827 或Christie A.Canaria等,“在水性溶液中燒基硫醇鹽自組裝單層在金上的形成和移除”(Formation and removal of alkylthiolate self-assembled monolayers on gold inaqueous solutions), Lab on a Chip 6 (2006) 289-295 幾篇文章中，描述了利用燒基硫醇作為結(jié)合分子將受體施加在金表面上以便通過這種方式提供受體層的方法。在這些文章中還描述了與如何移除被用作結(jié)合分子的烷基硫醇這一問題相關(guān)的調(diào)查。在這樣的情況下，特別是通過已釋放的烷基硫醇的重新吸附和由烷基硫醇的電化學(xué)分解引起的氫產(chǎn)生而出現(xiàn)了問題。此外，在重復(fù)制備和移除層的情形中，觀察到存在表面占據(jù)情況的連續(xù)漂移，這表明移除不完全。在引述的文章中都沒有探索在受體層占據(jù)情況不同的情況下清潔效力是否相等。然而，這對(duì)于在用于過程測(cè)量技術(shù)的自動(dòng)生物分析儀中的應(yīng)用來說是必不可少的，這是由于生物傳感器測(cè)量一般來說基于一個(gè)或多個(gè)參比測(cè)量來進(jìn)行，在所述參比測(cè)量的情形中受體層的占據(jù)一般來說發(fā)生得不完全或幾乎完全。特別是在SPR測(cè)量的情況下，正如文章中所描述的，參比測(cè)量的質(zhì)量對(duì)于測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量起到?jīng)Q定性的重要作用。因此，例如在Seokheun Choi, Junseok Chae,“微流體應(yīng)用中經(jīng)由現(xiàn)場(chǎng)電化學(xué)表面再生的可重復(fù)使用的生物傳感器，，(Reusable biosensors via in situ electrochemical surfaceregeneration in microfluidic applications), Biosensors and Bioelectronics25(2009)527-531的情形中，不應(yīng)假定在受體層上結(jié)合有大量纖維蛋白原的情況下(圖3c)清潔效力與受體層上僅結(jié)合有很少纖維蛋白原的情況下相同。
對(duì)于生物傳感器在過程測(cè)量技術(shù)中的自動(dòng)或半自動(dòng)應(yīng)用來說，重要的是順序執(zhí)行的濃度測(cè)定能夠產(chǎn)生彼此相當(dāng)?shù)臏y(cè)量結(jié)果。因此，需要一種即使在受體層多次再生或更新后，例如在50、100或更多個(gè)再生或更新循環(huán)后，也能對(duì)相等的靶分子濃度產(chǎn)生基本上相等的測(cè)量信號(hào)、即強(qiáng)度相當(dāng)?shù)臏y(cè)量信號(hào)的系統(tǒng)，特別是在測(cè)量信號(hào)相對(duì)于參比測(cè)量而言的情況下。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供適合應(yīng)用于過程測(cè)量技術(shù)、利用上述類型的生物分析儀測(cè)定液體樣品中的被分析物含量的方法，并相應(yīng)地提供適合用于執(zhí)行這種方法的生物分析儀。這個(gè)目的通過利用生物分析儀自動(dòng)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定液體樣品的被分析物含量的方法來實(shí)現(xiàn)，所述生物分析儀包含具有至少一個(gè)測(cè)量導(dǎo)管的微流體系統(tǒng)以及引導(dǎo)一種或多種液體通過所述測(cè)量導(dǎo)管的裝置，其中所述測(cè)量導(dǎo)管具有至少一個(gè)基底，所述方法包括用于至少在測(cè)量區(qū)內(nèi)執(zhí)行測(cè)量的如下所述的可重復(fù)執(zhí)行的步驟:( i )制備具有多個(gè)受體的傳感器基質(zhì)，所述受體優(yōu)選選擇性且特異性地、特別是由于親和相互作用而結(jié)合所述被分析物和/或其他靶分子，或引起所述被分析物或所述其他靶分子的化學(xué)轉(zhuǎn)化，所述制備包括引導(dǎo)至少第一化學(xué)物質(zhì)的制備溶液通過所述測(cè)量導(dǎo)管的步驟，所述第一化學(xué)物質(zhì)包括至少一個(gè)結(jié)合在所述基底上的官能團(tuán)以及至少一個(gè)其他官能團(tuán)，其中多個(gè)所述第一化學(xué)物質(zhì)經(jīng)由結(jié)合在所述基底上的官能團(tuán)結(jié)合在所述基底上，其中結(jié)合在所述基底上的多個(gè)所述第一化學(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)用作受體或用于隨后結(jié)合受:體；(ii)引導(dǎo)所述液體樣品或通過用至少一種試劑處理所述液體樣品而獲得的待測(cè)量液體通過所述測(cè)量導(dǎo)管，其中包含在所述液體樣品或所述待測(cè)量液體中的被分析物和/或包含在所述液體樣品或所述待測(cè)量液體中的其他靶分子，優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合在所述受體上，或被所述受體化學(xué)轉(zhuǎn)化，并測(cè)定與被所述受體結(jié)合或轉(zhuǎn)化的靶分子的量或與被所述受體結(jié)合或轉(zhuǎn)化的被分析物的量相關(guān)的測(cè)量變量，并從所述測(cè)量變量推導(dǎo)出所述液體樣品的被分析物含量；以及(iii)再生并相應(yīng)地清潔所述至少一個(gè)基底。特別是可以將所述至少一個(gè)基底再生，其中所述傳感器基質(zhì)以及在給定情況下與所述傳感器基質(zhì)結(jié)合的分子特別是被分析物分子、其他靶分子或結(jié)合在所述傳感器基質(zhì)上的其他物質(zhì)，基本上完全從所述基底釋放和/或至少被部分分解。通過這種方式，所述至少一個(gè)基底可以被完全或基本上完全清潔，即至少被充分清潔，使得留在所述基底上的所述傳感器基質(zhì)的殘留組分和可能結(jié)合在所述傳感器基質(zhì)上的物質(zhì)僅有非常少的量，以致在重復(fù)所述步驟(i)_ (iii)的情況下，即在新制備所述傳感器基質(zhì)、新引導(dǎo)新的液體樣品的情況下以及在新再生所述基底的情況下，不產(chǎn)生明顯的影響，特別是對(duì)測(cè)量的準(zhǔn)確性不產(chǎn)生明顯影響。步驟(i)_ (iii)的序列在下文中也被簡(jiǎn)稱為“測(cè)量循環(huán)”。由于通過移除傳感器基質(zhì)和可能與所述傳感器基質(zhì)結(jié)合的分子，并隨后重新制備所述傳感器基質(zhì)來將基底定期再生并相應(yīng)地重新清潔，因此，出于維護(hù)目的而更換基底或伸入到生物分析儀的其他機(jī)械裝置、特別是伸入到其中執(zhí)行所描述的方法的測(cè)量導(dǎo)管中的其他機(jī)械裝置，不是必需的。因此，液體樣品的分析可以被完全自動(dòng)地執(zhí)行，一個(gè)接一個(gè)地執(zhí)行大量測(cè)量循環(huán)。由于基底被完全或基本上完全清潔，因此確保了在順序測(cè)量循環(huán)中，傳感器基質(zhì)具有基本上相當(dāng)?shù)奶攸c(diǎn)，這確保了在不同測(cè)量循環(huán)中獲得的測(cè)量結(jié)果和相應(yīng)的分析結(jié)果具有非常良好的可比性。
至少可以在預(yù)定的測(cè)量區(qū)內(nèi)執(zhí)行測(cè)量，所述測(cè)量特別包括步驟(ii)的引導(dǎo)所述液體樣品或所述待測(cè)量液體通過所述測(cè)量導(dǎo)管，并測(cè)定與被所述受體結(jié)合或轉(zhuǎn)化的靶分子的量或與被所述受體結(jié)合或轉(zhuǎn)化的被分析物的量相關(guān)的測(cè)量變量。測(cè)量區(qū)是測(cè)量導(dǎo)管表面的一部分。基底被至少部分布置在測(cè)量區(qū)中，然而，它也可以延伸到測(cè)量導(dǎo)管內(nèi)或微流體系統(tǒng)的其他液體管道內(nèi)的測(cè)量區(qū)之外。
使用本發(fā)明的方法，其上結(jié)合靶分子特別是被分析物的受體，經(jīng)由第一化學(xué)物質(zhì)而結(jié)合在基底上。在這樣的情況下，受體可以由第一化學(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)形成。在這種情況下，通過將第一化學(xué)物質(zhì)固定在基底上，在單一制備步驟中形成了受體層。于是，傳感器基質(zhì)僅由受體層構(gòu)成。如果官能團(tuán)形式的受體不是第一化學(xué)物質(zhì)的直接組分，那么其他官能團(tuán)可用于結(jié)合受體。在這種情況下，第一化學(xué)物質(zhì)結(jié)合在基底上形成第一結(jié)合層，受體繼而可以通過例如特異性結(jié)合在其他官能團(tuán)上，而被直接結(jié)合或經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)其他結(jié)合層被結(jié)合在所述第一結(jié)合層上。在每種情況下，可以通過使含有在每種情況下結(jié)合在最上方結(jié)合層上、用于形成附加結(jié)合層的其他化學(xué)物質(zhì)的附加制備溶液流過，來順序形成一個(gè)或多個(gè)附加結(jié)合層。通過這種方式，傳感器基質(zhì)由一個(gè)或多個(gè)結(jié)合層以及結(jié)合在最上方結(jié)合層上的最終受體層形成。由第一化學(xué)物質(zhì)形成的最下方結(jié)合層和每個(gè)其他結(jié)合層，優(yōu)選通過特異性親和相互作用、例如經(jīng)由生物素-鏈霉親和素結(jié)合或抗體與其抗原之間的結(jié)合，而被結(jié)合在每種情況下形成位于下方的層的化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合位置上。此外，受體也優(yōu)選經(jīng)由特異性親和相互作用而被結(jié)合在最上方結(jié)合層上。施加附加結(jié)合層，即經(jīng)由第二化學(xué)物質(zhì)和可能的其他化學(xué)物質(zhì)將受體間接結(jié)合在第一化學(xué)物質(zhì)上，提供了可以如下實(shí)施的優(yōu)點(diǎn)，即在給定的結(jié)合層系統(tǒng)上，可以將大量不同的受體制備成受體層，但是其中所有受體相對(duì)于它們的結(jié)合使用相同的官能團(tuán)，使得不需要對(duì)結(jié)合層和受體進(jìn)行匹配。
在步驟(iii)中進(jìn)行基底再生之前，可以將步驟(ii)重復(fù)一次或多次，所述步驟(ii)包括引導(dǎo)并分析所述液體樣品或通過用試劑處理例如混合所述液體樣品而產(chǎn)生的待測(cè)量液體。
通過重復(fù)執(zhí)行方法步驟(i)至(iii)的序列，受體層以及相應(yīng)的傳感器基質(zhì)總是可以現(xiàn)場(chǎng)、即在沒有伸入到測(cè)量導(dǎo)管中的機(jī)械裝置的情況下被重新重構(gòu)在相同基底上，并因此可以以自動(dòng)方式確定一個(gè)接一個(gè)供應(yīng)到生物分析儀的液體樣品的被分析物含量。優(yōu)選情況下，方法步驟(i)至(iii)可以被執(zhí)行至少50次，優(yōu)選至少150次，更優(yōu)選至少300次。
術(shù)語“官能團(tuán)”一般是指決定性地確定帶有它們的化合物的材料特性和反應(yīng)行為的原子團(tuán)。在這里以及下文中，官能團(tuán)的概念還包括:能夠形成與其他化學(xué)物質(zhì)的優(yōu)選特異性的結(jié)合相互作用的原子團(tuán)或分子區(qū)；以及結(jié)合在化學(xué)物質(zhì)上的標(biāo)記物、特別是分子，例如由分子、肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)標(biāo)簽形成的標(biāo)記物。例如，結(jié)合在烷基硫醇上并用作用于受體-靶分子結(jié)合的結(jié)合配偶體的生物素分子，形成所述烷基硫醇的第一官能團(tuán)。所述烷基硫醇的硫醇基形成第二官能團(tuán)。
結(jié)合在基底上的第一化學(xué)物質(zhì)的官能團(tuán)優(yōu)選與基底材料匹配?；卓梢允抢缃饘倩蛘呖梢园辽僖粋€(gè)金屬涂層。
在這里，術(shù)語“受體”是指如上所定義的官能團(tuán)，互補(bǔ)分子、也稱為靶分子優(yōu)選選擇性且特異性地、特別是由于親和相互作用而結(jié)合在所述受體上，或者其他化學(xué)物質(zhì)被所述受體酶催化轉(zhuǎn)化。在這樣的情況下，不一定必須涉及生物學(xué)意義上的受體例如抗體。許多不同方法可用于測(cè)定液體樣品的被分析物含量。例如，可以將被分析物作為靶分子直接結(jié)合在受體層上(直接法)。也可以將被分析物和不同于所述被分析物的靶分子結(jié)合在受體層上，以便記錄與結(jié)合在受體層上的靶分子的數(shù)量相關(guān)的測(cè)量變量，并從所述測(cè)量變量確定被分析物濃度(競(jìng)爭(zhēng)法)。還可以將待測(cè)量液體在引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管之前與預(yù)處理溶液混合，其中所述預(yù)處理溶液含有已知濃度的被分析物反應(yīng)配偶體，然后再將混合物引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管。在這種情況下，未與被分析物分子結(jié)合的剩余反應(yīng)配偶體用作靶分子，其中從結(jié)合在受體表面上的靶分子的數(shù)量，可以推導(dǎo)出所測(cè)量溶液中被分析物的濃度(結(jié)合抑制試驗(yàn))。術(shù)語“測(cè)定被分析物含量”是指被分析物的純定性檢測(cè)、一定樣品體積的待測(cè)量液體中被分析物級(jí)分的半定量測(cè)定、或甚至是待測(cè)量液體中被分析物的定量濃度測(cè)定或活性測(cè)定。優(yōu)選情況下，根據(jù)這里和下文中描述的方法測(cè)定被分析物含量，不用于測(cè)定脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在這里以及下文中，術(shù)語“化學(xué)物質(zhì)”特別是指分子、復(fù)合體、生物分子聚集體或微生物。分子可以包括例如酶、肽、蛋白質(zhì)或DNA。復(fù)合體的實(shí)例是蛋白復(fù)合體，其也被稱為蛋白聚集體。微生物可以包括特別是細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞。在有利實(shí)施方式中，基底是導(dǎo)電的。在這樣的情況下，它可以是例如測(cè)量導(dǎo)管的導(dǎo)電表面區(qū)域，其可以實(shí)施為例如在測(cè)量導(dǎo)管壁上的金屬膜。基底可以包含例如具有高親硫特性的化學(xué)上穩(wěn)定的金屬，特別是諸如金或鉬的金屬。在這種情況下，官能團(tuán)在基底上的結(jié)合可以包括硫原子鍵合、特別是共價(jià)地鍵合于基底。特別適合于此的是硫醇或二硫化物基團(tuán)。第一化學(xué)物質(zhì)的實(shí)例包括硫醇，特別是烷基硫醇和聚乙二醇硫醇。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知這樣的分子可以作為生物化學(xué)分子、特別是生物傳感器的受體的結(jié)合分子，即所謂的連接物(比照上面引用的文章)。使用硫醇基結(jié)合表面作為基底，烷基硫醇在基底例如金或鉬基底與硫醇基的硫原子之間形成共價(jià)鍵，并通常在表面上形成自我組織化的單層，也稱為自組裝單層或簡(jiǎn)稱SAM。然而，這樣的SAM的形成對(duì)于構(gòu)建傳感器基質(zhì)以及相應(yīng)的受體層來說不是絕對(duì)需要的。這里以及下文中描述的方法優(yōu)選自動(dòng)進(jìn)行，其中包含電子數(shù)據(jù)處理單元例如微型計(jì)算機(jī)的控制單元控制引導(dǎo)液體通過測(cè)量導(dǎo)管和記錄測(cè)量值。用于引導(dǎo)液體的裝置可以包括特別是泵例如注射泵或氣動(dòng)裝置。從生物分析儀的適合于記錄測(cè)量變量的信號(hào)轉(zhuǎn)換器輸出的測(cè)量信號(hào)可以被控制單元轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)，并可以從所述數(shù)字信號(hào)形成測(cè)量變量的測(cè)量值?？梢允褂眉兓瘜W(xué)手段來進(jìn)行基底的再生，例如通過將含有過氧化物的氫氧化鈉溶液弓I導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管以溶解傳感器基質(zhì)?；椎脑偕拖鄳?yīng)的清潔，也可以通過在基底和經(jīng)由電解質(zhì)與基底導(dǎo)電接觸的對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)來進(jìn)行，以便特別是基本上不依賴于基底被傳感器基質(zhì)以及在給定情況下與所述傳感器基質(zhì)結(jié)合的其他物質(zhì)的當(dāng)前占據(jù)情況而清潔基底。因此，為了移除傳感器基質(zhì)，在基底與對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)，以便實(shí)現(xiàn)基底的清潔，這意味著完全或幾乎完全移除和/或至少部分分解傳感器基質(zhì)和可能與所述傳感器基質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)。
如果用于制備所述層的物質(zhì)之一含有位于其下方的層的物質(zhì)或形成隨后層的物質(zhì)的大于一個(gè)的結(jié)合位置，那么在各個(gè)層具有高覆蓋度的情形中，可以在分子水平上發(fā)生共價(jià)或非共價(jià)鍵合聯(lián)結(jié)，從而形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。在這些情況下，通過溶解層結(jié)構(gòu)來移除受體層以及使用純化學(xué)手段例如通過酸、氧化劑或有機(jī)溶劑來清潔基底，通常是不完全的，或者只能在損壞基底的情況下實(shí)現(xiàn)。然而已發(fā)現(xiàn)，通過在基底和經(jīng)由電解質(zhì)連接與基底導(dǎo)電接觸的對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)來電化學(xué)溶解層結(jié)構(gòu)，引起了全部層結(jié)構(gòu)的盡可能完全的釋放和基底的清潔。特別是，當(dāng)在表面上產(chǎn)生的電流流動(dòng)足以電解產(chǎn)生氧或氫或可選地氧和氫時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)導(dǎo)電表面的盡可能完全的清潔(電化學(xué)清潔)。有利的是，對(duì)電化學(xué)清潔進(jìn)行優(yōu)化，使得傳感器基質(zhì)和與所述傳感器基質(zhì)結(jié)合的分子或其他化學(xué)物質(zhì)的釋放，與傳感器基質(zhì)的至少部分分解一起發(fā)生。
在基底與對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)的步驟，可以被特別執(zhí)行成使得通過電解在基底和/或?qū)﹄姌O上形成氫和/或氧。通過這種方式，在每種情況下，由電流流動(dòng)和產(chǎn)生的氫或氧實(shí)現(xiàn)的受體層以及相應(yīng)的傳感器基質(zhì)的氧化和相應(yīng)的還原的清潔作用，還被進(jìn)一步擴(kuò)大。與此相反，在上面引述的Seokhun Choi等的文章中,在清潔期間,在含有氯化物的溶液例如磷酸鹽氯化鈉溶液存在下執(zhí)行層的氧化解吸附，這排除了更高電勢(shì)以及與其相關(guān)的傳感器基質(zhì)的氧化分解的應(yīng)用，因?yàn)榉駝t的話，在正電勢(shì)的情況下由此形成的金氯絡(luò)合物將弓I起金表面的破壞。然而，如果避免了氯化物和/或氰化物的存在，則電化學(xué)清潔可以在更高以及相應(yīng)的更低電勢(shì)下，以氧化以及還原兩種方式執(zhí)行，從而進(jìn)一步提高清潔效力。特別是可以在基底上建立交替的氧化和還原條件。優(yōu)選情況下，在電流流動(dòng)期間，基底與對(duì)電極之間的導(dǎo)電接觸由電解質(zhì)引起，所述電解質(zhì)含有濃度低于150mmol/l、優(yōu)選低于15mmol/l、更優(yōu)選低于1.5mmol/l的氰離子和/或鹵素離子，特別是當(dāng)基底包含金膜或鉬膜時(shí)。
因此，在方法實(shí)施方式的情形中，在通過電解在基底上形成氫和/或氧的情況下，可以獲得非常高的清潔效力，其在超過50個(gè)測(cè)量循環(huán)中保持相等，并且在每種情況下，隨后以高的可重復(fù)性在現(xiàn)場(chǎng)重新重建傳感器基質(zhì)。在內(nèi)部調(diào)查中顯示，在這樣的情況下，由層序列烷基硫醇-PEG-生物素-中性親和素(NeutrAvidin)構(gòu)成的橋接蛋白質(zhì)層結(jié)構(gòu)和由層序列烷基硫醇-PEG-生物素-中性親和素-BSA-生物素-中性親和素-BSA-生物素-中性親和素構(gòu)成的高度交聯(lián)蛋白質(zhì)層結(jié)構(gòu)兩者能夠被重復(fù)地并以相等尺度被移除，并且在每種情況下，在移除層結(jié)構(gòu)后隨后實(shí)施的傳感器基質(zhì)與在比較實(shí)驗(yàn)中在新的非再生基底上構(gòu)建的傳感器基質(zhì)具有相同的特性。
對(duì)電極可以被布置在位于測(cè)量導(dǎo)管內(nèi)，特別是與基底相對(duì)。因此，對(duì)電極可以是例如化學(xué)上非常惰性的材料，并優(yōu)選以膜的形式被施加。這樣的惰性電極材料由例如摻雜硼的金剛石樣碳層形成。這樣的電極被用在例如水處理中，并在那里用于電解產(chǎn)生羥基游離基以分解有機(jī)殘留物。
對(duì)電極可以類似地作為另一個(gè)基底實(shí)施在測(cè)量導(dǎo)管中，特別是與基底相對(duì)放置，在所述另一個(gè)基底上結(jié)合有結(jié)合在基底上的第一化學(xué)物質(zhì)的官能團(tuán)。例如，基底以及對(duì)電極兩者可以包含結(jié)合硫醇基或二硫化物基團(tuán)的導(dǎo)電材料?；缀陀米髁硪粋€(gè)基底的對(duì)電極可以例如作為金膜或鉬膜形成在測(cè)量導(dǎo)管的相對(duì)放置的壁上。通過這種方式，在步驟(i)的執(zhí)行中，將具有大量受體的傳感器基質(zhì)形成在基底以及對(duì)電極兩者上。在步驟(i i )的執(zhí)行中，液體樣品中或待測(cè)量液體中包含的被分析物和/或其他靶分子優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合在形成在基底上和附加基底上的傳感器基質(zhì)的受體上，或者被它們化學(xué)轉(zhuǎn)化?？梢詼y(cè)定與被兩個(gè)傳感器基質(zhì)的受體結(jié)合或轉(zhuǎn)化的被分析物的量或與被兩個(gè)傳感器基質(zhì)的受體結(jié)合的靶分子的量相關(guān)的測(cè)量變量。這是特別有利的，這是因?yàn)橛纱嗽龃罅丝捎行褂玫幕妆砻?，由于測(cè)量信號(hào)相應(yīng)增大，這對(duì)測(cè)量的準(zhǔn)確性具有積極影響。步驟(iii)的再生起到清潔兩種基底的作用。為了控制傳感器基質(zhì)的電化學(xué)氧化和/或還原性移除，在基底與對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)期間，可以參照經(jīng)由電解質(zhì)、特別是利用電解質(zhì)橋與基底電解接觸的參比電極的參比電勢(shì)來設(shè)定、特別是控制基底的電勢(shì)。可以通過生物分析儀的控制單元來進(jìn)行所述控制。通過使用參比電極來調(diào)節(jié)或控制基底以及相應(yīng)的對(duì)電極的電勢(shì)，可以防止在被連接作為工作電極的基底上和/或在對(duì)電極上出現(xiàn)過大的正或負(fù)電勢(shì)，因?yàn)榉駝t的話，基底以及相應(yīng)的對(duì)電極可能受到攻擊或甚至損壞。術(shù)語“電解接觸”是指經(jīng)由電解質(zhì)、特別是含有離子的水性溶液而離子傳導(dǎo)性接觸。優(yōu)選情況下，包含無隔膜的電解質(zhì)橋。相反，在上面引述的Seokheun Choi等的文章中，利用雙電極電路進(jìn)行受體層的還原性移除。由于不存在參比電極，因此不能檢查在兩個(gè)電極上實(shí)際得到的電勢(shì)。通過這種方式，依賴于微流體系統(tǒng)中起支配作用的條件以及電解質(zhì)濃度和組成，可能在基底上或?qū)﹄姌O上產(chǎn)生過大的正電勢(shì)或負(fù)電勢(shì)。這些大的電勢(shì)在重復(fù)出現(xiàn)時(shí)，能夠引起電極功能的破壞。不管怎樣，這使本文公開的發(fā)明的目的不能實(shí)現(xiàn)。參比電極可以實(shí)施為與測(cè)量導(dǎo)管相連的附加液體導(dǎo)管的導(dǎo)電涂層。作為參比電極，也可以使用金屬絲特別是鉬絲或金絲形式的無電流操作的假參比電極，其可以被布置在測(cè)量導(dǎo)管或與測(cè)量導(dǎo)管相連的附加液體導(dǎo)管中。如果在測(cè)量循環(huán)期間假參比電極被所使用的試劑占據(jù)，那么假參比電極同樣被再生或清潔。相對(duì)于參比電極的參比電勢(shì)，用作工作電極的基底的電勢(shì)可以在最小值與最大值之間連續(xù)或不連續(xù)地、特別是線性地變化，使得通過電化學(xué)清潔、特別是使用氧和相應(yīng)的氫的產(chǎn)生來重新清潔基底。優(yōu)選情況下，電勢(shì)在最大值與最小值之間來回、特別是線性地移動(dòng)多次，特別是在2和1000次之間。類似地，過程持續(xù)時(shí)間以及清潔持續(xù)時(shí)間可以在廣泛限度內(nèi)變化，并根據(jù)清潔結(jié)果進(jìn)行變化或設(shè)定。為此，生物分析儀的控制單元可以為服務(wù)人員提供相應(yīng)的輸入設(shè)備或用于加載預(yù)定過程參數(shù)的裝置。任選地，在產(chǎn)生電流流動(dòng)期間或之后或之間，可以記錄基底上出現(xiàn)的電流水平，以便獲得一個(gè)或多個(gè)循環(huán)伏安圖，從圖中可以推導(dǎo)出導(dǎo)電表面區(qū)段的狀態(tài)。此外，也可以使用可選分析方法例如光學(xué)、電壓測(cè)量或其他電化學(xué)分析方法來評(píng)估基底的狀態(tài)。可選地，在基底與對(duì)電極之間產(chǎn)生的電流流動(dòng)的電流水平，也可以在最小值與最大值之間連續(xù)或不連續(xù)地變化，以便通過電化學(xué)清潔來重新清潔基底。在這樣的情況下，在基底與參比電極之間建立的電勢(shì)差不能低于最小值，也不能超過最大值，以避免損壞基底。如果對(duì)電極類似地用作基底，則這里為被連接作為工作電極的基底所給出的所有數(shù)據(jù)和條件，同樣適用于對(duì)電極。在基底與對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)的步驟之前、期間或之后，可以將一種或多種清潔和/或輔助液體引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管。在基底與對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)之前或之后被引導(dǎo)通過的清潔液體，主要用于基底的化學(xué)清潔。適合作為清潔液體的是例如酸或堿溶液或溶劑。用作輔助液體的是例如電解質(zhì)溶液，其有利地支持導(dǎo)電基底上的電化學(xué)過程(例如Na2SO4溶液或添加H2O2)。在電流流動(dòng)期間被引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管的輔助或清潔液體，用于支持電化學(xué)清潔。在電流流動(dòng)期間，特別有利的是酸性并且在給定情況下含有增補(bǔ)的過氧化氫的電解質(zhì)溶液。施加的電解質(zhì)在電極上所施加的電勢(shì)下不應(yīng)分解或反應(yīng)。在這里，相應(yīng)的所謂的導(dǎo)電鹽是已知的。酸性磷酸鹽緩沖液極其適合于使所添加的過氧化物在儲(chǔ)存期間的無電流分解最小化。
優(yōu)選情況下，電解質(zhì)和/或輔助液體在電流流動(dòng)期間被連續(xù)或不連續(xù)地引導(dǎo)通過微流體測(cè)量導(dǎo)管。通過這種方式，可以防止所需輔助試劑的耗盡或電解產(chǎn)生的反應(yīng)性物質(zhì)的富集，這對(duì)基底表面的壽命有正面影響。此外，傳感器基質(zhì)的分解產(chǎn)物以及由電解形成的氣泡從基底表面的區(qū)域被移除，這有助于更快速且安全的清潔。
在基底與對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)期間，可以將例如酸性磷酸鹽緩沖溶液作為輔助液體引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管。相對(duì)于銀/氯化銀參比電極的電勢(shì)，鉬基底的電勢(shì)在-0.5V至-1.25V范圍內(nèi)的負(fù)值(還原，在給定情況下伴有氫的形成)與+1.5V至+2.25V范圍內(nèi)的正值(氧化，在給定條件下伴有氧的形成)之間變化的情況下，這樣的輔助液體對(duì)支持電化學(xué)清潔來說是有利的。
在基底再生期間或再生之后，可以檢查基底上傳感器基質(zhì)的殘留組分，特別是利用電化學(xué)測(cè)量方法例如循環(huán)伏安法或阻抗譜法、光學(xué)測(cè)量方法例如橢圓偏光法或吸附試驗(yàn)進(jìn)行檢查。特別有利的是，為了評(píng)估和/或控制再生以及相應(yīng)的再生效率，可以將再生期間的電流水平考慮在內(nèi)。在吸附試驗(yàn)的情況下，將結(jié)合在基底上的傳感器基質(zhì)的殘留組分上的物質(zhì)引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管，然后確定吸附的物質(zhì)的量。所述檢查也可用于控制再生。
輔助液體還可以包括例如光化學(xué)或電化學(xué)產(chǎn)生的臭氧，臭氧由于其強(qiáng)氧化效果而被考慮用于傳感器基質(zhì)的有效分解。此外，也可以使用有效分解傳感器基質(zhì)的其他化學(xué)物質(zhì)或物理方法。在這種情況下，不需要提供電流流動(dòng)，因此也不需要基底是導(dǎo)電的。
如果選擇不導(dǎo)電的、特別是非親硫的材料作為基底，并且第一化學(xué)物質(zhì)以經(jīng)由含硫官能團(tuán)結(jié)合之外的其他方式結(jié)合在基底上，則可以使用純化學(xué)手段來實(shí)現(xiàn)基底的再生以及相應(yīng)的清潔。例如，基底可以是玻璃，在包含(三烷氧基)甲硅烷基團(tuán)作為用于結(jié)合在玻璃基底上的第一官能團(tuán)的第一化學(xué)物質(zhì)的協(xié)助下，在所述玻璃上制備用于構(gòu)建傳感器基質(zhì)的第一結(jié)合層。在這種情況下，為了再生基底并相應(yīng)地移除傳感器基質(zhì)，可以使用例如含70體積％硫酸和30體積％過氧化氫溶液(30%的水溶液)的溶液。
這里描述的用于清潔基底的所有方法的共同之處在于，不單只存在結(jié)合在受體上的被分析物、相應(yīng)的被分析物分子或可能結(jié)合在受體層的受體上的其他靶分子或其他物質(zhì)的釋放，同樣地也不單只存在傳感器基質(zhì)從基底上的釋放。相反，優(yōu)選同時(shí)存在傳感器基質(zhì)組分以及在給定情況下被所述傳感器基質(zhì)結(jié)合的其他分子的分解。通過這種方式，傳感器基質(zhì)的重復(fù)、可靠且有把握的移除可能基本上不依賴于傳感器基質(zhì)的復(fù)雜性，特別是在具有蛋白質(zhì)作為組分的傳感器基質(zhì)的情況下，和/或在存在形成傳感器基質(zhì)的組分和/或與所述傳感器基質(zhì)結(jié)合的分子的上述交聯(lián)的情況下。此外，測(cè)量程序所需的所有步驟，包括傳感器基質(zhì)的構(gòu)建(步驟i)、測(cè)定被分析物含量(步驟ii)和傳感器基質(zhì)的再生和相應(yīng)的移除(步驟iii)，都在現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)行，即通過將相應(yīng)的溶液以預(yù)定順序相繼引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管而不對(duì)測(cè)量導(dǎo)管進(jìn)行其他操作。第一化學(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)可以包括例如生物素。在這種情況下，受體可以被直接結(jié)合在第一化學(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)上，或經(jīng)由結(jié)合在第一化學(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)上并具有至少一個(gè)生物素結(jié)合位置的結(jié)合生物素的第二化學(xué)物質(zhì)而被間接結(jié)合在第一化學(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)上。結(jié)合生物素的第二化學(xué)物質(zhì)可以包括結(jié)合生物素的分子，例如親和素、親和素衍生物或類似于親和素的分子，特別是鏈霉親和素或中性親和素。相反，結(jié)合生物素的分子例如鏈霉親和素、中性親和素或親和素、或親和素衍生物，也可以用作第一化學(xué)物質(zhì)的官能團(tuán)。然后利用結(jié)合在受體上的生物素基團(tuán)直接結(jié)合受體，或經(jīng)由多種結(jié)合物質(zhì)例如結(jié)合分子來結(jié)合受體。結(jié)合在第一化學(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)上的受體，可以經(jīng)由至少一個(gè)非共價(jià)鍵直接或間接結(jié)合在第一化學(xué)物質(zhì)上。當(dāng)?shù)谝换瘜W(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)用作受體時(shí)，由結(jié)合在基底上的第一化學(xué)物質(zhì)形成的層同時(shí)為結(jié)合層和受體層。當(dāng)?shù)谝换瘜W(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)用于結(jié)合受體時(shí)，由第一化學(xué)物質(zhì)形成的層形成結(jié)合層，在該結(jié)合層上可以任選形成一個(gè)或多個(gè)其他結(jié)合層，其中受體層被提供為最終層，該最終層由結(jié)合在位于其下方的結(jié)合層的結(jié)合位置上的受體形成。形成各個(gè)層的化學(xué)物質(zhì)，在每種情況下可以通過親和相互作用、特別是非共價(jià)鍵合，而與形成位于其上方或下方的層的化學(xué)物質(zhì)結(jié)合。優(yōu)選情況下，傳感器基質(zhì)的每一層根據(jù)具體情況，相對(duì)于在每種情況下位于其下方的層具有完全的覆蓋度，并且無論如何具有至少超過80%的覆蓋度。通過這種方式確保了，使用順序重新制備的傳感器基質(zhì)進(jìn)行的測(cè)量產(chǎn)生彼此相當(dāng)?shù)臏y(cè)量結(jié)果，這是由于在這種情況下，總是存在基本上相同數(shù)量的受體結(jié)合位置，使得每個(gè)重新制備的傳感器基質(zhì)能夠結(jié)合相當(dāng)?shù)淖畲蟀蟹肿訑?shù)量。這確保了生物分析儀的測(cè)量信號(hào)的高度可重復(fù)性，盡管傳感器基質(zhì)是連續(xù)重新制備的。與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語傳感器基質(zhì)的“層”不一定被理解為形態(tài)學(xué)描述。相反，術(shù)語“層”是指在相同結(jié)合步驟中并以相同方式結(jié)合、優(yōu)選非共價(jià)地、更優(yōu)選經(jīng)由親和相互作用結(jié)合在位于其下方的層的化學(xué)物質(zhì)上或基底上的多個(gè)化學(xué)物質(zhì)。層不必僅僅由多個(gè)相同的化學(xué)物質(zhì)例如相同的分子、特別是相同的蛋白質(zhì)形成，相反，也可以包含大量不同的化學(xué)物質(zhì)。決定性的是在相同的結(jié)合步驟中例如在將包含形成所述層的化學(xué)物質(zhì)的制備溶液傳送通過的過程中，經(jīng)由基本上相同的物理相互作用力進(jìn)行結(jié)合。為了獲得高的可重復(fù)性和小的個(gè)體變差，特別有利的是在重復(fù)或多次制備傳感器基質(zhì)的情況下，將受體層的受體的平均表面密度以及在有利情況下平均取向盡可能保持恒定。這可以通過在制備傳感器基質(zhì)的情況下使各個(gè)層的表面密度盡可能高和/或盡可能接近各自的平衡狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)，所述平衡狀態(tài)各自由在位于其下方的層的結(jié)合位置上形成特定層的物質(zhì)的結(jié)合和釋放構(gòu)成。術(shù)語超過80%的覆蓋度是指在每種情況下，在用于結(jié)合的條件的情況下，在表面的覆蓋度超過平衡狀態(tài)下的覆蓋度的80%的情況下的表面的覆蓋程度，所述用于結(jié)合的條件基本上是制備溶液中待結(jié)合的物質(zhì)的濃度、流速、結(jié)合速率和流體測(cè)量導(dǎo)管的幾何形狀。在測(cè)量導(dǎo)管的預(yù)定幾何形狀的情況下，引導(dǎo)相應(yīng)溶液通過測(cè)量導(dǎo)管的流速和持續(xù)時(shí)間可以以彼此之間匹配并與溶液濃度匹配的方式進(jìn)行選擇，并使得能夠獲得超過80%的覆蓋度。所述參數(shù)可以在初步實(shí)驗(yàn)中被確定，然后被提供用于執(zhí)行所描述的用于確定被分析物含量的方法。覆蓋度可以通過測(cè)量來確定，其中相應(yīng)物質(zhì)的覆蓋度通過例如橢圓偏光法或利用微米尺度石英而被直接測(cè)量到，或通過向相應(yīng)的層供應(yīng)與相應(yīng)物質(zhì)特異性結(jié)合的分子，并通過例如光學(xué)方法確定結(jié)合的分子的數(shù)量而被間接測(cè)量到。
為了可重復(fù)地設(shè)定受體層的某一受體密度，在傳感器基質(zhì)的每一層的情況下，在下文中被稱為“結(jié)合物質(zhì)”或者也稱為結(jié)合分子的形成結(jié)合層的特定物質(zhì)可以與另一種化學(xué)物質(zhì)相結(jié)合，所述另一種化學(xué)物質(zhì)結(jié)合在位于其下方的層的與結(jié)合物質(zhì)相同的結(jié)合位置上，但是不具有隨后被引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管的化學(xué)物質(zhì)可以結(jié)合在其上的其他官能團(tuán)。結(jié)合物質(zhì)的具體表面密度由結(jié)合物質(zhì)的濃度、結(jié)合物質(zhì)與一種或多種其他化學(xué)物質(zhì)的濃度比和尺寸比、以及結(jié)合和釋放的相應(yīng)平衡比所決定。類似地，也可以同樣地設(shè)定受體層的受體密度。因此，例如在傳感器基質(zhì)帶有層序列金基底/烷基硫醇-PEG-生物素/中性親和素/生物素偶聯(lián)的抗體的情況下，將生物素-聚乙二醇與生物素偶聯(lián)的抗體混合能夠降低受體層的受體的表面密度。在這種情況下，受體與聚乙二醇的層同樣也被稱為受體層。也可以以同樣的方式來設(shè)定結(jié)合層中結(jié)合物質(zhì)的密度。
與被受體結(jié)合的靶分子或被受體轉(zhuǎn)化的靶分子的量相關(guān)或與被受體結(jié)合或轉(zhuǎn)化的被分析物的量相關(guān)的測(cè)量變量，可以是光學(xué)測(cè)量變量，特別是根據(jù)發(fā)光測(cè)量、反射測(cè)量或吸收測(cè)量來確定所述光學(xué)測(cè)量變量。對(duì)于適合于生物分析儀的方法來說，由于尤其是由溫度和電解質(zhì)波動(dòng)所引起的大的擾亂性影響，SPR測(cè)量是不太適合的。為了確定光學(xué)測(cè)量變量，在例如靶分子上可以結(jié)合有或隨后結(jié)合有具有發(fā)光特性即熒光或磷光特性的官能團(tuán)或轉(zhuǎn)化在后續(xù)步驟中供應(yīng)的底物溶液以產(chǎn)生光(化學(xué)發(fā)光)或顏色變化的官能團(tuán)。
當(dāng)測(cè)量變量是由靶分子直接或間接產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光或靶分子的發(fā)光標(biāo)記物的發(fā)光時(shí)，有利的是，基底以及相應(yīng)的含有基底的測(cè)量區(qū)透射至少10%、優(yōu)選至少50%或甚至至少70%的波長(zhǎng)范圍在300nm和900nm之間的光。一般來說，對(duì)于在生物分析儀中使用光學(xué)測(cè)量方法來說，有利的是，基底以及相應(yīng)的含有基底的測(cè)量區(qū)透射至少10%、優(yōu)選至少50%或甚至至少70%的測(cè)量輻射。例如，基底可以作為具有晶格結(jié)構(gòu)的金屬膜被施加在測(cè)量導(dǎo)管的壁上。在這種情況下，通過晶格結(jié)構(gòu)的中間空間發(fā)生透射。
在實(shí)施方式中，被分析物可以是肽或蛋白質(zhì)，其中除了被分析物之外的其他靶分子是不同于被分析物的另一種分子，特別是源自于被分析物并具有標(biāo)簽、優(yōu)選為蛋白質(zhì)標(biāo)簽的肽或蛋白質(zhì)，所述標(biāo)簽用于直接或間接產(chǎn)生測(cè)量變量或影響測(cè)量變量。不同于被分析物的靶分子可以是例如競(jìng)爭(zhēng)物，所述競(jìng)爭(zhēng)物由于親和相互作用而與被分析物同樣結(jié)合在受體上(比照競(jìng)爭(zhēng)法)?？蛇x地，不同于被分析物的靶分子可以是優(yōu)選選擇性且特異性結(jié)合在受體層上的分子，特別是與被分析物分子形成復(fù)合體的肽或蛋白質(zhì)，使得結(jié)合在受體層上的靶分子數(shù)量是被分析物濃度的度量(比照結(jié)合抑制試驗(yàn))。
這樣的具有蛋白質(zhì)標(biāo)簽并形成其他靶分子的蛋白質(zhì)或肽，可以作為包含蛋白質(zhì)標(biāo)簽的重組蛋白或肽而被產(chǎn)生。在這樣的情況下，有利的是隨后不必進(jìn)行蛋白質(zhì)或肽與蛋白質(zhì)標(biāo)簽的化學(xué)偶聯(lián)，所述蛋白質(zhì)標(biāo)簽被用于隨后通過標(biāo)記物進(jìn)行直接或間接標(biāo)記。如果具有蛋白質(zhì)標(biāo)簽的蛋白質(zhì)或肽包含與被分析物相同的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)或基礎(chǔ)肽，則還存在另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即一般來說，被分析物和不同于被分析物的分子與受體的親和相互作用通常在相同的數(shù)量級(jí)。
為了測(cè)定與結(jié)合在受體上的被分析物分子或其他靶分子的量相關(guān)的測(cè)量變量，可以將標(biāo)記物直接或間接結(jié)合在結(jié)合于傳感器基質(zhì)上的被分析物上或結(jié)合在另一種靶分子上。標(biāo)記物用于直接或間接引入影響測(cè)量變量的特性。具體地，它可以經(jīng)由蛋白質(zhì)標(biāo)簽而被結(jié)合在具有蛋白質(zhì)標(biāo)簽的靶分子上。這可以例如通過將標(biāo)記物或帶有作為官能團(tuán)的標(biāo)記物的化學(xué)物質(zhì)的溶液引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管來實(shí)現(xiàn)，其中所述標(biāo)記物或帶有標(biāo)記物的化學(xué)物質(zhì)，具有在被分析物、其他靶分子、或靶分子的蛋白質(zhì)標(biāo)簽上結(jié)合的官能團(tuán)。在后一種情況下，標(biāo)記物特異性結(jié)合在結(jié)合于受體層上并具有蛋白質(zhì)標(biāo)簽的靶分子上，而不結(jié)合在同樣結(jié)合于受體層上的被分析物分子上。可選地，在先前的方法步驟中用標(biāo)記物標(biāo)記靶分子，使得已經(jīng)標(biāo)記有標(biāo)記物的靶分子被引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管，這也是一種選擇方案。與已知的蛋白質(zhì)分析方法相比，優(yōu)選作為競(jìng)爭(zhēng)物的帶有蛋白質(zhì)標(biāo)簽的靶分子的應(yīng)用，提供了極大優(yōu)點(diǎn)，即為了測(cè)定不同的被分析物，只需要直接或間接結(jié)合在靶分子的蛋白質(zhì)標(biāo)簽上的標(biāo)記物，或者蛋白質(zhì)標(biāo)簽本身就是標(biāo)記物。因此，例如，使用綠色熒光蛋白(GFP)作為起到標(biāo)記物作用的蛋白質(zhì)標(biāo)簽，提供了將其熒光作為測(cè)量變量引入的優(yōu)點(diǎn)，利用光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器可以直接測(cè)定所述熒光，和/或通過隨后結(jié)合針對(duì)GFP的抗體例如酶偶聯(lián)的抗體可以間接測(cè)定所述熒光。
適合直接結(jié)合的標(biāo)記物除了 GFP之外，還包括其他發(fā)熒光物質(zhì)，例如發(fā)熒光的納米粒子。有利情況下，間接結(jié)合的標(biāo)記物可以經(jīng)由親和相互作用而被結(jié)合在靶分子或被分析物上。在這種情況下，所描述的蛋白質(zhì)標(biāo)簽特別適合作為通用結(jié)合結(jié)構(gòu)，用于隨后直接或間接結(jié)合標(biāo)記物。除了例如由于某些熒光或吸收特征而可被檢測(cè)到的化學(xué)物質(zhì)之外，適合的標(biāo)記物還包括在其他化學(xué)物質(zhì)存在下影響特別是可以通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器而被光學(xué)檢測(cè)到的測(cè)量系統(tǒng)的特性的化學(xué)物質(zhì)。它們的實(shí)例是進(jìn)入化學(xué)反應(yīng)并特別是由于化學(xué)發(fā)光或顏色變化而從所述化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的光學(xué)信號(hào)的標(biāo)記物。這樣的標(biāo)記物的實(shí)例是過氧化物酶，其在魯米諾(Iuminol) /H2O2溶液存在下,實(shí)現(xiàn)通過過氧化物酶催化的化學(xué)發(fā)光。
用于執(zhí)行上述實(shí)施方式之一的方法的生物分析儀包含具有至少一個(gè)測(cè)量導(dǎo)管的微流體系統(tǒng)和用于將液體引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管的裝置，
其中測(cè)量導(dǎo)管包括至少一個(gè)基底，在所述至少一個(gè)基底上，至少在測(cè)量區(qū)內(nèi)、至少有時(shí)布置有具有多個(gè)受體的傳感器基質(zhì)，所述受體優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合或化學(xué)轉(zhuǎn)化液體樣品或通過用至少一種試劑處理液體樣品而獲得的待測(cè)量液體中存在的靶分子或被分析物，
其中生物分析儀包括至少一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)換器，所述信號(hào)轉(zhuǎn)換器根據(jù)結(jié)合在受體上或被受體轉(zhuǎn)化的被分析物的量或根據(jù)結(jié)合在受體上的靶分子或被轉(zhuǎn)化的靶分子的量而輸出測(cè)量信號(hào)。
結(jié)合的被分析物或結(jié)合的靶分子的量，對(duì)應(yīng)于結(jié)合在受體上的被分析物分子或靶分子的數(shù)量。
可以將對(duì)電極布置在微流體系統(tǒng)內(nèi)，所述對(duì)電極被特別布置在測(cè)量導(dǎo)管內(nèi)與第一基底相對(duì)放置，并優(yōu)選用作另一個(gè)基底。如果對(duì)電極用作另一個(gè)基底，那么在該另一個(gè)基底上也至少有時(shí)布置有具有多個(gè)受體的傳感器基質(zhì)。傳感器基質(zhì)的制備以及基底和用作另一 個(gè)基底的對(duì)電極的再生，可以如上所述根據(jù)自動(dòng)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定液體樣品的被分析物含量的方法
來進(jìn)行?；缀蛯?duì)電極可以與流過測(cè)量導(dǎo)管的電解質(zhì)的流動(dòng)方向相關(guān)地布置，使得由于基底與對(duì)電極之間的電流流動(dòng)而出現(xiàn)在電解質(zhì)中的氣泡被導(dǎo)流，以使所述氣泡基本上不影響電流流動(dòng)。對(duì)電極可以實(shí)施為微流體系統(tǒng)的導(dǎo)管的導(dǎo)電涂層，相應(yīng)地作為膜，其特別是可以與測(cè)量導(dǎo)管不同，但與它們粘合。它優(yōu)選可以被布置在測(cè)量導(dǎo)管內(nèi)，例如與基底相對(duì)或與其共軸放置。生物分析儀還可以包含被形成在微流體系統(tǒng)內(nèi)的參比電極，所述參比電極經(jīng)由電解質(zhì)橋、特別是無隔膜電解質(zhì)橋與至少一個(gè)基底導(dǎo)電連接?；?、對(duì)電極和在給定情況下參比電極，可以實(shí)施為它們被布置在其中的微流體系統(tǒng)的導(dǎo)管壁上的可導(dǎo)電連接的膜，特別是金屬涂層。微流體系統(tǒng)可以包含第一部件，其具有表面，其中測(cè)量導(dǎo)管以及在給定情況下其他導(dǎo)管、特別是與測(cè)量導(dǎo)管相連的用于液體運(yùn)輸?shù)膶?dǎo)管，實(shí)施為凹陷部，其中至少第二部件與所述第一部件相連并覆蓋凹陷部，并將它們針對(duì)環(huán)境液密地密封。如此形成的液體管線，在液體可以從其導(dǎo)入到微流體系統(tǒng)中的一個(gè)或多個(gè)儲(chǔ)液器與液體可以從微流體單元轉(zhuǎn)移到其中的廢液容器之間延伸。第一和第二部件可以特別由電絕緣的、優(yōu)選透明的材料例如玻璃或合成材料如塑料構(gòu)成?；?、對(duì)電極以及在給定情況下參比電極，可以作為可導(dǎo)電連接的膜、特別是作為金屬涂層形成在第二部件上。在可選實(shí)施方式中，微流體系統(tǒng)可以包含第一部件、特別是平面平行的第一板，以及與所述第一部件隔開布置的第二部件、特別是平面平行的第二板，其中所述第一部件和第二部件經(jīng)由布置在第一部件與第二部件之間的一個(gè)或多個(gè)間隔元件、特別是一個(gè)或多個(gè)中間板而彼此相連，其中所述一個(gè)或多個(gè)間隔元件具有中間空間和/或穿孔，所述中間空間和/或穿孔形成在所述第一部件與第二部件之間延伸的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，包括所述測(cè)量導(dǎo)管以及在給定情況下與所述測(cè)量導(dǎo)管相連的用于液體運(yùn)輸?shù)母郊訉?dǎo)管。第一和第二部件特別是電絕緣的、優(yōu)選透明的材料，例如玻璃或塑料。所述一個(gè)或多個(gè)中間板可以是例如柔性的。因此，它們可以實(shí)施為例如有機(jī)硅墊的形式。所述第一和第二部件可以實(shí)施為例如玻璃板的形式。在這里，有利的是使用顯微鏡載片。在這種實(shí)施方式中，基底、對(duì)電極以及在給定情況下參比電極，可以是第一和/或第二部件上的可導(dǎo)電連接的膜、特別是金屬涂層的形式。在其他實(shí)施方式中，可以使用導(dǎo)電的微流體小管作為基底、對(duì)電極以及在給定情況下的參比電極。因此，例如，基底可以是小金管，對(duì)電極可以是小鉬管，參比電極可以是內(nèi)部襯有氯化銀的小銀管。在這種類型的實(shí)施方式的情形中，優(yōu)點(diǎn)在于這些小管的簡(jiǎn)單的電學(xué)和微流體連接性。在這樣的情況下，一種有利的變化形式由測(cè)量導(dǎo)管構(gòu)成，所述測(cè)量導(dǎo)管的測(cè)量區(qū)由至少內(nèi)部導(dǎo)電的小管形成，例如小的鉬管，在其內(nèi)部共軸且不與小管直接接觸地放置有至少在表面上是導(dǎo)電的絲，例如鉬絲。在這樣的情況下，小管可以用作基底，絲用作對(duì)電極以及在給定情況下用作另一個(gè)基底。此外，顛倒的功能性表示另一種選擇方案。小管可以具有晶格形式的壁，其中晶格的空間是透明的，允許光學(xué)輻射通過，使得小管內(nèi)部的絲可見。由于基底與對(duì)電極之間的間隔小，基底和對(duì)電極的共軸布置允許高的電流密度，這使得即使在電再生以及相應(yīng)的清潔期間基底和/或?qū)﹄姌O的表面被輕度移除的情況下也具有長(zhǎng)使用壽命。
為了進(jìn)行光學(xué)測(cè)量，測(cè)量導(dǎo)管優(yōu)選在測(cè)量區(qū)的區(qū)域中實(shí)施為其透過至少10%的波長(zhǎng)范圍在300nm和900nm之間的光。這種情況發(fā)生在例如基底是厚度合計(jì)在2和30nm之間的薄的鉬層的實(shí)施方式中，或者發(fā)生在透明材料上施加例如襯結(jié)構(gòu)的或晶格結(jié)構(gòu)的不透明基底的情形中。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，微流體單元或給定情況下的大量微流體單元，與用于供應(yīng)試齊U、相應(yīng)的試劑溶液和用于容納廢液的容器一起，被布置在生物分析儀的可更換單元、即所謂的可更換盒中?？筛鼡Q盒內(nèi)的容器利用微流體連接系統(tǒng)，與用于將試劑供應(yīng)到微流體單元中以及用于將用過的液體排入廢液容器中的一個(gè)或多個(gè)微流體單元相連。液體通過微流體單元的運(yùn)輸優(yōu)選間接地例如氣動(dòng)地進(jìn)行，以便除了用于遞送待分析液體樣品的管線之夕卜，不需要將附加的液體輸送管線連接到可更換盒。這使得能夠進(jìn)行生物分析儀的簡(jiǎn)單且用戶友好的操作。在將這樣的填充有所需試劑和相應(yīng)的試劑溶液的可更換盒插入到生物分析儀中之后，在初始步驟中，用液體填充流體管線和導(dǎo)管。隨后可以現(xiàn)場(chǎng)并直接一個(gè)接一個(gè)地重復(fù)執(zhí)行步驟i至iii，以在生物分析儀的協(xié)助下執(zhí)行測(cè)量?？梢岳米詣?dòng)樣品獲取系統(tǒng)將用于分析的液體樣品從待監(jiān)測(cè)的過程介質(zhì)中取出，并經(jīng)由可更換盒與樣品獲取系統(tǒng)的連接進(jìn)料到可更換盒，并相應(yīng)地進(jìn)料到所述可更換盒中包含的微流體單元。通過這種方式，在這種在線生物分析儀的協(xié)助下，可以進(jìn)行全自動(dòng)測(cè)量。在儲(chǔ)存的且為測(cè)量操作所需的試劑以及相應(yīng)的試劑溶液消耗后，或者在用于容納廢液的容器完全充滿后，將可更換盒更換為新的或復(fù)原后的可更換盒。


現(xiàn)在，將根據(jù)附圖中示出的實(shí)施方式實(shí)例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，所述附圖如下所示:
圖1是a)帶有結(jié)合的被分析物和靶分子的受體層的第一示意b)帶有結(jié)合的被分析物和靶分子的受體層的第二示意圖2是生物分析儀的微流體單元的平面示意圖3是圖2的微流體單元的示意性縱截面；
圖4是a)圖2的微流體單元在電化學(xué)清潔之前的平面示意b)圖2的微流體單元在電化學(xué)清潔期間的平面示意圖5是生物分析儀的微流體單元的第二種實(shí)施方式的示意圖，所述微流體單元由第一部件、形成導(dǎo)管的有穿孔的中間板和第二部件的復(fù)合體構(gòu)成，其中:
a)是第一部件的平面示意b)是形成導(dǎo)管的有穿孔的中間板的平面示意圖；并且
c)是第二部件的平面示意圖6是生物分析儀的微流體單元的第三種實(shí)施方式的示意圖，其中:
a)是使用圖6b)的切割面C-C獲得的示意性縱截面；并且
b)是使用圖6a)的切割面B-B獲得的示意性橫截面。
具體實(shí)施方式
圖la)是生物分析儀的可再生傳感器基質(zhì)的示意圖，所述傳感器基質(zhì)帶有受體R350和結(jié)合在受體R350上的被分析物分子R400以及同樣結(jié)合在受體R350上的其他靶分子R450。用作傳感器基質(zhì)的基底3的是結(jié)合硫醇基的導(dǎo)電表面。這可以是例如金或鉬表面，其由例如涂層、膜或固體金屬件例如小管形成。鉬和金具有高的親硫特性，并且還具有在化學(xué)上穩(wěn)定以及在面對(duì)下面詳細(xì)描述的受體層的電化學(xué)溶解和新受體層的制備時(shí)在化學(xué)上不改變、特別是不氧化的優(yōu)點(diǎn)。
在基底3上布置有第一化學(xué)物質(zhì)的層，所述第一化學(xué)物質(zhì)用作受體R350的結(jié)合分子R200。在親硫表面例如金或鉬表面的情況下，用于在基底3上形成結(jié)合層的結(jié)合分子R200可以是例如具有另一種官能團(tuán)的烷基硫醇，其中硫醇基與金或鉬表面共價(jià)鍵合。結(jié)合分子R200的另一個(gè)實(shí)例是α-巰基-ω-生物素聚乙二醇(也簡(jiǎn)稱為硫醇PEG生物素)。它可以經(jīng)由金屬硫在基底3上的結(jié)合而從水性溶液中被結(jié)合。通過任選添加具有僅僅一個(gè)在基底3上結(jié)合的硫醇基但不具有用于結(jié)合受體R350的另一種官能團(tuán)的巰基聚乙二醇，一方面，可以設(shè)定生物素基團(tuán)的表面密度。另一方面，引入的聚乙二醇防止了隨后添加的蛋白質(zhì)在基底表面上的非特異性吸附。
結(jié)合分子R200還具有至少一個(gè)其他官能團(tuán)，所述其他官能團(tuán)用作結(jié)合位置，用于經(jīng)由官能團(tuán)結(jié)合到受體R350的互補(bǔ)分子的特異性結(jié)合。在這種實(shí)例中，結(jié)合分子R200的其他官能團(tuán)由烷基硫醇的生物素基團(tuán)形成。如果α-巰基ω-生物素聚乙二醇用作結(jié)合分子R200，則其生物素基團(tuán)類似地用作用于特異性直接或間接結(jié)合受體R350的官能團(tuán)。在這種實(shí)例中，受體R350優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合在結(jié)合于結(jié)合分子R200上的分子R300上。在這種實(shí)例中，分子R300是結(jié)合生物素的分子例如鏈霉親和素。結(jié)合分子R200和分子R300 (分子R300優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合在結(jié)合分子R200的其他官能團(tuán)上，并且受體R350經(jīng)由分子R300而被結(jié)合在結(jié)合分子R200上)形成了通用接口，用于將大量可選擇的受體350結(jié)合在相同結(jié)合分子R200上，并由此用于將多個(gè)不同受體(間接)結(jié)合在基底3上。在這里示出的實(shí)例中，用于將受體R350結(jié)合在結(jié)合分子R200上的生物素-鏈霉親和素連接非常適合作為通用接口，這是因?yàn)樯锼鼗约跋鄳?yīng)地用鏈霉親和素標(biāo)記分子是生物技術(shù)中已建立的技術(shù)。特別是，生物素官能化的抗體被廣泛用于例如執(zhí)行免疫測(cè)定。
在圖1a)中所示的實(shí)例中，結(jié)合在受體R350上的是被分析物分子R400和其他靶分子R450，所述其他靶分子R450與被分析物分子R400競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合在受體R350上并被生物分析儀用于檢測(cè)。與被分析物R400類似，其他靶分子R450能夠通過親和相互作用優(yōu)選選擇性且特異性地而結(jié)合在受體R350上。被分析物R400可以是例如蛋白質(zhì)。在每種情況下，蛋白質(zhì)分子相應(yīng)地優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合在受體R350上。在這種情況下，其他靶分子R450優(yōu)選同樣是蛋白質(zhì)分子，其同樣優(yōu)選選擇性且特異性地、特別是通過親和相互作用結(jié)合在受體R350上。特別是，其他靶分子R450可以是標(biāo)記的或可隨后標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子。在本實(shí)例中，其他靶分子R450被提供有蛋白質(zhì)標(biāo)簽。蛋白質(zhì)標(biāo)簽是結(jié)合在實(shí)際蛋白質(zhì)上的氨基酸序列。蛋白質(zhì)標(biāo)簽在例如親和層析中用于凈化在生物技術(shù)方法中制造的靶蛋白，這是通過結(jié)合在靶蛋白上的蛋白質(zhì)標(biāo)簽與層析柱中使用的結(jié)合配偶體的特異性相互作用而將靶蛋白從方法的其余產(chǎn)物中分離來實(shí)現(xiàn)的。在本實(shí)例中，蛋白質(zhì)標(biāo)簽起到直接或間接結(jié)合帶有標(biāo)記物的分子R500的作用。標(biāo)記物具有物理或化學(xué)特性，生物分析儀的信號(hào)轉(zhuǎn)換器可以根據(jù)這些特性產(chǎn)生與結(jié)合在受體R350上的其他靶分子R450的數(shù)量相關(guān)并與結(jié)合在受體R350上的被分析物分子的數(shù)量間接相關(guān)的測(cè)量信號(hào)。為此目的，帶有標(biāo)記物的分子R500包含官能團(tuán)，該官能團(tuán)由于親和相互作用而特異性結(jié)合在靶分子R450上、優(yōu)選結(jié)合在它們的蛋白質(zhì)標(biāo)簽上。
如果液體樣品中存在的被分析物R400是蛋白質(zhì)Pfs，那么相應(yīng)的抗體(抗Pfs抗體)可以用作受體R350。在競(jìng)爭(zhēng)法中，為了測(cè)定液體樣品的被分析物含量，向液體樣品添加用作其他靶分子R450的競(jìng)爭(zhēng)物，在本情況下，其他靶分子R450例如為重組制造并裝備有血凝素標(biāo)簽(HA標(biāo)簽)的Pfs (HA-Pfs)，通過這種方式，獲得了用于生物分析儀所提供的分析的待測(cè)量液體。帶有標(biāo)記物的分子R500可以是例如與過氧化物酶偶聯(lián)的針對(duì)HA標(biāo)簽的抗體。通過添加被標(biāo)記物過氧化物酶催化的魯米諾/H2O2溶液而實(shí)現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光，被特別是包含光電二極管的光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電測(cè)量信號(hào)，其信號(hào)強(qiáng)度依賴于化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度。所述化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度又依賴于結(jié)合在靶分子R450上的帶有標(biāo)記物的分子R500的數(shù)量。因此，從利用信號(hào)轉(zhuǎn)換器產(chǎn)生的測(cè)量信號(hào)，可以推導(dǎo)出結(jié)合在受體層R450上的靶分子的數(shù)量，并可以從該信息得知待測(cè)量液體中被分析物分子R400的濃度。可以用生物分析儀的測(cè)量電路和/或電子數(shù)據(jù)處理單元對(duì)測(cè)量信號(hào)進(jìn)行處理，并可以由此推導(dǎo)出待測(cè)量液體以及相應(yīng)的液體樣品中被分析物的濃度。
為了證實(shí)使用這種由結(jié)合分子R200和其上結(jié)合在受體R350上的優(yōu)選選擇性且特異性結(jié)合的分子R300構(gòu)造而成的通用結(jié)合結(jié)構(gòu)也可以執(zhí)行完全不同的免疫測(cè)定，現(xiàn)在將參考圖1a)給出另一個(gè)實(shí)例，在該實(shí)例的情況中對(duì)液體樣品中的卡馬西平進(jìn)行檢測(cè)。與前面的實(shí)例中相同，用于結(jié)合受體的通用接口，經(jīng)由被結(jié)合分子R200固定的大量生物素基團(tuán)和與其結(jié)合的中性親和素或鏈霉親和素分子R300，而被形成在基底3上。針對(duì)藥劑卡馬西平的生物素化抗體R350被結(jié)合在所述通用接口上。隨后，將從已添加有過氧化物酶偶聯(lián)的卡馬西平衍生物的液體樣品形成的待測(cè)量液體引導(dǎo)經(jīng)過如此形成的傳感器基質(zhì)。在這樣的情況下，最初包含在液體樣品中的卡馬西平作為被分析物R400結(jié)合在受體上，并與以已知濃度存在的過氧化物酶偶聯(lián)的卡馬西平分子競(jìng)爭(zhēng)，所述過氧化物酶偶聯(lián)的卡馬西平分子是較早時(shí)制造的偶聯(lián)物，包含靶分子R450的功能性以及帶有標(biāo)記物的分子R500的功能性兩者?？蛇x地，也可以使用與HA標(biāo)簽共價(jià)鍵合的卡馬西平作為競(jìng)爭(zhēng)物。這與使用過氧化物酶偶聯(lián)的卡馬西平衍生物相比，具有的優(yōu)點(diǎn)是，HA標(biāo)簽具有比過氧化物酶顯著更小的分子量，使得被分析物與競(jìng)爭(zhēng)物之間的尺寸比盡可能小。如果被分析物與競(jìng)爭(zhēng)物具有非常不同的尺寸，則可能引起被分析物與競(jìng)爭(zhēng)物的極為不同的結(jié)合親和性，這通常是不合乎需要的。特別是在低分子量被分析物例如卡馬西平的情況下，與這樣的高分子量被分析物的偶聯(lián)、例如在酶的情況下與過氧化物酶的偶聯(lián)，可引起結(jié)合親和性的顯著改變，這對(duì)檢測(cè)和測(cè)定下限有不利影響，并相應(yīng)地增加測(cè)量誤差。
用于結(jié)合受體R350的另一種通用層結(jié)構(gòu)被顯示在圖1b)中。在這里，圖1a)中示出的基底3、大量結(jié)合分子R200的結(jié)合層和優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合在結(jié)合分子R200的官能團(tuán)上的分子R300這樣的層結(jié)構(gòu)，同樣用于結(jié)合受體R350。然而，所述層結(jié)構(gòu)增補(bǔ)有另一種結(jié)合層，在該另一種結(jié)合層上也可以以各種不同方式結(jié)合非生物素化的受體R350。在本實(shí)例中，該附加的結(jié)合層由生物素化的免疫球蛋白結(jié)合分子R310例如針對(duì)IgG型免疫球蛋白的生物素化抗體(生物素抗IgG抗體)、或生物素化的蛋白A/G構(gòu)成。隨后，可以將在過去的免疫學(xué)測(cè)試方法中已確立的大量不同抗體結(jié)合在其上作為受體，而不必改變位于下方的層或其構(gòu)建方法。
圖2示出了用于檢測(cè)液體樣品中的被分析物或測(cè)定其濃度的生物分析儀的微流體系統(tǒng)100的平面圖。微流體系統(tǒng)100包括例如透明合成材料的底板la，其在底平面上具有開放的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，所述導(dǎo)管結(jié)構(gòu)由底板Ia中的凹陷部形成并包括導(dǎo)管區(qū)段10、15、20、30、40和接合部12、18。位于底板Ia上并將導(dǎo)管區(qū)段10、15、20、30、40相對(duì)于彼此以及環(huán)境密封的，是終端蓋板lb，其例如同樣由透明合成材料形成。這在圖2的切割面A-A上所獲取的圖3的橫截面圖中是明顯的。平臺(tái)Ia和蓋板Ib通過形狀、力或材料粘合的互鎖連接件Ic例如膠粘劑粘合或加壓接縫而彼此固定地連接。由蓋板Ib密封的導(dǎo)管區(qū)段10、15、20、30、40形成液體管線，待分析的液體樣品以及給定情況下的其他試劑被引導(dǎo)通過所述管線用于執(zhí)行測(cè)量。
此外，平臺(tái)Ia包括可以與液體供應(yīng)管相連的連接件110，120和可以與排出管相連的連接件130、140，液體可以通過所述連接件被進(jìn)料到導(dǎo)管結(jié)構(gòu)或從導(dǎo)管結(jié)構(gòu)排出。供應(yīng)和排出管線將微流體系統(tǒng)100與被布置在遠(yuǎn)處的儲(chǔ)液器相連，在所述儲(chǔ)液器中容納有用于執(zhí)行測(cè)量以及相應(yīng)的分析的液體。經(jīng)由供應(yīng)和排出管線，可以將待檢測(cè)的液體樣品以及在給定情況下被容納在儲(chǔ)液器中并將被添加到液體樣品中的試劑兩者供應(yīng)到微流體系統(tǒng)100。液體通過微流體系統(tǒng)100的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的遞送和排出，可以例如利用泵或通過氣動(dòng)方式來進(jìn)行。
可選地，如圖2中所示，導(dǎo)管結(jié)構(gòu)也可以被看作微流體系統(tǒng)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，其不依賴于液體管線的具體實(shí)施方式
。因此，也可以例如使用微流體軟管和/或小管來構(gòu)造圖示的結(jié)構(gòu)。液體管線優(yōu)選具有在IO7和I μ m2之間、優(yōu)選在IO6和IO2 μ m2之間、更優(yōu)選在IO5和IO4 μ Hl2之間的橫截面。
由微流體系統(tǒng)100的導(dǎo)管區(qū)段形成的測(cè)量導(dǎo)管30包括基底3，所述基底3已經(jīng)根據(jù)圖1進(jìn)行過描述并實(shí)施為測(cè)量導(dǎo)管的導(dǎo)電表面區(qū)域?；?可以例如實(shí)施為被放置在蓋板Ib上的金屬膜，例如金或鉬膜。與在測(cè)量導(dǎo)管30中流動(dòng)的液體發(fā)生接觸的基底區(qū)域用作測(cè)量區(qū)7，傳感器基質(zhì)被構(gòu)建在所述測(cè)量區(qū)中，并且在給定情況下，被引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30的液體樣品或待測(cè)量液體中包含的被分析物結(jié)合在傳感器基質(zhì)上，并利用信號(hào)轉(zhuǎn)換器、特別是光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器進(jìn)行檢測(cè)。
經(jīng)由接合部18與測(cè)量導(dǎo)管30相連的另一個(gè)導(dǎo)管區(qū)段40，包含附加的導(dǎo)電的表面區(qū)域作為對(duì)電極4，其被形成為例如置于蓋板上的金屬膜?；?以及對(duì)電極4兩者經(jīng)由電連接件(未示出)與恒壓或恒流電壓源相連。如果電解質(zhì)流過導(dǎo)管區(qū)段30和40，則基底3和對(duì)電極4經(jīng)由電解質(zhì)進(jìn)行導(dǎo)電接觸。通過在基底3與對(duì)電極4之間施加電勢(shì)差，可以實(shí)現(xiàn)通過電解質(zhì)的電流流動(dòng)。
在這里顯示的實(shí)例中，在附加的導(dǎo)管區(qū)段20中布置有第三導(dǎo)電表面區(qū)域，其可以任選用作參比電極2。參比電極2同樣實(shí)施為金屬層，特別是微流體單元100的蓋板Ib上的銀層，用于形成Ag/AgCl參比電極。在這里，電連接件也可以連接到例如恒壓或恒流源。
現(xiàn)在，將參考圖2中示例的微流體系統(tǒng)和圖1的帶有受體的傳感器基質(zhì)，來描述用于制備傳感器基質(zhì)和用于檢測(cè)待測(cè)量溶液中的被分析物或測(cè)定其濃度的方法。
首先，在基底3上制備傳感器基質(zhì)。傳感器基質(zhì)包括具有受體R350的受體層，在所述受體上優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合待測(cè)定的靶分子R450。為此，在第一步驟中，將具有硫醇基和另一種官能團(tuán)的結(jié)合分子R200例如帶有附加官能團(tuán)的烷基硫醇的第一制備溶液，引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30。結(jié)合分子R200經(jīng)由它們的硫醇基共價(jià)鍵合于基底3，并在理想情況下在基底3上形成單層。將制備溶液以優(yōu)選恒定的流速引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30，持續(xù)預(yù)定的第一時(shí)間長(zhǎng)度，直至產(chǎn)生的結(jié)合層的如上所定義的覆蓋度安全地達(dá)到大于80%?？梢栽诔醪綄?shí)驗(yàn)中確定為此所需的時(shí)間長(zhǎng)度。該時(shí)間長(zhǎng)度特別依賴于流速、結(jié)合分子R200的類型、制備溶液的濃度、結(jié)合速率和其他環(huán)境變量例如溫度。
當(dāng)已經(jīng)完成用結(jié)合分子R200形成傳感器基質(zhì)的第一結(jié)合層時(shí)，在一次或多次洗滌、漂洗步驟(在下面不進(jìn)一步明確陳述)后，在第二步驟中，將第二制備溶液引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30。該第二制備溶液含有實(shí)際的受體R350，受體R350被結(jié)合在優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合在第一結(jié)合層上的官能團(tuán)R300上。例如，形成第一結(jié)合層的結(jié)合分子R200可以具有生物素基團(tuán)，結(jié)合在受體R350上的結(jié)合生物素的基團(tuán)R300例如鏈霉親和素基團(tuán)特異性結(jié)合在所述生物素基團(tuán)上。第二制備溶液的進(jìn)料被執(zhí)行一段時(shí)間長(zhǎng)度，該時(shí)間長(zhǎng)度被選擇成使得由結(jié)合在結(jié)合分子R200上的受體所形成的受體層的覆蓋度如上所定義合計(jì)為至少80%。為此所需的時(shí)間長(zhǎng)度可以在初步實(shí)驗(yàn)中被確定。
在本實(shí)例中，傳感器基質(zhì)的制備只需要兩個(gè)步驟，即將結(jié)合分子R200結(jié)合在基底3上，以及隨后將受體R350經(jīng)由它們的官能團(tuán)R300結(jié)合在結(jié)合分子R200上。然而，另一個(gè)選擇方案是不將受體R350結(jié)合在直接特異性結(jié)合在第一結(jié)合層上的官能團(tuán)上，而是首先經(jīng)由一種或多種其他結(jié)合分子、由此經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)其他結(jié)合層而結(jié)合在第一結(jié)合層上。該一種或多種附加的結(jié)合分子，在一個(gè)或多個(gè)附加步驟中通過引導(dǎo)在每種情況下含有將要結(jié)合在最后施加層的官能團(tuán)上的結(jié)合分子的相應(yīng)制備溶液，而被結(jié)合。在這樣的情況下，產(chǎn)生了具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合層和最終受體層的傳感器基質(zhì)的層結(jié)構(gòu)。優(yōu)選情況下，傳感器基質(zhì)的所有層具有至少80的覆蓋度，正如上面已經(jīng)解釋的。
如果受體R350已被施加在表面上，則傳感器基質(zhì)的制備已經(jīng)結(jié)束，并且可以執(zhí)行液體樣品中或通過用一種或多種附加試劑處理所述液體樣品而獲得的待測(cè)量液體中被分析物的檢測(cè)或被分析物濃度的測(cè)定。
用于測(cè)定被分析物濃度的各個(gè)方法步驟依賴于所執(zhí)行的檢測(cè)方法。例如，可以將被分析物結(jié)合在受體上，并直接檢測(cè)該結(jié)合或通過將附加的受體結(jié)合在被固定在第一受體上的被分析物上來檢測(cè)該結(jié)合(夾心試驗(yàn)方法)。正如上面已經(jīng)描述的，也可以檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合在受體上的靶分子來代替被分析物。也可以將含有被分析物的測(cè)量溶液在較早時(shí)與含有結(jié)合在被分析物上的靶分子的附加溶液(試劑)混合，以便形成被分析物與靶分子的復(fù)合體。然后將該混合物引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管并檢測(cè)結(jié)合在受體層上的剩余游離靶分子(結(jié)合抑制試驗(yàn))。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多通過將靶分子結(jié)合在受體層上來檢測(cè)被分析物或測(cè)定其濃度的其他方法，正如開始時(shí)簡(jiǎn)要刻畫的。通過將測(cè)量溶液或與一種或多種試劑溶液混合的測(cè)量溶液相應(yīng)地引導(dǎo)通過帶有微流體單元100或下面描述的實(shí)施方式的生物分析儀中的測(cè)量導(dǎo)管30，可以重現(xiàn)所有這些方法。
在本實(shí)例中，執(zhí)行競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)方法。在這樣的情況下，將含有被分析物R400的待測(cè)量液體與含有濃度已知的作為競(jìng)爭(zhēng)物的其他靶分子R450的溶液的混合物引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30。靶分子R450與被分析物分子R400競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合在受體R350上。正如較早時(shí)描述的，靶分子R450是標(biāo)記有蛋白質(zhì)標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，并且除了標(biāo)簽之外，與被分析物R400基本相同。
在將靶分子以及因此被分析物R400和其他靶分子R450結(jié)合在受體層上后，在附加步驟中，將含有帶有標(biāo)記物的分子R500的溶液引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30，所述帶有標(biāo)記物的分子R500特異性結(jié)合在靶分子R450的官能團(tuán)上，在本實(shí)例中是結(jié)合在靶分子R450的蛋白質(zhì)標(biāo)簽上。在本實(shí)例中，帶有標(biāo)記物的分子是抗HA抗體-過氧化物酶偶聯(lián)物?？蛇x地，帶有標(biāo)記物的分子也可以被間接結(jié)合。因此，例如在第一步驟中，可以在含有蛋白質(zhì)標(biāo)簽的其他靶分子R450上結(jié)合生物素化的抗HA抗體，其上隨后結(jié)合標(biāo)記有熒光染料的鏈霉親和素作為帶有標(biāo)記物的分子。
如果標(biāo)記物是過氧化物酶，那么在附加步驟中，將含有魯米諾和H2O2的溶液引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30，其引起發(fā)光輻射的發(fā)射。利用光電信號(hào)轉(zhuǎn)換器(未示出)例如光電二極管來記錄發(fā)出的輻射，并將其轉(zhuǎn)變成電測(cè)量信號(hào)。通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器將測(cè)量信號(hào)輸出到測(cè)量電路，所述測(cè)量電路放大并處理測(cè)量信號(hào)，并將處理過的測(cè)量信號(hào)輸出到數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)例如微型計(jì)算機(jī)。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)利用安裝的評(píng)估程序從測(cè)量信號(hào)推導(dǎo)出待測(cè)量液體中被分析物的濃度，并將該濃度輸出到顯示系統(tǒng)，和/或經(jīng)由數(shù)據(jù)線輸出到上級(jí)單元。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可以是控制單元的部件，所述控制單元控制生物分析儀的功能，處理、儲(chǔ)存并輸出測(cè)量信號(hào)，并處理和執(zhí)行來自于服務(wù)人員或來自于上級(jí)單元的用于生物分析儀的維護(hù)和/或控制的輸入命令。
依賴于用于檢測(cè)液體樣品或待測(cè)量液體中的被分析物或測(cè)定其濃度的測(cè)試方法，可以使用不同的信號(hào)轉(zhuǎn)換器來產(chǎn)生與結(jié)合在受體層上的靶分子數(shù)量相關(guān)的測(cè)量信號(hào)。例如，代替用于檢測(cè)靶分子的化學(xué)發(fā)光，也可以激發(fā)熒光。在這種情況下，將用于激發(fā)熒光的輻射輻照到微流體單元內(nèi)受體層的區(qū)域中，并利用光電信號(hào)轉(zhuǎn)換器例如光電二極管記錄發(fā)射的熒光輻射。此外，還可以執(zhí)行吸收測(cè)量來檢測(cè)靶分子。在所有這些情況下，有利的是，記錄通過微流體單元100的透明底板Ia或通過微流體單元100的蓋板Ib的測(cè)量輻射、即例如發(fā)光或熒光輻射，并在給定情況下將必需的激發(fā)輻射(用于熒光或吸收測(cè)量)相應(yīng)地發(fā)送通過透明底板或蓋板，。對(duì)于輻射被輻照到蓋板Ib中或記錄通過蓋板Ib的輻射的情形來說，有利情況下，其上施加有傳感器基質(zhì)的基底3對(duì)于施加的波長(zhǎng)一般來說位于300nm和900nm之間的輻照來說是透明的。這通過使形成基底3的導(dǎo)電涂層例如金或鉬涂層足夠地薄來實(shí)現(xiàn)。在這里，優(yōu)選情況下，這意味著涂層厚度小于IOOnm,優(yōu)選在10和50nm之間。這種厚度的金或鉬層對(duì)于使用300至900nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的測(cè)量輻射進(jìn)行光學(xué)測(cè)量來說，足夠透明。為了在測(cè)量區(qū)區(qū)域中獲得所需光學(xué)透明性，可選地，也可以將基底施加為結(jié)構(gòu)化涂層，例如無涂層并因此具有透明的中間空間的襯結(jié)構(gòu)或晶格結(jié)構(gòu)的形式。在使用酶作為標(biāo)記物和發(fā)色酶底物的情形中，另一種變化形式是在實(shí)際測(cè)量區(qū)后、例如在測(cè)量導(dǎo)管30的區(qū)域中出口 130前方帶有透明區(qū)，以便可以在透明區(qū)中測(cè)量流過導(dǎo)管的液體的吸收。除了過氧化物酶之外，磷酸酶和其他酶也在生物分析中廣泛用作標(biāo)記物。可用于它們的還有大量不同的酶底物。
在結(jié)束測(cè)量后，為了執(zhí)行下一個(gè)測(cè)量，進(jìn)行受體層的再生。由于被分析物分子R400以及相應(yīng)的靶分子R450的釋放，或者經(jīng)由結(jié)合基團(tuán)R300結(jié)合在結(jié)合分子R200上的受體R350的釋放不完全能夠以足夠可重復(fù)的方式進(jìn)行，因此為了重新清潔基底3，釋放整個(gè)傳感器基質(zhì)，包括其上結(jié)合的被分析物分子R400以及相應(yīng)的靶分子R450，包括結(jié)合在其上的所有附加分子。實(shí)驗(yàn)顯示，結(jié)合分子R200和經(jīng)由結(jié)合基團(tuán)R300結(jié)合的受體R350在分子水平上形成互連的共價(jià)或非共價(jià)鍵合的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)通過純化學(xué)清潔即使在升高的溫度下也只能艱難地或在長(zhǎng)時(shí)間后被完全溶解，在所述情況下將清潔液體例如酸、氧化酸、堿溶液或有機(jī)溶劑引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30。
已發(fā)現(xiàn)，為了完全移除傳感器基質(zhì)和結(jié)合在其上的分子，電化學(xué)清潔方法是有效的，在這種情況下在基底3與對(duì)電極4之間放置電勢(shì)差，同時(shí)將電解質(zhì)液體引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30以及附加導(dǎo)管區(qū)段40兩者。由施加在基底3與對(duì)電極4之間的電勢(shì)差引起的通過電解質(zhì)液體的電流流動(dòng)，導(dǎo)致在給定情況下在分子水平上共價(jià)或非共價(jià)交聯(lián)的傳感器基質(zhì)、包括結(jié)合在其上的附加分子溶解。
在這里描述的基于圖2的實(shí)施方式中，基底3、對(duì)電極4和參比電極2實(shí)施為3個(gè)電極電路的形式，其中利用恒壓電路來設(shè)定參比電極2與基底3之間的電勢(shì)差，并利用對(duì)電極4來控制所述電勢(shì)差。
為了清潔基底3，可以將恒定的電勢(shì)差施加例如預(yù)定長(zhǎng)度的時(shí)間。已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施加在基底與參比電極之間的電勢(shì)差通過例如電勢(shì)的線性掃描而在最大值與最小值之間連續(xù)變化，其中所述最大值和最小值優(yōu)選具有不同符號(hào)，使得氧化電勢(shì)和還原電勢(shì)交替出現(xiàn)在基底3上時(shí)，對(duì)形成基底3的金屬涂層特別具有保護(hù)性?；?相對(duì)于參比電極的的電勢(shì)從起始值向最大值、隨后向最小值、然后返回到起始值(或其他輪轉(zhuǎn)方式)的移動(dòng)、特別是線性移動(dòng)，被稱為“循環(huán)”。優(yōu)選情況下，為了清潔基底3，完成許多循環(huán)，例如2至100個(gè)或甚至多達(dá)1000個(gè)循環(huán)。
為電化學(xué)清潔所選擇的實(shí)際條件，除了其他因素之外，還依賴于電解質(zhì)和傳感器基質(zhì)各自的組成、微流體系統(tǒng)的幾何形狀、以及基底3和相應(yīng)的對(duì)電極4的布置和材料選擇。這些因素一般來說在初步實(shí)驗(yàn)中被確定。在這樣的情況下，清潔方法將被優(yōu)化，使得一方面確保完全移除傳感器基質(zhì)，而在另一方面電極不受攻擊。在初期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一般來說，當(dāng)基底相對(duì)于Ag/AgCl參比電極的電勢(shì)在-0.5V至-1.25V范圍內(nèi)的負(fù)值與+1.5V至+2.25V范圍內(nèi)的正值之間線性變化時(shí)，獲得特別好的清潔效力，其中在達(dá)到最大和最小值后，任選將電勢(shì)在每種情況下保持固定數(shù)秒的時(shí)間長(zhǎng)度。通過這種方式，將傳感器基質(zhì)交替暴露于氧化和還原性條件以及產(chǎn)生的氫和相應(yīng)的氧，使得傳感器基質(zhì)的不同組分氧化性以及相應(yīng)地還原性地釋放、特別是分解。純氧化性的清潔同樣也是可能的；然而已發(fā)現(xiàn)，在這種情況下，基底可能受損。在所陳述的電勢(shì)范圍內(nèi)特別有利的是，在最大值以及相應(yīng)的最小值時(shí)，在水性電解質(zhì)存在下，分別發(fā)生氧和氫的產(chǎn)生。在這種情況下，形成的氧和相應(yīng)的氫支持性地有助于傳感器基質(zhì)組分的溶解和分解。
存在大量不同的可以使用的電勢(shì)或電流函數(shù)，其實(shí)例是三角、鋸齒、正弦、矩形或不同脈沖和階梯函數(shù)。在這樣的情況下，特別優(yōu)選的函數(shù)是其中在每個(gè)周期中、因此在每次電勢(shì)掃描的情形中，電流流動(dòng)在某段時(shí)間、更優(yōu)選在相對(duì)于周期長(zhǎng)度的10至95%的時(shí)間內(nèi)合計(jì)接近零的函數(shù)。
在使用鉬基底的實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)，對(duì)于氧化性清潔來說，基底的電勢(shì)相對(duì)于銀/氯化銀參比電極的電勢(shì)，至少有時(shí)優(yōu)選被設(shè)定為高于+0.6V，優(yōu)選高于+1.0V。對(duì)于還原性清潔來說，基底的電勢(shì)相對(duì)于銀/氯化銀參比電極的電勢(shì)，至少有時(shí)優(yōu)選被設(shè)定為低于-0.2V，優(yōu)選低于-0.4V。由于小的過電壓在這些條件下在鉬上產(chǎn)生氫，因此為還原性清潔產(chǎn)生了足夠的氫。優(yōu)選情況下，作為電勢(shì)的循環(huán)或周期性移動(dòng)的結(jié)果，發(fā)生氧化性和還原性清潔的交替。在特別簡(jiǎn)單的變化形式中，為了調(diào)節(jié)電勢(shì)，使用可設(shè)定或可改變的電壓源，其輸出不參比于地電勢(shì)。
優(yōu)選情況下，在電勢(shì)掃描期間以及相應(yīng)的循環(huán)期間出現(xiàn)的最大電流密度，相對(duì)于微流體管道內(nèi)的基底面積、特別是基底的測(cè)量區(qū)中的面積，為大于2mA/cm2、更優(yōu)選大于20mA/cm2。在每種情況下，相對(duì)于微流體管道內(nèi)的基底面積、特別是測(cè)量區(qū)的面積，優(yōu)選地，在基底的再生以及相應(yīng)的清潔期間流過的正電流電荷大于+0.2C/cm2、更優(yōu)選大于+2C/cm2,流過的負(fù)電流電荷小于-0.2C/cm2、更優(yōu)選小于-2C/cm2。此外，優(yōu)選情況下，在電解再生以及相應(yīng)的清潔中流過基底的正電荷和負(fù)電荷，具有基本上相等或差別小于25%的量值。
在電勢(shì)進(jìn)行線性掃描的情況下在基底3上出現(xiàn)的電流，可以任選以循環(huán)伏安圖的形式被記錄和評(píng)估。如此測(cè)量的循環(huán)伏安圖尤其可以提供關(guān)于傳感器基質(zhì)的殘留物是否仍結(jié)合在導(dǎo)電基底3上的信息。因此，可以根據(jù)記錄的循環(huán)伏安圖來確定清潔階段的成功結(jié)束。此外，其他電壓測(cè)量分析方法例如方波伏安法或差分脈沖伏安法，也適用于此。
現(xiàn)在將根據(jù)圖4a)和4b)詳細(xì)描述這種利用微流體系統(tǒng)100清潔基底3的電化學(xué)清潔方法的實(shí)例。在基底3與對(duì)電極4之間施加電勢(shì)差之前，首先經(jīng)由連接到液體供應(yīng)管線的連接件120將3M KCl水溶液引導(dǎo)到導(dǎo)管區(qū)段20中，然后經(jīng)由接合部12進(jìn)一步引導(dǎo)到測(cè)量導(dǎo)管30中，并經(jīng)由測(cè)量導(dǎo)管30與附加導(dǎo)管區(qū)段40之間的接合部18引導(dǎo)到其中布置有對(duì)電極4的附加導(dǎo)管區(qū)段40中。液體通過所述導(dǎo)管區(qū)段的供應(yīng)，通過在輸入連接件120與排出連接件130、140之間提供壓力差，而在輸入連接件110與排出連接件130、140之間沒有壓力差來進(jìn)行。
一旦為了電化學(xué)清潔而將其中布置有參比電極2的導(dǎo)管區(qū)段20用KCl溶液填充后，立即將用于電化學(xué)清潔的清潔電解質(zhì)例如IOOmMNa2SO4溶液經(jīng)由供應(yīng)連接件100引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30，并也經(jīng)由接合部18引導(dǎo)到帶有對(duì)電極4的導(dǎo)管區(qū)段40中。此外，還發(fā)現(xiàn)，在給定條件下添加有0.25體積％過氧化氫的磷酸鹽含量為100mmol/l的酸性磷酸鹽緩沖溶液(pH=2.1),也適合作為清潔電解質(zhì)?？偟膩碚f，清潔溶液的組成應(yīng)該被選擇成使得在基底與對(duì)電極之間的低電勢(shì)下能夠獲得盡可能高的電流流動(dòng)。通過這種方式，能夠?qū)崿F(xiàn)高的清潔效力并且對(duì)電極損害很小或沒有損害。
清潔電解質(zhì)在該流動(dòng)通路上的導(dǎo)流，通過在供應(yīng)連接件110與兩個(gè)排出連接件130、140之間施加壓力差來實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，確保在第二供應(yīng)連接件120與排出連接件130、140之間不存在壓力差，以便防止Na2SO4溶液在帶有參比電極2的導(dǎo)管區(qū)段20中流動(dòng)。因此，在接合部處形成了較早導(dǎo)入的KCl溶液與Na2SO4溶液之間的過渡，經(jīng)由這種過渡可以發(fā)生載荷子交換。通過這種方式，為參比電極形成了無隔膜的電解質(zhì)橋，所述參比電極的參比電解質(zhì)KCl溶液經(jīng)由接合部與用作清潔電解質(zhì)的Na2SO4溶液導(dǎo)電接觸，而不需要多孔隔膜、間隙、燒結(jié)玻璃或?qū)⒈入娊赓|(zhì)與清潔電解質(zhì)物理隔開的其他手段。
在測(cè)量導(dǎo)管30和帶有對(duì)電極4的導(dǎo)管區(qū)段40完全充滿清潔電解質(zhì)后，在基底3與對(duì)電極4之間施加電勢(shì)差。這可以通過例如向基底3相對(duì)于參比電極2施加一定電勢(shì)來進(jìn)行。在導(dǎo)管區(qū)段10與導(dǎo)管區(qū)段20之間的接合部12處，導(dǎo)管區(qū)段20中包含的KCl電解質(zhì)與導(dǎo)管區(qū)段10、15中容納的清潔電解質(zhì)之間的液體接合部形成了無隔膜的電解質(zhì)橋，參比電極2經(jīng)由所述無隔膜的電解質(zhì)橋與基底3相連。使用恒壓電路，對(duì)基底3與對(duì)電極4之間的電流進(jìn)行設(shè)置以獲得所需電勢(shì)。相應(yīng)地，也在基底3與對(duì)電極4之間產(chǎn)生電勢(shì)差和電流流動(dòng)。如上所述，相對(duì)于參比電極2施加到基底3的電勢(shì)在最大值與最小值之間例如線性地移動(dòng)多次。這一過程被證明對(duì)形成基底3的金屬膜特別具有保護(hù)性。
在基底3或?qū)﹄姌O4的電化學(xué)清潔中出現(xiàn)的、在給定情況下由例如一個(gè)電極上產(chǎn)生的氫或氧所造成的氣泡，以從接合部18經(jīng)由排出管130、140離開微流體系統(tǒng)的管道系統(tǒng)的電解質(zhì)液體流動(dòng)方向(比照?qǐng)D4b)的箭頭)排出。同樣地，從基底3釋放的分子、分子部分或分子聚集體也以該流動(dòng)方向從測(cè)量導(dǎo)管30排出，以便防止重新吸附。
生物分析儀的微流體單元的大量可選實(shí)施方式是可能的。圖5示出了微流體單元的優(yōu)選實(shí)施方式。用與前面的實(shí)例中所使用的同樣的指稱符號(hào)指稱同樣的部件。微流體單元包括第一部件la’(圖5a))、第二部件lb’(圖5c))和布置在第一部件la’與第二部件lb’之間的中間板lc’(圖5b))，它們都以平面圖被示出在圖5中。
圖5a)中示出的第一部件la’可以是透明材料例如玻璃或塑料。在平面圖中可以看見實(shí)施為膜的參比電極2和基底3。用作參比電極2的是例如銀/氯化銀參比電極，其由在給定情況下經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)中間層、特別是增粘劑而被施加在部件la’上的銀膜形成。通過例如用氯化鐵(III)溶液處理，將銀膜的表面氯化。基底3同樣在給定情況下經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)中間層被施加為第一部件la’上的膜。在這樣的情況下，例如，它可以是例如通過濺射施加的50至500nm厚的鉬層。鉬層用作親硫性基底，利用形成第一結(jié)合層的第一化學(xué)物質(zhì)的鉬硫結(jié)合的形成來結(jié)合傳感器基質(zhì)。基底3與參比電極2可以與例如測(cè)量電路和/或電壓源例如恒壓源或恒流源電連接(經(jīng)由沒有更詳細(xì)示出的連接件)。
部件la’的區(qū)域5和5’未涂覆有導(dǎo)電材料。在給定情況下，可以用化學(xué)上穩(wěn)定和電絕緣的材料例如氮化硅Si3N4涂覆區(qū)域5和5’，在給定情況下，這僅僅在與電極相鄰的區(qū)域中做出。優(yōu)選情況下，這樣的涂層被施加成在電極表面上重疊例如10至100 μ m，因此在基底3的電化學(xué)清潔期間能夠有效地避免電極的侵蝕，并因此避免例如粘合助劑如二氧化鈦的攻擊。此外，用110、110’和120標(biāo)出的是微流體單元的供應(yīng)連接件，用130和140標(biāo)出的是微流體單元的排出連接件。它們?cè)趫D示的實(shí)例中作為孔實(shí)施，其中在視圖中未示出的表面上，可以例如通過粘附來安裝例如常規(guī)連接件，用于連接微流體軟管線。
圖5c)在平面圖中示出了微流體單元的第二部件lb’。與第一部件la’相同，第二部件lb’可以由透明材料例如玻璃或塑料形成，其中電極2’、4和4’以及電絕緣區(qū)域6、6’以膜的形式，在給定情況下經(jīng)由中間層、特別是促進(jìn)粘合的中間層而被提供在第二部件lb’上。參比電極2’實(shí)施成與被施加在第一部件la’上的參比電極2相同。對(duì)電極包括第一對(duì)電極區(qū)4和第二對(duì)電極區(qū)4’。第一對(duì)電極區(qū)4由導(dǎo)電的化學(xué)惰性物質(zhì)例如摻雜硼的金剛石或鉬形成，以完整膜的形式被施加。在組裝的微流體單元中位于彎曲形狀的測(cè)量導(dǎo)管30區(qū)域中的區(qū)域4’中，對(duì)電極以被中斷的方式實(shí)施。在圖示的實(shí)例中，其是與對(duì)電極區(qū)4側(cè)面相連的管線結(jié)構(gòu)，例如由寬度為例如10 μ m并以例如20 μ m的相互間隔平行布置的管線構(gòu)成。同樣地，其他尺寸和幾何形狀例如晶格結(jié)構(gòu)，也適用于這里。在使用非光學(xué)透明電極材料的情形中，由此在測(cè)量導(dǎo)管的測(cè)量區(qū)7中、因此也在相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換器的幫助下被用于獲得測(cè)量信號(hào)的區(qū)域中，產(chǎn)生了部分光學(xué)透明性。因此，在酶標(biāo)記物的幫助下使用間接方法運(yùn)行的生物分析儀的微流體單元的優(yōu)選實(shí)施方式中，例如，光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器被布置在對(duì)電極4’的區(qū)域或部分的下方，所述信號(hào)轉(zhuǎn)換器的記錄區(qū)由圖5c)中用圓形區(qū)域標(biāo)出的測(cè)量區(qū)7形成。信號(hào)轉(zhuǎn)換器可以具有例如光電二極管，其記錄由酶標(biāo)記物催化產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的光，并將其轉(zhuǎn)變成成比例的電流信號(hào)。對(duì)電極4、4’和參比電極2’具有沒有更詳細(xì)示出的用于電接觸的連接件。在微流體單元的組裝狀態(tài)下，形成在第一部件la’上的參比電極2和形成在第二部件lb’上的參比電極2’可以彼此導(dǎo)電連接，和/或通過來自于測(cè)量電路例如恒壓或恒流電路的共有連接件進(jìn)行接觸。
圖5b中示出的有穿孔的中間板lc’包含例如125 μ m厚的聚二甲基硅氧烷(PDMS)彈性墊。為了形成微流體單元，第一部件la’的在圖5a)中面朝觀察者的底板表面和第二部件lb’的在圖5c)中面朝觀察者的底板表面被布置成彼此面對(duì)，彼此隔開并彼此相對(duì)放置，并且中間板lc’作為兩個(gè)部件la’與lb’之間的間隔元件被插入，并與部件la’和lb’對(duì)齊。如果中間板lc’由彈性材料形成，則第一部件la’和第二部件lb’可以通過將兩側(cè)壓向布置在其間的中間板lc’來液密性地連接在一起，并由此形成具有相對(duì)于環(huán)境密封的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的微流體單元。在圖示的實(shí)例中，導(dǎo)管的寬度為500 μ m。在可選實(shí)施方式中，在光刻法中從光敏材料例如從光致抗蝕劑產(chǎn)生形成導(dǎo)管的有穿孔的中間板。在這種情況下，中間板lc’優(yōu)選與第一和第二部件la’以及相應(yīng)的lb’固定相連。
現(xiàn)在將在下面描述如此形成的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)。構(gòu)建傳感器基質(zhì)(步驟i)、執(zhí)行測(cè)量(步驟ii)以及再生和相應(yīng)地清潔基底(步驟iii)所需的試劑和相應(yīng)的試劑溶液，可以經(jīng)由連接件110和110’從供應(yīng)容器或樣品進(jìn)料供應(yīng)以及給定情況下的混合系統(tǒng)(未示出)被進(jìn)料。任選地，微流體單元還可以具有其他連接件(未示出)。在優(yōu)選的變化形式中，將可以彼此相互作用的試劑或試劑溶液經(jīng)由兩個(gè)不同的供應(yīng)管線進(jìn)料到微流體單元。通過這種方式，防止這樣的組分與供應(yīng)系統(tǒng)中已經(jīng)存在的另一種組分相互作用，例如一種后續(xù)的試劑可能與早先被傳送通過供應(yīng)管線并仍保持吸附在供應(yīng)系統(tǒng)的壁上的其他試劑相互作用。在本發(fā)明的生物分析儀的運(yùn)行較長(zhǎng)的情況下，供應(yīng)系統(tǒng)中組分和試劑的這種相互作用一方面可以引起較大的合生，另一方面可以引起試劑在移動(dòng)通過微流體單元、特別是通過測(cè)量導(dǎo)管30時(shí)初始濃度降低，這特別是在需要低的檢測(cè)限的情況下，對(duì)測(cè)量結(jié)果的可重復(fù)性具有負(fù)面影響，并相應(yīng)地可能增加必須供應(yīng)試劑的時(shí)間長(zhǎng)度，并由此強(qiáng)烈地增加試劑消耗。
來自于連接件110’的導(dǎo)管區(qū)段10’與來自于連接件110的導(dǎo)管區(qū)段10在導(dǎo)管接合部12處相匯。在導(dǎo)管接合部11處，可以將液體經(jīng)由導(dǎo)管區(qū)段40引導(dǎo)到與排出連接件140相連的廢液容器(未示出)中，這相當(dāng)于繞過測(cè)量區(qū)。在這樣的情況下，微流體單元的外部電路相應(yīng)地經(jīng)由液體驅(qū)動(dòng)裝置和閥進(jìn)行導(dǎo)流。由導(dǎo)管區(qū)段40形成的旁路的優(yōu)點(diǎn)在于，通過這種方式，可以首先引導(dǎo)試劑和相應(yīng)的試劑溶液通過實(shí)際的測(cè)量單元，直至最初可能包含的氣泡從供應(yīng)系統(tǒng)中被移除，并且在用第二種得到的試劑和相應(yīng)的試劑溶液替換第一種試劑和相應(yīng)的第一種試劑溶液時(shí)，直至向第二種試劑和相應(yīng)的試劑溶液過渡的濃度梯度已通過導(dǎo)管系統(tǒng)或至少通過導(dǎo)管接合部12。通過試劑或試劑溶液的這種預(yù)備性導(dǎo)流，可以確保在將試劑或試劑溶液引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30并引導(dǎo)通過測(cè)量區(qū)的情況下，它們從一開始就以相同濃度和基本上不含氣泡的狀態(tài)通過，因此在使用自動(dòng)生物分析儀重復(fù)執(zhí)行上述方法步驟i至iii的情況下，對(duì)測(cè)量結(jié)果的可重復(fù)性具有正面影響。
在本實(shí)例中，測(cè)量導(dǎo)管30是彎曲的形狀，其中優(yōu)選情況下，微流體單元的所有導(dǎo)管具有相同的橫截面。通過這種方式，從外部導(dǎo)入到微流體單元中的氣泡以及主要是在基底的電化學(xué)再生和相應(yīng)的清潔情況下產(chǎn)生的氣泡，可以非常簡(jiǎn)單地向回移出微流體單元，并且降低了它們?cè)诰哂懈髮?dǎo)管橫截面的區(qū)域中附著于導(dǎo)管壁的風(fēng)險(xiǎn)。測(cè)量導(dǎo)管30在接合部18處與附加導(dǎo)管區(qū)段20匯合，用于確保參比電極2和2’的參比電勢(shì)穩(wěn)定的試劑例如3M的氯化鉀溶液可以經(jīng)由供應(yīng)連接件120被進(jìn)料通過所述導(dǎo)管區(qū)段20。被引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30并通過導(dǎo)管區(qū)段20的液體流向?qū)Ч芙雍喜?8，然后在受到外部電路和液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和閥的控制時(shí)，通過導(dǎo)管區(qū)段30’和排出連接件130，進(jìn)入連接在下游的廢液容器(未示出)。通過這種方式，有效防止了氯離子穿透到測(cè)量導(dǎo)管30的區(qū)域中。
與在較早描述的實(shí)例中相同，參比電極2和相應(yīng)的2’經(jīng)由無隔膜的電解質(zhì)橋與基底3和對(duì)電極4以及4’電接觸。此外，在基底的電化學(xué)再生和相應(yīng)的清潔期間產(chǎn)生的氣泡，當(dāng)氣泡位于緊鄰導(dǎo)管接合部18之前的測(cè)量導(dǎo)管30的末端處時(shí)，僅僅瞬時(shí)地中斷參比電極2、2’與被連接作為工作電極的基底3和對(duì)電極4，4’之間的這種電接觸。然而，由于優(yōu)選至少有時(shí)施加的通過測(cè)量導(dǎo)管30的體積流量和同樣優(yōu)選至少有時(shí)施加的通過導(dǎo)管區(qū)段20的體積流量引起的氣泡被快速導(dǎo)流到導(dǎo)管區(qū)段30’中，因此參比電極與工作電極和相應(yīng)的對(duì)電極之間的電接觸的這種中斷僅僅持續(xù)短時(shí)間，并且還可以例如使用電子輔助裝置進(jìn)行檢測(cè)和補(bǔ)償。
圖5a)至c)的微流體單元示出了測(cè)量導(dǎo)管、測(cè)量區(qū)、基底與對(duì)電極之間的幾何關(guān)系。測(cè)量導(dǎo)管30是微流體系統(tǒng)中的一個(gè)區(qū)域，其中，在將用于構(gòu)建傳感器基質(zhì)所需的試劑引導(dǎo)通過的情形中，生物分析儀的傳感器基質(zhì)以總是相同并可重復(fù)的方式被建造在其中布置的基底上。在圖5a)至c)的微流體單元中，導(dǎo)管區(qū)域30延伸至緊鄰導(dǎo)管接合部18之前的基底末端。此外，在導(dǎo)管接合部11與12之間的導(dǎo)管區(qū)域中以及在旁路的導(dǎo)管區(qū)域40中，試劑和相應(yīng)的試劑溶液通過這些導(dǎo)管區(qū)域的初步流動(dòng)，引起傳感器基質(zhì)的構(gòu)建。然而，這可能在其組成和密度上發(fā)生變化，或者在氣泡通過后可能甚至部分或完全沒有功能。在圖5中示出的實(shí)例中，除了測(cè)量導(dǎo)管之外，基底和對(duì)電極還另外覆蓋導(dǎo)管區(qū)10、10’和40以及導(dǎo)管接合部11和12。在這里，其他幾何形狀也是可能的。對(duì)于本發(fā)明的微流體單元的操作來說，必需的是基底應(yīng)該至少部分存在于至少測(cè)量區(qū)中。然而，含有基底的測(cè)量導(dǎo)管還可以另外延伸到被信號(hào)轉(zhuǎn)換器記錄的區(qū)域7之外，所述基底在其上以可重復(fù)的方式構(gòu)建有完整的傳感器基質(zhì)。這種情況的一個(gè)實(shí)例是，用例如可以被布置在微流體單元的兩側(cè)并在緊鄰導(dǎo)管接合部18之前的導(dǎo)管區(qū)段30的末端處測(cè)定透射率的用于測(cè)量透射率的光學(xué)裝置，代替圖5a)至c)中示出的微流體單元的實(shí)例中用于記錄由酶標(biāo)記物引起的化學(xué)發(fā)光信號(hào)的光電二極管。在使用發(fā)色底物代替化學(xué)發(fā)光酶底物的情形中，使用導(dǎo)管區(qū)段30的被基底覆蓋的整個(gè)區(qū)域作為測(cè)量區(qū)，而不再只使用光電二極管的記錄區(qū)域中的區(qū)域作為測(cè)量區(qū)，這是由于在被引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管30并在連接在測(cè)量導(dǎo)管之后的信號(hào)轉(zhuǎn)換器的幫助下進(jìn)行檢查的酶底物溶液的透射率發(fā)生變化的情況下，該整個(gè)區(qū)域被用于獲得測(cè)量信號(hào)。
被連接作為工作電極的基底3和對(duì)電極4、4’相對(duì)于微流體管道進(jìn)行布置，使得導(dǎo)管區(qū)段10、10’、30和40以及導(dǎo)管接合部11和12被它們液密性覆蓋。通過這種方式，確保了在這些區(qū)域中通過電化學(xué)再生和相應(yīng)的清潔進(jìn)行基底表面的完全清潔。通過所有導(dǎo)管區(qū)域中各處的基底與對(duì)電極之間的近似相等的隔開，基底表面的清潔同樣在所有導(dǎo)管區(qū)域中各處基本上相等，并且流過基底表面的電流密度的分布沒有顯著差異。這是有利的，因?yàn)橛纱嗽诮o定情況下由于再生或清潔條件造成的基底的表面釋放，同等地影響所有區(qū)域、特別是測(cè)量導(dǎo)管中的區(qū)域，并因此能夠進(jìn)行頻繁的再生并由此利用生物分析儀頻繁地現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)行測(cè)量，并伴有恒定的高質(zhì)量測(cè)量結(jié)果。正如上面已經(jīng)描述的，對(duì)電極4和4’也可以用作用于構(gòu)建傳感器基質(zhì)的另一個(gè)基底。在這樣的情況下，對(duì)電極優(yōu)選由與基底3相同的材料構(gòu)成，因此在圖示的實(shí)例中由鉬構(gòu)成。然后在執(zhí)行步驟i至iii期間，在該另一個(gè)基底上優(yōu)選進(jìn)行與在微流體管道中相對(duì)放置的基底3的區(qū)域上基本上相同的過程。
圖6示出了微流體單元1000形式的另一種實(shí)施方式。在這樣的情況下，使用導(dǎo)電的微流體小管和相應(yīng)的絲作為基底3和對(duì)電極4。因此，基底3由例如小的金管構(gòu)成，對(duì)電極4由與基底3共軸布置的金絲構(gòu)成。這種類型的實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)在于利用相應(yīng)的支架1001、1001’可實(shí)現(xiàn)這些小管的簡(jiǎn)單的電和微流體可連接性。在這樣的情況下，小管3用作基底，絲4用作對(duì)電極并同樣作為另一個(gè)基底。顛倒的功能性也代表了另一種選擇方案?；?與對(duì)電極4的共軸布置允許高電流密度通過基底與對(duì)電極之間的小的間隔，這使得使用壽命延長(zhǎng)，并且在電再生和相應(yīng)的清潔的情況下，基底和/或?qū)﹄姌O的表面僅僅輕度移除。通過利用微流體軟管和小管進(jìn)行相應(yīng)的連接，也可以實(shí)施更復(fù)雜的微流體單元，其不被或僅僅被部分構(gòu)建為微流體芯片。
在基底3的電勢(shì)在最大值與最小值之間移動(dòng)的一些循環(huán)后，基底3被基本上完全清潔。然后，可以以上述方式形成傳感器基質(zhì)的更新的制備物，以便隨后用于重新測(cè)量。通過這種方式，在每種情況下可以使用新制備的傳感器基質(zhì)執(zhí)行至少50個(gè)或甚至100至200個(gè)測(cè)量。
由于傳感器基質(zhì)被定期完全重新制備，因此也可以執(zhí)行各種被分析物的順序測(cè)量，其中在每種情況下，接著制備特別適用于相應(yīng)的待測(cè)定被分析物的具有某種受體的傳感器基質(zhì)。例如，在順序制備中，在每種情況下對(duì)于當(dāng)前待檢測(cè)的被分析物或?qū)τ谙鄳?yīng)地用于被分析物檢測(cè)的靶分子來說，不同的、優(yōu)選選擇性且特異性結(jié)合的受體可以被結(jié)合在結(jié)合分子R200上。
在微流體系統(tǒng)的可選和優(yōu)選構(gòu)造中，對(duì)電極和基底可以被布置在同一個(gè)導(dǎo)管中，并放置成彼此相對(duì)。在這樣的情況下，參比電極被布置在經(jīng)由接合部與測(cè)量導(dǎo)管區(qū)段相連的導(dǎo)管中，使得它如圖4b中所示，在電化學(xué)清潔期間經(jīng)由無隔膜的電解質(zhì)橋與基底導(dǎo)電連接。在上述用于制備傳感器基質(zhì)的方法的情形中，當(dāng)基底和對(duì)電極被布置在測(cè)量導(dǎo)管中彼此相對(duì)放置時(shí)，傳感器基質(zhì)被構(gòu)建在基底以及對(duì)電極兩者上，使得可以使用兩個(gè)傳感器基質(zhì)來產(chǎn)生測(cè)量信號(hào)。在這樣的情況下，基底可以例如對(duì)測(cè)量輻射透明，使得例如在對(duì)電極和基底上產(chǎn)生的發(fā)光輻射透射通過基底，并可以作為測(cè)量信號(hào)被布置在基底后方的光電二極管記錄到。
對(duì)用于在工業(yè)過程中監(jiān)測(cè)(定量)被分析物濃度的生物分析儀的重要要求是，在使用連續(xù)插入的再生的傳感器基質(zhì)進(jìn)行順序測(cè)量的情況下，由生物分析儀輸出的測(cè)量信號(hào)的可重復(fù)性。尤其是，必須確保生物分析儀在順序測(cè)量的情況下，在被分析物濃度保持相等的情況下，事實(shí)上輸出相同信號(hào)強(qiáng)度的測(cè)量信號(hào)，其中在所述順序測(cè)量之間，在每種情況下執(zhí)行傳感器基質(zhì)的新制備。
為了使用這里描述的方法確保這一點(diǎn)，傳感器基質(zhì)的制備被執(zhí)行成使得導(dǎo)電表面區(qū)段3上的結(jié)合分子R200的層的覆蓋度為如上所限定的至少80%。
最優(yōu)情況下，在受體在一個(gè)或多個(gè)制備步驟中被結(jié)合在結(jié)合層上的情形中，在第二制備步驟以及在給定情況下附加制備步驟的情況下，第二制備溶液以及在給定情況下其他制備溶液被引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管的時(shí)間長(zhǎng)度也被選擇成使得在每種情況下獲得如上所限定的80%的覆蓋度。
如圖la)和b)中所示，傳感器基質(zhì)的層結(jié)構(gòu)以及在給定情況下帶有標(biāo)記物的分子在被分析物上或與被分析物競(jìng)爭(zhēng)傳感器基質(zhì)的結(jié)合位置的靶分子上的直接或間接結(jié)合，允許以簡(jiǎn)單的方式將從實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用已知的用于單次使用測(cè)定的方法技術(shù)轉(zhuǎn)變成可以利用生物分析儀重復(fù)自動(dòng)執(zhí)行的方法。在這里，作為其實(shí)例描述了將用于單次使用的實(shí)驗(yàn)室實(shí)施的免疫測(cè)定法轉(zhuǎn)移到用于過程測(cè)量技術(shù)的自動(dòng)工作的生物分析儀:在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定中，通過將針對(duì)牛冠狀病毒(BCV)的抗體吸附在微量滴定板的疏水基底表面上，來產(chǎn)生受體層。然后，施加需要檢查BCV組分的測(cè)量樣品并隨后漂洗，以便移除未結(jié)合在受體上的BCV。隨后，施加針對(duì)BCV的另一個(gè)表位的第二抗體，重新漂洗，然后施加辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的第三抗體的偶聯(lián)物。該第三抗體結(jié)合在第二抗體上，使得第二抗體被HRP間接標(biāo)記。在重復(fù)漂洗后，隨后通過添加發(fā)色底物2，2’-連氮基雙-(3-乙基-苯并噻唑啉)6-磺酸(ABTS)和過氧化氫并對(duì)該溶液的吸收進(jìn)行光度測(cè)定的最終步驟，進(jìn)行測(cè)量值的測(cè)定。
現(xiàn)在將描述用于將利用所描述的單次使用的親和生物測(cè)定法進(jìn)行的液體樣品的BCV含量測(cè)定，向利用生物分析儀進(jìn)行的液體樣品的BCV含量的自動(dòng)且可重復(fù)執(zhí)行的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定進(jìn)行轉(zhuǎn)變的方法。在第一步驟(步驟a)中，選擇用于構(gòu)建傳感器基質(zhì)的結(jié)合層的適合的結(jié)合結(jié)構(gòu)。由于用作受體R350的針對(duì)BCV的抗體(抗BCV抗體)涉及非生物素化的IgG類抗體，因此基于圖1b)的層序列硫醇-PEG-生物素-中性親和素-生物素-抗IgG抗體-抗BCV抗體是非常適合的，其中抗BCV抗體用作受體R350。作為可選測(cè)定方法(步驟b)，在使用HRP分子作為帶有標(biāo)記物的分子R500的情形中，除了發(fā)色ABTS反應(yīng)以及隨后的光度測(cè)定之外，還可以使用魯米諾與過氧化氫之間的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。這在自動(dòng)生物分析儀中具有只需要一個(gè)光電檢測(cè)器例如光電二極管作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器的優(yōu)點(diǎn)。
在附加步驟中，為自動(dòng)生物分析儀中所使用的用于液體管線的材料或用于與液體樣品或其他使用的試劑發(fā)生接觸的其他部分的材料選擇適合的阻斷試劑，以便減少組分的非特異性吸附。
在通過這種方式限定了結(jié)合層并選擇了可選測(cè)定方法之后，產(chǎn)生了選自幾種通用的標(biāo)準(zhǔn)變化形式并由下列物質(zhì)形成的傳感器基質(zhì)的結(jié)合層序列:
-親硫的基底(基底3)
-硫醇-PEG-生物素(第一結(jié)合分子R200，其具有生物素作為官能團(tuán)，用于經(jīng)由第二結(jié)合分子R310間接結(jié)合受體R350)
-中性親和素(結(jié)合在結(jié)合分子R200上的分子R300，并且第二結(jié)合分子R310結(jié)合在其上)
-生物素-抗IgG抗體(第二結(jié)合分子R310)。
為了檢測(cè)液體樣品中的BCV含量，在該結(jié)合層序列上隨后跟有從實(shí)驗(yàn)室方法可知的親和測(cè)定法的層序列:
-針對(duì)BCV的IgG類型的抗體(結(jié)合在第二結(jié)合分子上的受體R350)
-BCV (被分析物R400，其中占據(jù)密度依賴于液體樣品中被分析物的濃度)
-針對(duì)BCV的第二抗體(用于間接結(jié)合帶有標(biāo)記物的分子R500)
-針對(duì)第二抗體的HRP標(biāo)記的第三抗體(R500)，用于利用魯米諾/H2O2進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
在下面的步驟中，所有使用的組分必須檢查交叉反應(yīng)性(步驟C)，以便由此排除測(cè)量信號(hào)的錯(cuò)誤。為此，例如，可以在每種情況下省略一個(gè)層來連續(xù)構(gòu)造受體層，并且在出現(xiàn)交叉反應(yīng)性的情況下，測(cè)定到的測(cè)量信號(hào)為明顯高于零的值。此外，各個(gè)層、優(yōu)選為主要結(jié)合層的密度，將通過共同結(jié)合相對(duì)于后面的層未官能化或無反應(yīng)性的其他組分來設(shè)定。
如果自動(dòng)生物分析儀具有用于液體運(yùn)輸?shù)奈⒘黧w管道系統(tǒng)、包括在其中形成傳感器基質(zhì)并執(zhí)行被分析物檢測(cè)的測(cè)量導(dǎo)管，則還應(yīng)該確定含有用于形成傳感器基質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)的制備溶液的適合的體積流量、濃度以及各種制備溶液和在給定情況下漂洗溶液被引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管的時(shí)間長(zhǎng)度(步驟d)。在這樣的情況下，優(yōu)選選擇高的濃度、同樣高的制備溶液體積流量和長(zhǎng)的時(shí)間長(zhǎng)度。通過這種方式，確保傳感器基質(zhì)的各種組分在對(duì)應(yīng)于該濃度下的化學(xué)平衡的給定條件下形成的層在每種情況下幾乎完全覆蓋位于其下方的層。在這樣的情況下，待檢測(cè)的每種組分相對(duì)于其在制備溶液中的濃度、體積流速和制備溶液被引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管的時(shí)間長(zhǎng)度是可變的。在每種情況下，向在所選的條件下實(shí)施的傳感器基質(zhì)供應(yīng)被分析物濃度已知的測(cè)量溶液，并利用根據(jù)生物分析儀的信號(hào)轉(zhuǎn)換器所選擇的檢測(cè)方法來記錄測(cè)量信號(hào)。從如此獲得的測(cè)量信號(hào)產(chǎn)生矩陣，從所述矩陣可以在每種情況下為傳感器基質(zhì)的每個(gè)層確定最適的方法參數(shù)、濃度、體積流速和引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管的時(shí)間長(zhǎng)度。因此，例如，可以選擇下述組合，即所述組合能夠使制備溶液引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管的時(shí)間盡可能短，并且盡管如此，能夠產(chǎn)生在制備溶液引導(dǎo)通過的持續(xù)時(shí)間明顯長(zhǎng)得多的情況下的測(cè)量信號(hào)的95%的測(cè)量信號(hào)。通過這種系統(tǒng)性程序，可以快速實(shí)現(xiàn)所述方法參數(shù)與通過系統(tǒng)的微流體流動(dòng)的匹配。
在附加步驟中，以類似方式確定用于執(zhí)行基底的再生和相應(yīng)的清潔的方法參數(shù)(步驟e)。為此，首先確定通過化學(xué)手段進(jìn)行清潔、例如通過將清潔溶液引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管是否足以基本上完全清潔基底，或者是否應(yīng)該執(zhí)行電化學(xué)清潔，在執(zhí)行電化學(xué)清潔的情況下，除了將清潔溶液引導(dǎo)通過測(cè)量導(dǎo)管之外，還使基底相對(duì)于對(duì)電極以及相應(yīng)的參比電極的電勢(shì)發(fā)生變化，使得在給定情況下，在通過清潔溶液的電解形成的氫和相應(yīng)的氧的支持下，發(fā)生傳感器基質(zhì)和在給定情況下結(jié)合在其上的分子的至少部分分解。使用一系列試驗(yàn)，可以改變方法參數(shù)、清潔溶液的濃度/組成、基底的電勢(shì)、相應(yīng)的在基底與對(duì)電極之間流動(dòng)的電流的電流水平、引導(dǎo)清潔溶液通過測(cè)量導(dǎo)管的時(shí)間長(zhǎng)度、在給定情況下引導(dǎo)輔助液體通過測(cè)量導(dǎo)管的時(shí)間長(zhǎng)度、基底電勢(shì)的曲線、相應(yīng)的在基底與對(duì)電極之間流動(dòng)的電流的曲線，并且根據(jù)表示基底清潔程度的測(cè)量信號(hào)可以確定再生的成功。從將清潔成功作為不同過程參數(shù)的函數(shù)作圖而得到的相應(yīng)的矩陣，可以確定最佳的方法參數(shù)。
在需要時(shí)使用來自于相應(yīng)應(yīng)用領(lǐng)域的樣品執(zhí)行測(cè)量，以便在給定情況下鑒定(步驟f)從特定測(cè)量介質(zhì)得到的矩陣效果。如果發(fā)生這種情況，可以確定用于特定情況的適合的對(duì)策，例如將樣品稀釋或在隨后的方法校準(zhǔn)中將測(cè)量值的偏差考慮在內(nèi)。在轉(zhuǎn)變?yōu)槔蒙锓治鰞x的自動(dòng)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定的親和測(cè)定法已被校準(zhǔn)后，進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證(步驟g)。這包括檢查制備溶液和其他使用的試劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
上述方法的優(yōu)點(diǎn)在于，在例如生物技術(shù)生產(chǎn)廠中用于質(zhì)量控制、在通常的實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐中使用的例如作為單次使用的實(shí)驗(yàn)室方法執(zhí)行的親和測(cè)定法，可以被有效地轉(zhuǎn)移到自動(dòng)生物分析儀。因此，例如，能夠完全自動(dòng)、重復(fù)并在線地分析物質(zhì)例如蛋白質(zhì)或如上述實(shí)例中所述的疫苗的含量。使用一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)層系統(tǒng)來結(jié)合幾乎任何受體和/或使用一種或幾種帶有標(biāo)記物的分子，提供了一種平臺(tái)或構(gòu)建試劑盒、溶液，可以通過所描述的方式使用相對(duì)少的努力將已知的實(shí)驗(yàn)室方法轉(zhuǎn)移到所述平臺(tái)或構(gòu)建試劑盒、溶液。
權(quán)利要求
1.利用生物分析儀自動(dòng)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定液體樣品的被分析物含量的方法，所述生物分析儀包含具有至少一個(gè)測(cè)量導(dǎo)管的微流體系統(tǒng)以及引導(dǎo)一種或多種液體通過所述測(cè)量導(dǎo)管的裝置，其中所述測(cè)量導(dǎo)管具有至少一個(gè)基底， 所述方法包括用于至少在測(cè)量區(qū)內(nèi)做測(cè)量的如下所述的重復(fù)可執(zhí)行的步驟序列: (i)制備具有多個(gè)受體的傳感器基質(zhì)，所述受體一優(yōu)選選擇性且特異性地、特別是因親和相互作用一結(jié)合所述被分析物和/或其他靶分子，或引起所述被分析物或所述其他靶分子的化學(xué)轉(zhuǎn)化， 所述制備包括引導(dǎo)至少第一化學(xué)物質(zhì)的制備溶液通過所述測(cè)量導(dǎo)管的步驟，所述第一化學(xué)物質(zhì)包括至少一個(gè)結(jié)合在所述基底上的官能團(tuán)以及至少一個(gè)其他官能團(tuán)，其中多個(gè)所述第一化學(xué)物質(zhì)經(jīng)由結(jié)合在所述基底上的官能團(tuán)而結(jié)合在所述基底上， 其中結(jié)合在所述基底上的多個(gè)所述第一化學(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)用作受體或用于隨后結(jié)合受體； (ii)引導(dǎo)所述液體樣品或通過用至少一種試劑處理所述液體樣品而獲得的待測(cè)量液體通過所述測(cè)量導(dǎo)管，其中包含在所述液體樣品或所述待測(cè)量液體中的被分析物和/或包含在所述液體樣品或所述待測(cè)量液體中的其他靶分子一優(yōu)選選擇性且特異性地一結(jié)合在所述受體上或被所述受體化學(xué)轉(zhuǎn)化， 并測(cè)定與所述受體所結(jié)合或轉(zhuǎn)化的靶分子的量相關(guān)或與所述受體所結(jié)合或轉(zhuǎn)化的被分析物的量相關(guān)的測(cè)量變量，并從所述測(cè)量變量推導(dǎo)出所述液體樣品的被分析物含量；以及 (iii)再生一特別是清潔一所述至少一個(gè)基底，其中所述傳感器基質(zhì)以及在給定情況下與所述傳感器基質(zhì)結(jié)合的分子一特別是被分析物分子、其他靶分子或其他分子，從所述基底釋放和/或 至少被部分分解。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一個(gè)基底是導(dǎo)電基底。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述基底的再生一特別是清潔，通過在所述基底和經(jīng)由電解質(zhì)與所述基底導(dǎo)電接觸的對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)來進(jìn)行，使得清潔所述基底——特別是基本上不依賴于所述基底的當(dāng)前占據(jù)情況。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中在所述基底和所述對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)期間，通過電解在所述基底和/或所述對(duì)電極上形成氫和/或氧。
5.如權(quán)利要求2至4之一所述的方法，其中所述對(duì)電極實(shí)施在所述測(cè)量導(dǎo)管中一特別是與所述基底相對(duì)或與所述基底共軸放置——作為另一基底，在該另一基底上結(jié)合有結(jié)合在所述基底上的所述第一化學(xué)物質(zhì)的官能團(tuán)。
6.如權(quán)利要求1至5之一所述的方法，其中所述至少一個(gè)基底包含親硫的導(dǎo)電基底，并且結(jié)合在所述基底上的所述第一化學(xué)物質(zhì)的官能團(tuán)包含硫醇或二硫化物基團(tuán)，其中，通過所述硫醇或二硫化物基團(tuán)的硫原子結(jié)合，在所述基底上形成所述第一化學(xué)物質(zhì)的層。
7.如權(quán)利要求3至6之一所述的方法，其中在所述電流流動(dòng)期間，所述基底與所述對(duì)電極之間的導(dǎo)電接觸由電解質(zhì)建立，所述電解質(zhì)含有濃度低于150mmol/l——優(yōu)選低于15mmol/l、更優(yōu)選低于1.5mmol/l-的氰離子或鹵素離子。
8.如權(quán)利要求3至7之一所述的方法，其中在所述基底與所述對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)期間，參照經(jīng)由電解質(zhì)——特別是利用電解質(zhì)橋——與所述基底導(dǎo)電接觸的參比電極的參比電勢(shì)，設(shè)定一特別是控制一所述基底的電勢(shì)。
9.如權(quán)利要求3至8之一所述的方法， 其中，所述基底的電勢(shì)-優(yōu)選相對(duì)于所述參比電勢(shì)-在最小值與最大值之間連續(xù)或不連續(xù)地變化——特別是線性地變化，使得通過電化學(xué)清潔來重新清潔所述基底，和/或 其中，在所述基底與所述對(duì)電極之間產(chǎn)生的電流流動(dòng)的電流水平在最小值與最大值之間連續(xù)或不連續(xù)地變化，使得通過電化學(xué)清潔來重新清潔所述基底。
10.如權(quán)利要求3至9之一所述的方法，其中，為了支持清潔效力，在所述基底與所述對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)之前、期間或之后，把一種或多種清潔液體和/或一種或多種輔助液體引導(dǎo)通過所述測(cè)量導(dǎo)管。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，在所述基底與所述對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)期間，把酸性磷酸鹽緩沖溶液作為輔助液體引導(dǎo)通過所述測(cè)量導(dǎo)管，在給定情況下，酸性磷酸鹽緩沖溶液另外含有過氧化物。
12.如權(quán)利要求1至11之一所述的方法， 其中在現(xiàn)場(chǎng)重復(fù)并直接一個(gè)接一個(gè)地執(zhí)行步驟(i)_ (iii)的序列，特別是執(zhí)行至少50次，優(yōu)選為至少150次。
13.如權(quán)利要求1至12之一所述的方法，其中，在所述再生期間或之后，檢查所述至少一個(gè)基底上所述傳感器基質(zhì)的殘留組分——特別是利用電化學(xué)測(cè)量方法例如循環(huán)伏安法或阻抗譜法、光學(xué)測(cè)量方法例如橢圓偏光法、或吸附試驗(yàn)或者通過在所述再生期間測(cè)量電流水平進(jìn)行檢查。
14.用于執(zhí)行如權(quán)利要求1至13之一所述的方法的生物分析儀，其包含具有至少一個(gè)測(cè)量導(dǎo)管的微流體系統(tǒng)和用于將液體引導(dǎo)通過所述測(cè)量導(dǎo)管的裝置， 其中，所述測(cè)量導(dǎo)管包含至少一個(gè)基底，在所述至少一個(gè)基底上，至少在測(cè)量區(qū)內(nèi)、至少有時(shí)布置有具有多個(gè)受體的傳感器基質(zhì)，所述受體——優(yōu)選選擇性且特異性地——結(jié)合或化學(xué)轉(zhuǎn)化液體樣品或通過用至少一種試劑處理所述液體樣品而獲得的待測(cè)量液體中存在的靶分子或被分析物， 其中，所述生物分析儀包含至少一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)換器，該信號(hào)轉(zhuǎn)換器根據(jù)結(jié)合在所述受體上或被所述受體轉(zhuǎn)化的被分析物的量或者根據(jù)結(jié)合在所述受體上的靶分子的量或被轉(zhuǎn)化的革巴分子的量而輸出測(cè)量信號(hào)。
15.如權(quán)利要求14所 述的生物分析儀，其中所述基底是導(dǎo)電的，對(duì)電極被布置在所述微流體系統(tǒng)內(nèi)并至少在所述再生——特別是清潔、靜置期間與所述基底導(dǎo)電接觸，并且其中所述生物分析儀還包括在所述基底與所述對(duì)電極之間產(chǎn)生電流流動(dòng)的裝置。
16.如權(quán)利要求14或15所述的生物分析儀，其中所述對(duì)電極被布置在所述測(cè)量導(dǎo)管內(nèi)，與所述第一基底相對(duì)放置或與所述基底共軸延伸，并優(yōu)選用作另一個(gè)基底。
17.如權(quán)利要求15或16所述的生物分析儀，其中所述基底和所述對(duì)電極與流過所述測(cè)量導(dǎo)管的電解質(zhì)的流動(dòng)方向相關(guān)地布置，使得由于所述基底與所述對(duì)電極之間的電流流動(dòng)而出現(xiàn)在所述電解質(zhì)中的氣泡被導(dǎo)流而使所述氣泡基本上不影響所述電流流動(dòng)。
18.如權(quán)利要求15至17之一所述的生物分析儀，其中所述生物分析儀還包括參比電極一一特別形成在所述微流體系統(tǒng)內(nèi)，所述參比電極至少在所述基底的再生期間一特別是清潔期間，經(jīng)由電解質(zhì)橋——特別是無隔膜的電解質(zhì)橋——與所述至少一個(gè)基底導(dǎo)電連接。
19.如權(quán)利要求14至18之一所述的生物分析儀，其中所述微流體系統(tǒng)包括: 第一部件，其具有表面，其中所述測(cè)量導(dǎo)管以及在給定情況下其他導(dǎo)管——特別是經(jīng)由接合部與所述測(cè)量導(dǎo)管相連的用于液體運(yùn)輸?shù)膶?dǎo)管——被實(shí)施成凹陷部， 其中至少第二部件與所述第一部件相連，以覆蓋所述凹陷部并將所述凹陷部液密地密封。
20.如權(quán)利要求19所述的生物分析儀，其中所述基底、所述對(duì)電極以及在給定情況下所述參比電極被形成為 所述第二部件上的可導(dǎo)電連接的膜，特別是金屬涂層。
21.如權(quán)利要求14至20之一所述的生物分析儀，其中所述微流體系統(tǒng)包含: 第一部件一特別是平面平行的第一板，以及與所述第一部件隔開布置的第二部件一特別是平面平行的第二板，其中所述第一部件和第二部件經(jīng)由布置在所述第一部件與第二部件之間的一個(gè)或多個(gè)間隔元件——特別是一個(gè)或多個(gè)中間板——而彼此相連，其中所述一個(gè)或多個(gè)間隔元件具有中間空間和/或穿孔，所述中間空間和/或穿孔形成了在所述第一部件與第二部件之間延伸的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，包括所述測(cè)量導(dǎo)管以及在給定情況下與所述測(cè)量導(dǎo)管相連的用于液體輸送的附加導(dǎo)管。
22.如權(quán)利要求21所述的生物分析儀，其中所述基底、所述對(duì)電極以及在給定情況下所述參比電極是所述第一部件上或所述第二部件上的可導(dǎo)電連接的膜的形式——特別是金屬涂層。
23.如權(quán)利要求14至22之一所述的生物分析儀，其中所述基底透射至少10%的在300nm和900nm之間的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用生物分析儀自動(dòng)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定液體樣品的被分析物含量的方法，所述生物分析儀包含具有至少一個(gè)測(cè)量導(dǎo)管的微流體系統(tǒng)以及引導(dǎo)一種或多種液體通過所述測(cè)量導(dǎo)管的裝置，其中所述測(cè)量導(dǎo)管具有至少一個(gè)基底，所述方法包括用于至少在測(cè)量區(qū)內(nèi)執(zhí)行測(cè)量的如下所述的可重復(fù)執(zhí)行的步驟序列(i)制備具有多個(gè)受體的傳感器基質(zhì)，所述受體優(yōu)選選擇性且特異性地、特別是因親和相互作用而結(jié)合所述被分析物和/或其他靶分子，或引起所述被分析物或所述其他靶分子的化學(xué)轉(zhuǎn)化，所述制備包括引導(dǎo)至少第一化學(xué)物質(zhì)的制備溶液通過所述測(cè)量導(dǎo)管的步驟，所述第一化學(xué)物質(zhì)包括至少一個(gè)結(jié)合在所述基底上的官能團(tuán)以及至少一個(gè)其他官能團(tuán)，其中多個(gè)所述第一化學(xué)物質(zhì)經(jīng)由結(jié)合在所述基底上的官能團(tuán)結(jié)合在所述基底上，其中結(jié)合在所述基底上的多個(gè)所述第一化學(xué)物質(zhì)的其他官能團(tuán)用作受體或用于隨后結(jié)合受體；(ii)引導(dǎo)所述液體樣品或通過用至少一種試劑處理所述液體樣品而獲得的待測(cè)量液體通過所述測(cè)量導(dǎo)管，其中包含在所述液體樣品或所述待測(cè)量液體中的被分析物和/或包含在所述液體樣品或所述待測(cè)量液體中的其他靶分子，優(yōu)選選擇性且特異性地結(jié)合在所述受體上，或被所述受體化學(xué)轉(zhuǎn)化，并測(cè)定與被所述受體結(jié)合或轉(zhuǎn)化的靶分子的量或與被所述受體結(jié)合或轉(zhuǎn)化的被分析物的量相關(guān)的測(cè)量變量，并從所述測(cè)量變量推導(dǎo)出所述液體樣品的被分析物含量；以及(iii)再生、特別是清潔所述至少一個(gè)基底，其中所述傳感器基質(zhì)以及在給定情況下與所述傳感器基質(zhì)結(jié)合的分子特別是被分析物分子、其他靶分子或其他分子，從所述基底釋放和/或至少被部分分解。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103189746SQ201180052501
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者邁克爾·漢克, 安哥拉·奧比施, 阿克塞爾·菲庫斯 申請(qǐng)人:恩德萊斯和豪瑟爾測(cè)量及調(diào)節(jié)技術(shù)分析儀表兩合公司